3. Material und Methoden
3.4. Techniken für das Arbeiten mit DNA
3.4.4. DNA-Transfertechniken
3.4.4.4. Southern-Blot
Lösungen und Puffer für den Southern-Blot
Depurinierungslösung
HCl (37%) 16,66 ml
H2O ad 800 ml
autoklavieren
Denaturierungslösung
NaCl 70,13 g
NaOH 16,0 g
H2O ad 800 ml
autoklavieren
Neutralisierungslösung (pH 7,5)
Tris 48,46 g
NaCl 140,26 g
H2O ad 800 ml
pH-Wert mit konz. HCl einstellen, autoklavieren
Transferlösung = 20 x SSC (pH 7,0)
NaCl 140,26 g
Na3-citrat 70,58 g
H2O ad 800 ml
pH-Wert mit HCl einstellen, autoklavieren
10% Blocking Stammlösung
Blocking Reagent (Roche Cat. No. 1 096 176) 5 g
Maleinsäurepuffer ad 50 ml
In der Mikrowelle kurz erhitzen, bis es beginnt aufzukochen. Anschließend autoklavieren und Lagerung in 10 ml Aliquots bei -20°C.
Maleinsäurepuffer (pH 7,5)
Maleinsäure 9,29 g
NaCl 7,01 g
NaOH 5,6 g
H2O ad 800 ml
pH-Wert mit konz. NaOH einstellen, autoklavieren
N-Laurylsarcosin-Lösung
N-Laurylsarcosin 10% (w/v)
H2O ad 10 ml
autoklavieren
Prähybridisierungslösung = Hybridisierungslösung
20x SSC 12,5 ml
10% Blocking Stammlösung 5,0 ml 10% N-Laurylsarcosin 0,5 ml
10% SDS 0,1 ml
H2O ad 50 ml
Lösungen der Reihe nach steril vereinigen und bei 60°C lösen, anschließend bei –20°C lagern.
Puffer 1
20x SSC 80 ml
10% SDS 8 ml
H2O ad 800 ml
H2O autoklavieren und anschließend steril vereinigen.
Puffer 2
20x SSC 4 ml
10% SDS 8 ml
H2O ad 800 ml
H2O autoklavieren und anschließend steril vereinigen.
Puffer 3
10% Blocking Stammlösung 5 ml
Maleinsäurepuffer 45 ml
Puffer frisch ansetzen und nicht autoklavieren.
Waschpuffer
Tween 20 150 µl
Maleinsäurepuffer ad 50 ml
Puffer frisch ansetzen und nicht autoklavieren.
Detektionspuffer (pH 9,5)
Tris 9,69 g
NaCl 4,67 g
H2O ad 800 ml
pH-Wert mit konz. HCl einstellen, autoklavieren
Detektionslösung
NBT/BCIP Stock solution (Roche, Cat. No 11 681 451 001) 100 µl
Detektionspuffer ad 5 ml
Lösung frisch ansetzen und nicht autoklavieren.
In einem ersten Schritt wurde zunächst die Sonde für den Southern-Blot vorbereitet. Um vergleichend den Einbau des DIG darzustellen, wurde zunächst eine Test-PCR (3.7.1.) angesetzt, in welcher ein 10 mM dNTP-Mix eingesetzt wurde. In einer zweiten PCR, der Sonden-PCR (3.7.1.), wurde ein 5x DIG dNTP-Mix verwendet. Letzterer setzte sich zusammen aus 8,5 µl je 1 mM dNTP-Mix und 1,5 µl DIG DNA Labeling Mix (Roche, Cat. No. 11277 065 910). Bei der anschließenden Agarose-Gelelektrophorese (1,5% und 80 V) mußte aufgrund des DIG Einbaus in das PCR Produkt eine leicht höher laufende PCR Bande der Sonden PCR zu sehen sein. Die Sonde wurde aufgereinigt (3.4.2.6.), mit 100 µl H2O eluiert und bis zum Gebrauch bei –20°C gelagert.
Im zweiten Schritt wurden die Proben vorbereitet. Hierzu wurde chromosomale DNA mit geeigneten Restriktionsendonukleasen, welche eine klare Unterscheidung von Wildtyp und Konstrukten zuließen, geschnitten (3.4.3.1.). Die Überprüfung des vollständigen Verdaus erfolgte mittels Agarose-Gelelektrophorese. Im Anschluss daran wurden die Ansätze inaktiviert und bis zum Gebrauch bei –20°C gelagert.
Beim dritten Schritt, dem so genannten Blotten, wurde zunächst 0,8%ige Agarose in eine Harnischmacher Kammer zu einem etwa 0,5 cm hohem Gel gegossen. Die Beladung des Geles erfolgte jeweils rechts und links außen mit zwei Leerspuren. Als Marker diente ein DIG-gelabelter 1kb Ladder aus GeneRuler 1 kb Ladder und DIG 1 kb-Ladder (DNA Molecular Weight Marker DIG labeled III, Roche, Cat. No 11 218 603 910) im Verhältnis 1:9. Die Agarose-Gelelektrophorese wurde bei 80 V für 90 min durchgeführt. Anschließend wurde das Agarosegel in ein geeignetes Behältnis
überführt und für 10 min mit Depurinierungslösung überschichtet. Währendessen sollte der Marker gelb werden. Nach zwei kurzen Waschschritten mit H2O wurde das Agarosegel zweimal für je 15 min mit Denaturierungslösung überschichtet. Der Marker wurde bei diesem Schritt wieder blau. Es folgten erneut zwei kurze Waschschritte mit H2O und im Anschluss daran wurde das Agarosegel zweimal für je 15 min mit Neutralisierungslösung überschichtet. Nach einem abschließenden Waschschritt mit H2O wurde das Agarosegel in eine bereits vorbereitete Blot-Apparatur (Bio-Rad Vacuum Blotter Model 785) überführt. Zur Vorbereitung des Aufbaus wurde die Nylonmembran (Roche, Cat. No 11 417 240 001) und Whatman-Papier 1 cm breiter und länger als die verwendete Maske zugeschnitten, mit H2O angefeuchtet und die Blot-Apparatur laut Anweisung des Herstellers zusammengesetzt. Der DNA-Transfer erfolgte bei 7 Hg für 45 min. Das Fixieren der DNA auf die noch feuchte Membran wurde in einem Transilluminator für 2 min mit der DNA-Seite nach unten bei 302 nm durchgeführt.
Für den vierten Schritt, der Hybridisierung, wurde die getrocknete Membran anschließend luftblasenfrei mit der DNA-Seite nach innen in ein Hybridisierungsröhrchen überführt und mit Prähybridisierungslösung (20 ml/ 100 cm2) bei 68°C für 90 min in einem Hybridisierungsofen inkubiert. Parallel hierzu wurde die Sonde für 5 min bei 98°C denaturiert und anschließend sofort auf Eis gelagert. Zur eigentlichen Hybridisierung, welche für 16 Stunden bei 68°C erfolgte, wurde die Sonde direkt in die Prähybridisierungslösung im Hybridisierungsröhrchen gegeben.
Anschließend wurde die Hybridisierungslösung zum Waschen der Membran durch 50 ml Puffer 1 ersetzt und zweimal für je 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dieser wurde wiederum durch 50 ml auf 68°C vorgewärmten Puffer 2 ersetzt und es folgte eine Inkubation für zweimal 20 min bei 68°C.
Zur Detektion, dem fünften Schritt, wurde die Membran in ein geeignetes, zu schwenkendes Behältnis überführt, mit 50 ml Puffer 3 überschichtet und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Parallel hierzu wurden Anti Digoxigenin-AP Fab Fragmente (Roche, Cat. No 11 093 274 910) für 5 min bei 13000 U/min zentrifugiert und 5 µl des Überstandes direkt zum Puffer 3 gegeben. Es folgte eine weitere Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur. Zum Entfernen des ungebundenen Antikörpers wurde die Membran zweimal für je 20 min mit 50 ml Waschpuffer überschichtet. Nach einer 5 minütigen Inkubation mit 50 ml Detektionspuffer wurde die Membran in Folie
eingeschweißt und unter Zugabe der Detektionslösung (5 ml/ 100 cm2) lichtgeschützt für 30 min bzw. bis eine deutliche Farbreaktion zu erkennen war inkubiert. Das Abstoppen der Reaktion erfolgte durch waschen mit H2O. Die Membran wurde anschließend getrocknet und mit dem Transilluminator (GE Healthcare ImageQuant™ 400) dokumentiert.