Charakteristische Gene für B. licheniformis

Ein weiterer Ansatz zur Identifizierung charakteristischer Gene wurde mit der Methode des bidirektionalen BLASTs verfolgt. Zum Einsatz kam hierbei das bioinformatische Softwaretool BiBag (Wollherr et al., in Bearbeitung). In einem ersten Schritt werden bei dieser komparativen Methode die Aminosäuresequenzen aller proteinkodierenden Gene eines Query-Organismus mit den Aminosäuresequenzen einer beliebigen Anzahl von Subject-Organismen mittels BLASTP-Analyse (Altschul et al., 1990) miteinander verglichen. Im zweiten Schritt erfolgt die Umkehrung dieses BLASTs, d.h. die Aminosäuresequenzen der Subject-Organismen werden gegen die des Query-Organismus geblastet. Beim letzten Schritt dieser Methode werden die besten bidirektionalen Treffer zwischen Query- und Subject-Organismus herausgefiltert. Zur Validierung der Ergebnisse werden im Anschluss daran die Trefferpaare des bidirektionalen BLASTs mit Hilfe des Needleman-Wunsch-Algorithmus (Needleman &

Wunsch, 1970) aligned um globale Sequenzähnlichkeitswerte zu erhalten.

Abbildung 4.31: Schematische Darstellung des Vergleichs der Genome von B. licheniformis DSM13, B. subtilis 168 und B. amyloliquefaciens FZB42. Hervorgehoben sind dabei nur die Anzahl der ORFs, welche nur in DSM13 vorhanden sind.

Zunächst wurde unter Verwendung des bidirektionalen BLASTs B. licheniformis DSM13 mit weiteren Vertretern der Bacillus subtilis Gruppe verglichen (Abb. 4.31). Im Einzelnen waren dieses B. subtilis 168 und B. amyloliquefaciens FZB42. Der sogenannte „Heubacillus“ B. subtilis kommt in den oberen Schichten des Bodens vor und gehört zu den am besten charakterisierten Gram-positiven Bakterien (Kunst et al.,

1997; Barbe et al., 2009). B. amyloliquefaciens FZB42 ist ein mit Pflanzen assoziiertes Bakterium, welches das Potential zur Bildung von Sekundärmetaboliten wie den Polyketiden Bacillaene und Difficidin hat (Chen et al., 2007). Diese vergleichenden Untersuchungen ergaben, dass 1027 ORFs unique für B. lichenformis sind, d. h. keine Orthologe sowohl in B. subtilis 168, als auch in B. amyloliquefaciens FZB42 vorhanden sind. Ausgehend hiervon wurde anschließend die Anzahl von ORFs ermittelt, welche beim Wachstum mit einzelnen Aminosäuren als Stickstoff- und Kohlenstoffquelle eine signifikante Erhöhung des Expressionsverhältnisses zeigten (Tab. 4.28). Auch in diesem Zusammenhang wurde eine Änderung des ratio of medians um mindestens einen Faktor 3 als signifikant eingestuft. Logarithmiert zur Basis 2 entspricht dies 1,5849 bzw.

-1,5849.

Tabelle 4.28: Anzahl der charakteristischen Gene für DSM13, welche beim Wachstum auf den angegebenen Aminosäuren eine signifikante Erhöhung der Expression zeigten.

Aminosäure log Expressionsverhältnis

> 1,5849

L-Alanin 31

L-Arginin 98

L-Asparagin 56

L-Aspartat 35

L-Glutamin 90

L-Glutamat 59

L-Prolin 54

In einem nächsten Schritt wurde durch vergleichende Darstellung der in Tabelle 4.28 ermittelten ORFs eine Schnittmenge von Genen gebildet, welche eine signifikant erhöhte Expression beim Wachstum mit Aminosäuren zeigten. Um, wie unter 4.3.1.2.2.

bereits beschrieben, den Effekt auszuschließen, dass eine Katabolitrepression auf Glucose gewachsenen Zellen als erhöhte Expression bei Aminosäure gewachsenen Zellen interpretiert wird, wurden auch hier Daten von Transkriptionsanalysen Gluconat gewachsener Zellen vergleichend mit einbezogen. Die daraus resultierende Schnittmenge ist in Tabelle 4.29 dargestellt. Hierbei handelt es sich um ORFs, welche schon in der Schnittmenge der unter 4.3.1.2.2. bestimmten Gene mit gleicher

Genexpression beim Wachstum mit einzelnen proteinogenen Aminosäuren enthalten waren. Neben dem ORF BLi02104, welcher für eine Methylmalonat-Semialdehyd-Dehydrogenase kodiert, sind auch die zwei angrenzenden Gene upstream (BLi02105, BLi02106) und downstream (BLi02103, BLi02102) in dieser Schnittmenge enthalten.

Des Weiteren sind noch die ORFs BLi03498 und BLi04275 zu nennen. Ersterer kodiert für eine putative Pectin-Methylesterase, letzterer hingegen für ein Homolog der Alanin-Dehydrogenase.

Tabelle 4.29: Darstellung der Schnittmenge von ORFs, welche beim Wachstum mit Aminosäuren als Stickstoff- und Kohlenstoffquelle eine signifikante Erhöhung der Expression zeigten. Des Weiteren sind die Expressionsverhältnisse dieser ORFs beim Wachstum mit Acetat bzw. 2,3-Butandiol im Vergleich zum Wachstum mit Glucose angegeben. Werte größer 1 bedeuten eine verstärkte Expression beim Wachstum mit Acetat bzw. 2,3-Butandiol, Werte kleiner -1 eine verstärkte Expression unter der Referenzbedingung. Die Tabelle enthält repräsentative Einzelmessungen.

ID Annotation log Expressionsverhältnisse

Acetat /

BLi02103 putative Enoyl-CoA-Hydratase 3,17 2,72 BLi02104

BLi02106 putative Butyryl-CoA-Dehydrogenase 3,30 3,18 BLi03498 putative Pectin-Methylesterase 3,40 3,48 BLi04275 homolog zu Ald:

L-Alanin-Dehydrogenase

-1,42 -1,30

Weitere Untersuchungen zeigten, dass für ein Großteil dieser Gene auch beim Wachstum mit C2-Metaboliten, wie Acetat oder 2,3-Butandiol, eine signifikant erhöhte Expression im Vergleich zum Wachstum mit Glucose beobachtet werden konnte (Tab.

4.29). Diente Acetat als Kohlenstoffquelle, wurde nicht nur für die ORFs BLi02106 bis BLi02102, sondern auch für den ORF BLi03498 eine mehr als dreifache Erhöhung des

log Expressionsverhältnisses ermittelt. Beim Wachstum mit 2,3-Butandiol konnte diese Steigerung ebenfalls für die ORFs BLi02102, BLi02105, BLi02106 und BLi03498 beobachtet werden. BLi02103 und BLi02104 hingegen zeigten eine mehr als zweifache Erhöhung des log Expressionsverhältnisses. Lediglich der ORF BLi04275 war sowohl beim Wachstum mit 2,3-Butandiol, als auch mit Acetat als Kohlenstoffquelle reprimiert.

Tabelle 4.30: Vergleichende Darstellung der durch BiBag ermittelten Sequenzähnlichkeiten.

ID Annotation Sequenzähnlichkeit (%)

Bacillus

BLi02103 putative Enoyl-CoA-Hydratase 0 0

BLi02104

BLi03498 putative Pectin-Methylesterase 0 0

BLi04275 homolog zu Ald: L-Alanin-Dehydrogenase

84,4 84,9

Anders als in B. subtilis und seinen nahen Verwandten konnten diese Gene, wiederum unter Verwendung des Bioinformatikprogramms BiBag, in Vertretern der Bacillus cereus Gruppe identifiziert werden (Tab. 4.30). Exemplarisch hervorgehoben werden sollen in diesem Zusammenhang B. weihenstephanensis KBAB4 und B. cereus ATCC 14579. B. weihenstephanensis ist ein fakultativ psychrophiler, vornehmlich im Boden vorkommender Organismus. Der Stamm KBAB4 zeichnet sich durch den Besitz von vier Plasmiden gegenüber anderen Bacillen aus (Lapidus et al., 2008). B. cereus hingegen ist ein mesophiles Bodenbakterium, welches mit Lebensmittelvergiftungen im Zusammenhang steht. Beim Stamm ATCC 14579 handelt

es sich um den Typstamm von B. cereus (Ivanova et al., 2003). Mit Ausnahme der ORFs BLi02103 und BLi03498 konnten für die weiteren Produkte der Gene in beiden Organismen Sequenzähnlichkeiten von mehr als 78% ermittelt werden. Für den ORF BLi04275 konnte eine mehr als 84%ige und für BLi02104 sogar eine mehr als 88%ige Sequenzähnlichkeit ermittelt werden.

Setzt man einen Schwellenwert von 75% Sequenzähnlichkeit voraus, so können noch weitere 34 ORFs der insgesamt 1027 als unique in B. licheniformis ermittelten Gene sowohl in B. weihenstephanensis KBAB4, als auch in B. cereus ATCC 14579 identifiziert werden (Tab. 7.7 im Anhang). Darunter sind paraloge Gene der Arginase (BLi00198) und der Aspartase (BLi00528) zu finden, ebenso wie der ORF der putativen Formiat-Acetyltransferase (BLi02132) und dem im Genom angrenzenden Aktivierungsenzyms (BLi02131). Letztere beiden sind an der Umsetzung von Pyruvat zu Acetyl-CoA und Formiat beteiligt (vgl. 4.1.2.1.). Eine Sequenzähnlichkeit von mehr als 80% zeigte das Gen der anaeroben Ribonukleotid-Reduktase (BLi03824). Für das Gen des potenziell dazugehörigen Aktivierungsenzyms, BLi03823, konnte eine Sequenzähnlichkeit von 67,4% in B. weihenstephanensis KBAB4 bzw. 68% in B. cereus ATCC 14579 bestimmt werden. Beide Enzyme sind an der Reduktion von Ribonukleotid-Triphosphaten zu den entsprechenden Desoxyribonukleotiden beteiligt (vgl. 4.1.2.1.). Des Weiteren konnten ORFs ermittelt werden, dessen Produkt Homologie zur Isocitrat-Lyase (BLi04207) und der Malat-Synthase (BLi04208) aufweisen. Diese bilden, gemeinsam mit weiteren Enzymen des Tricarbonsäurezyklus, den Glyoxylatzyklus (vgl. 4.2.). Im Gegensatz dazu konnte jedoch für 775 ORFs der insgesamt 1027 ORFs keine Sequenzähnlichkeit in B. weihenstephanensis KBAB4 und B. cereus ATCC 14579 mittels BiBag festgestellt werden.