3. Material und Methoden
3.7. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die PCR (polymerase chain reaction) dient als in vitro-Methode, welche es ermöglicht spezifische DNA-Fragmente aus einem komplexen DNA-Gemisch enzymatisch zu amplifizieren. Dafür sind Matrizen-DNA (Template), ein Oligonukleotid-Primerpaar, dNTP´s, sowie eine thermostabile DNA-Polymerase mit zugehörigem Puffer
notwendig. Im ersten Schritt der PCR, der Denaturierung, wird die doppelsträngige DNA durch Erhitzen in einzelsträngige DNA überführt. Durch Absenken der Temperatur können sich im zweiten Schritt, dem Annealing, zwei Oligonukleotid-Primer an die Matrizen-DNA anlagern. Die Oligonukleotid-Oligonukleotid-Primer wurden so ausgewählt, dass sie die zu amplifizierende Region flankieren. Bei der Elongation, dem dritten Schritt der PCR, werden die beiden Primer mit Hilfe einer thermostabilen Polymerase komplementär zur ursprünglichen doppelsträngigen DNA verlängert. Es wird zur Amplifikation eine bestimmte Anzahl an Zyklen durchgeführt, wodurch die von den Primern flankierte Region exponentiell akkumuliert wird.
In dieser Arbeit wurde die PCR zu unterschiedlichen Zwecken eingesetzt, neben der Herstellung von Sonden für den Southern-Blot, auch zur Herstellung von Deletionskonstrukten und zur Überprüfung einzelner Zwischenschritte der Erstellung von clean deletion - Mutanten. Außerdem erfolgte mittels PCR die Überprüfung auf DNA-Reste, ebenso wie die Überprüfung von RNA mittels vorangegangener ’Reverser Transkription’ und sie wurde zur Expressionsanalyse mittels real-time RT-PCR eingesetzt. Als Primer wurden, wenn nicht anders erwähnt, Oligonukleotide zwischen 20 bp und 22 bp und einer Schmelztemperatur zwischen 55°C und 60°C verwendet.
Nach der Amplifikation wurden die PCR-Produkte gelelektrophoretisch überprüft.
3.7.1. PCRs für den Southern-Blot
Diese PCRs dienten der Vorbereitung und Generierung der Sonden für den Southern-Blot. Es wurden Fragmente mit einer erwarteten Größe von bis zu 750 bp amplifiziert.
Verwendet wurde die Hot Start Phire™ DNA-Polymerase der Firma Finnzymes.
50 µl Test-PCR-Ansatz:
1 µl chromosomale DNA (100 ng/µl)
2,5 µl Primer A (10 µM)
2,5 µl Primer B (10 µM)
1 µl dNTP-Mix (10 mM)
10 µl 5x Phire-Puffer
1 µl Phire DNA-Polymerase 32 µl H2O
50 µl Sonden-PCR-Ansatz:
1 µl chromosomale DNA (100 ng/µl)
2,5 µl Primer A (10 µM)
2,5 µl Primer B (10 µM)
10 µl 5x DIG dNTP-Mix 10 µl 5x Phire-Puffer
1 µl Phire DNA-Polymerase 23 µl H2O
PCR-Programm:
LID = 110°C
1 T = 98°C 00:03:00 2 T = 98°C 00:00:10 3 T = 57°C 00:00:10 4 T = 72°C 00:00:40 5 GOTO 2 REPEAT 29x 6 T = 72°C 00:01:00
7 T = 8°C FOREVER
3.7.2. GeneSOEing-PCRs
Mit den folgenden PCRs wurden Deletionskonstrukte im Rahmen der Erstellung von clean deletion – Mutanten erzeugt. Es wurden Fragmente mit einer erwarteten Größe zwischen 700 bp und 1700 bp amplifiziert. Eingesetzt wurde die Hot Start Phire™
DNA-Polymerase der Firma Finnzymes.
Erstellung der Flanken
50 µl Ansatz:
1 µl chromosomale DNA (250 ng/µl) 2,5 µl Forward Primer Flanke A bzw. B (10 µM) 2,5 µl Reverse Primer Flanke A bzw. B (10 µM)
1 µl dNTP-Mix (10 mM)
10 µl 5x Phire-Puffer
1 µl Phire DNA-Polymerase 32 µl H2O
Fusion der Flanken
50 µl Ansatz:
1 µl Flanke A 1 µl Flanke B
2,5 µl Forward Primer Flanke A (10 µM) 2,5 µl Reverse Primer Flanke B (10 µM)
1 µl dNTP-Mix (10 mM)
10 µl 5x Phire-Puffer
1 µl Phire DNA-Polymerase 31 µl H2O
PCR-Programm:
LID = 110°C
1 T = 98°C 00:03:00 2 T = 98°C 00:00:10 3 T = 57°C 00:00:10 4 T = 72°C 00:00:40 5 GOTO 2 REPEAT 29x 6 T = 72°C 00:01:00
7 T = 8°C FOREVER
3.7.3. Kolonie-PCR
Zur Überprüfung von Transformaten im Rahmen der Erstellung von clean deletion - Mutanten wurden mit dieser PCR Fragmente mit einer erwarteten Größe von maximal 2000 bp amplifiziert. Anstelle der chromosomalen DNA wurde Koloniematerial eingesetzt und in 9,5 µl H2O resuspendiert. Die Lyse der Zellen fand durch eine verlängerte Vorabdenaturierung statt. Als Template für die mitgeführte Positivkontrolle diente Plasmid-DNA. Verwendet wurde die Taq DNA-Polymerase der Firma Qiagen.
20 µl Ansatz:
4 µl Primer A (5 µM) 4 µl Primer B (5 µM) 0,4 µl dNTP-Mix (10 mM) 2 µl 10x S-Puffer
0,1 µl Taq DNA-Polymerase (5 U/µl) 9,5 µl H2O
Programm:
LID = 110°C
1 T = 98°C 00:08:00 2 T = 96°C 00:00:30 3 T = 59°C 00:00:30 4 T = 72°C 00:02:30 5 GOTO 2 REPEAT 24x 6 T = 72°C 00:10:00 7 T = 8°C FOREVER
3.7.4. PCR zur Überprüfung auf DNA-Reste
Diese PCR wurde für die Amplifikation von Fragmenten mit einer erwarteten Größe zwischen 500 bp und maximal 1000 bp verwendet. Eingesetzt wurde die Taq DNA-Polymerase der Firma Qiagen.
20 µl Ansatz:
1 µl chromosomale DNA (500 ng/µl) 4 µl Primer A (5 µM) 4 µl Primer B (5 µM) 0,4 µl dNTP-Mix (10 mM) 2 µl 10x S-Puffer
0,1 µl Taq DNA-Polymerase (5 U/µl) 8,5 µl H2O (RNase frei)
Programm:
LID = 110°C
1 T = 96°C 00:02:00 2 T = 96°C 00:00:30 3 T = 59°C 00:00:30 4 T = 72°C 00:01:30 5 GOTO 2 REPEAT 24x 6 T = 72°C 00:10:00
7 T = 8°C FOREVER
3.7.5. Reverse Transkriptions-PCR
Bei einer Reversen Transkriptions-PCR wird mit Hilfe einer reversen Transkriptase RNA in cDNA (complementary DNA) umgeschrieben, welche anschließend mittels PCR amplifiziert werden kann. Die reverse Transkription und die anschließende PCR konnten mit dem in dieser Arbeit verwendeten QIAGEN® OneStep RT-PCR Kit (Cat no. 210210) in einem Schritt durchgeführt werden.
25 µl Ansatz:
500 ng Template RNA
4 µl Primer A (5 µM) 4 µl Primer B (5 µM)
1 µl dNTP-Mix (10 mM)
5 µl 5x ’OneStep RT-PCR Puffer’
1 µl ’OneStep RT-PCR Enzyme Mix’
ad 25µl H2O (RNase frei)
Programm:
LID = 110°C
1 T = 50°C 00:30:00 2 T = 96°C 00:15:00 3 T = 96°C 00:00:30 4 T = 59°C 00:00:30 5 T = 72°C 00:02:00 6 GOTO 3 REPEAT 24x 7 T = 72°C 00:10:00
8 T = 8°C FOREVER
3.7.6. Quantitative real-time RT-PCR
Die quantitative real-time RT-PCR ist eine Methode zur Quantifizierung von Nukleinsäuren und damit zur Expressionsanalyse einzelner Gene geeignet. Sie diente in dieser Arbeit zur Verifizierung der DNA-Microarray Ergebnisse. Ein entscheidendes Werkzeug der real-time RT-PCR sind unterschiedliche Farbstoffe oder Fluorophore, über deren Signal nach Bindung an die DNA die Kinetik der Polynukleotidsynthese per PCR ’in Echtzeit’ beobachtet werden kann. Die Markierung der DNA kann auf unterschiedlichen Wegen erfolgen: nach dem TaqMan Prinzip, mit molecular beacons, hybridization probes oder unter Einsatz eines Farbstoffes wie z.B. SYBR™ Green. Der entscheidende Vorteil von SYBR™ Green liegt darin, dass dieser Farbstoff unspezifisch in doppelsträngige DNA eingebaut wird, wohingegen für die anderen genannten Markierungsmöglichkeiten die Synthese spezifischer Sonden notwendig ist. Aus diesem
Grund wurde in dieser Arbeit SYBR™ Green verwendet.
Bei der quantitativen real-time RT-PCR wird über das Fluoreszenzsignal indirekt die Zunahme des PCR-Produktes gemessen. Zunächst findet in einer PCR-Reaktion eine annähernd exponentielle Vermehrung der DNA-Fragmente statt. Limitierende Faktoren wie z.B. die Abnahme der dNTP-Konzentration, verminderte Enzymaktivität und / oder die Anhäufung von Pyrophosphat verlangsamen jedoch die Produktbildung in der späten Phase der PCR-Reaktion. Die Quantifizierung bei der real-time RT-PCR erfolgt über den so genannten Ct-Wert, hierbei handelt es sich um die Zykluszahl, bei welcher sich das Fluoreszenzsignal einer Probe das erste Mal signifikant vom Hintergrund abhebt. Anhand einer Standardkurve können definierten Templatemengen Ct-Werte zugewiesen werden. Beim Vergleich zweier Versuchsbedingungen hinsichtlich der Expression eines ausgewählten Gens war eine solche Bestimmung der absoluten Templatemenge über eine Eichgerade nicht erforderlich. Nach folgender Formel kann allein über die Ct-Werte eines ausgewählten Gens unter beiden Versuchsbedingungen im Vergleich zu den Ct-Werten eines konstitutiven Gens, ebenfalls unter beiden Versuchsbedingungen, der Regulationsfaktor ermittelt werden:
Regulationsfaktor = 2-∆∆Ct
mit ∆∆Ct für Gen x = (Ctx – Ctkonstitutiv)Bedingung I – (Ctx – Ctkonstitutiv)Bedingung II
(Talaat et al., 2002)
Die Primer der ausgewählten Gene wurden mit einer Länge von 20-23 bp und einer Schmelztemperatur von etwa 60°C generiert und so gewählt, dass die Länge des erwarteten PCR-Produktes bei ca. 150 bp liegt. Sämtliche Arbeiten wurden unter RNase freien Bedingungen durchgeführt. In dieser Arbeit wurden der QuantiTect® SYBR® Green RT-PCR Master Mix (Qiagen, Hilden) und das ’iCycler iQTM real-time PCR Detection System’ der Firma Bio-Rad verwendet. Für den Ansatz der real-time RT-PCR wurde zuerst ein Mastermix aus dem QuantiTect Mastermix und dem Enzymmix für alle Proben hergestellt, welcher dann auf die zu testenden RNAs aufgeteilt wurde (Premix). Die Primer wurden in 96 well PCR Platten (Bio-Rad, iCycler iQ™ PCR Plates, Cat. No 2239441, PCR Tube Strips™ Flat Cap Strips, Cat. No TCS0803) vorgelegt und 20 µl Premix zugegeben. Auf diese Weise wurden mit größtmöglicher Wahrscheinlichkeit alle Reaktionskomponenten gleichmäßig auf die
einzelnen Ansätze verteilt.
25 µl Ansatz:
400 ng RNA
2,5 µl Primer A 5 µM 2,5 µl Primer B 5 µM
12,5 µl ’QuantiTect Mastermix’
0,5 µl Enzymmix ad 25 µl H2O (RNase frei)
I-Cycler Programm:
Cycle 1: (1x)
Step 1: 50.0°C 30 min (Reverse Transkription) Cycle 2: (1x)
Step 1: 95.0°C 15 min (Aktivierung der DNA-Polymerase) Cycle 3: (45 x)
Step 1: 94.0°C 15 sec (PCR) Step 2: 57.0°C 30 sec
Step 3: 72.0°C 30 sec Cycle 4: (1x)
Step 1: 55.0°C 1 min (Abschließende Elongation) Cycle 5: (80 x)
Step 1: 55.0°C 10 sec (Ermittlung des Schmelzpunktes
+0.5°C der PCR-Produkte)
Cycle 6: (1x)
Step 1: 4.0°C HOLD