Erstellung und phänotypische Charakterisierung von Mutanten

Neben Transkriptionsanalysen wurden auch molekularbiologische Arbeiten zur Erstellung von Mutanten durchgeführt, die die Ergebnisse der Transkriptionsanalysen experimentell untermauern sollten und weitere Einblicke in die Regulation das Zentralstoffwechsels von B. licheniformis ermöglichen sollen. Von besonderem Interesse waren hierbei Gene, welche eine signifikant erhöhte Expression im Zusammenhang mit der Verwertung von Aminosäuren zeigte. Wie bereits unter 4.3.1.2.4. beschrieben, zeigte das Gen mmgD, welches für die Citratsynthase III kodiert, eine erhöhte Expression im Zusammenhang mit dem Wachstum auf L-Alanin, L-Arginin, L-Glutamin, L-Glutamat und L-Prolin. Lokalisiert ist dieses Gen in direkter Nachbarschaft zu den Genen eines putativen Methylcitratzyklus. Benachbart liegt weiterhin der ORF BLi04093, welcher Homologie mit Transkriptionsregulatoren der GntR-Familie besitzt (Abb. 4.32).

Abbildung 4.32: Organisation der kodierenden Gene eines putativen Methylcitratzyklus in B. licheniformis DSM13.

Überprüfungen der DNA-Microarray-Analysen ergaben, dass nicht nur mmgD, sondern auch die weiteren dem putativen Methylcitratzyklus zugeordneten ORFs beim Wachstum mit den oben angesprochenen proteinogenen Aminosäuren induziert sind (Tab. 4.33). Sowohl für den ORF des putativen transkriptionalen Regulators, als auch für die downstream lokalisierten Gene mmgE und yqiQ konnte eine Erhöhung der Expression beim Wachstum mit diesen einzelnen Aminosäuren als Stickstoff- und Kohlenstoffquelle im Vergleich zum Wachstum mit Glucose ermittelt werden.

Tabelle 4.33: Vergleichende Darstellung der Expressionsverhältnisse von Genen, welche im Zusammenhang mit einem putativen Methylcitratzyklus stehen. Werte größer 1 bedeuten eine verstärkte Expression beim Wachstum mit den angegebenen Aminosäuren im Vergleich zur Referenzbedingung. Die Tabelle enthält repräsentative Einzelmessungen.

ID Gen Funktion log Expressionsverhältnisse

Ala /

Ähnliches konnte auch beim Wachstum auf einem Gemisch aus 20 Aminosäuren beobachtet werden. Zu dem Zeitpunkten T2 bis T5, wenn kein L-Asparagin im Kulturüberstand mehr zu detektieren war (vgl. 4.3.2.4., Abb. 4.29), konnte eine erhöhte Expression der am putativen Methylcitratzyklus beteiligten Gene im Vergleich zum Wachstum mit Glucose beobachtet werden (Tab. 4.34). Lagen hingegen zum Zeitpunkt T1 noch alle Aminosäuren im Medium vor, waren diese Gene nicht induziert.

Weitere interessante Gene wären die verbleibenden Citratsynthasen I und II.

Ergebnisse der Transkriptionsanalysen der durch die Gene citA und citZ kodierten Enzyme wurden im Rahmen der Untersuchungen zu den Citratsynthasen bereits vorgestellt (vgl. 4.3.1.2.4. Abb. 4.22, 4.3.2.2. Abb. 4.26 und 4.3.2.4. Abb. Abb.30).

Tabelle 4.34: Expressionsverhältnisse von Genen, welche im Zusammenhang mit einem putativen Methylcitratzyklus stehen. Die Daten wurden zu den Zeitpunkten T1 bis T5 eines Wachstumsverlaufs in einem definierten Medium mit einem Gemisch von 20 Aminosäuren ermittelt (vgl. 4.3.2.4.). Werte größer 1 bedeuten eine verstärkte Expression beim Wachstum mit einem Gemisch von Aminosäuren zu den angegebenen Zeitpunkten im Vergleich zur Referenzbedingung. Die Tabelle enthält repräsentative Einzelmessungen.

ID Gen Funktion log Expressionsverhältnisse

T1 /

In diesem Zusammenhang gilt es anzumerken, dass interessanterweise auch unter anaeroben Kultivierungsbedingungen im Vergleich zum aeroben Wachstum Änderungen der Expressionsverhältnisse ermittelt werden konnten (Tab. 4.35). Nicht nur für das die Citratsynthase III kodierende Gen mmgD, sondern auch für den upstream angrenzenden ORF BLi04093 und die downstream liegenden ORFs BLi04095 und BLi04096 konnte eine signifikante Erhöhung der Expression unter anaeroben Wachstumsbedingungen beobachtet werden.

Tabelle 4.35: Expressionsverhältnisse von Genen, welche im Zusammenhang mit einem putativen Methylcitratzyklus stehen. Werte kleiner -1 bedeuten eine verstärkte Expression unter anaeroben im Vergleich zu aeroben Kultivierungesbedingungen. Die Tabelle enthält repräsentative Einzelmessungen.

ID Gen Funktion log Expressionsverhältnisse

aerob / anaerob BLi04093 putativer Transkriptionsregulator -2,48

BLi04094 mmgD Citratsynthase III -2,93

BLi04095 mmgE put. Methylaconitat-Hydratase -2,70 BLi04096 yqiQ putative Methylisocitrat-Lyase -2,93

Zur Erstellung von markerfreien in frame Deletionsmutanten sollte das Zielgen durch ein stark verkürztes Fragment des gleichen Gens in B. licheniformis mittels doppelter homologer Rekombination ausgetauscht und somit inaktiviert werden.

Vorgehensweise zur Erstellung des Deletionskonstruktes, der Konjugation und anschließender Selektion sind unter 3.5 in dieser Arbeit beschrieben. Die abschließende Überprüfung auf das Vorhandensein des Deletionsvektors erfolgte mittels Southern-Blot (3.4.4.4.) Wie in Abbildung 4.33 zu sehen, bindet die Sonde spezifisch an die mitgeführte DNA des Vektors pKVM1. Sowohl beim Vektor pKVM1, als auch beim Vektor pMAD sind unspezifische Banden auf gleicher Höhe zu erkennen. Es sind jedoch keinerlei Banden bei den Mutanten bzw. Wildtyp zu beobachten.

Abbildung 4.33: Darstellung eines Southern-Blots zur Überprüfung auf den Deletionsvektor.

Für eine erste phänotypische Charakterisierung lagen folgende Mutanten von B. licheniformis MW3 vor: ΔBLi04093, ΔmmgD, ΔmmgE, ΔyqiQ und ΔcitA. In einem ersten Schritt wurden die Mutanten in einem definierten Medium mit einem Gemisch aus sieben Aminosäuren, welches der Sojabohne nachempfunden war, kultiviert (vgl.

3.2.2.). Um auszuschließen, dass sich Beobachtungen im Rahmen der nachfolgenden Untersuchungen auf die Deletion der beiden Typ I Restriktions-Modifikations-Systeme (Typ I RMS) von B. licheniformis MW3 zurückführen lassen, wurde dieser vergleichend mit dem Wildtyp DSM13 mitgeführt. Das Augenmerk lag zunächst auf den Mutanten der Citratsynthasen. Bei diesen Experimenten konnte kein signifikanter Wachstumsunterschied der Mutante ΔcitA im Vergleich zu DSM13 bzw. MW3

pKVM1 ΔcitA ΔmmgE DSM13 pMAD ΔypiQ MW3

beobachtet werden. Die Mutante ΔmmgD hingegen zeichnete sich durch ein etwas langsameres diauxieähnliches Wachstum aus. Mit dem Einschwenken in die stationäre Phase erreichte sie aber eine ähnliche optische Dichte wie die anderen drei Stämme (Abb. 4.34).

Abbildung 4.34: Vergleichende Wachstumskurven. Dargestellt ist das Wachstum von DSM13 ( ), MW3 ( ), ΔcitA ( ) und ΔmmgD ( ) auf einem definierten Medium mit einem Gemisch aus sieben Aminosäuren. Die Abbildung zeigt repräsentative Einzelmessungen.

Anhand von Analysen des Kulturüberstandes konnte dieses diauxieähnliche Wachstum mit der Verwertung von Aminosäuren in Verbindung gebracht werden (Abb. 4.35). Ebenso wie der Wildtyp DSM13 verstoffwechselte auch die Mutante ΔmmgD zunächst L-Asparagin. Ein Verbrauch der verbleibenden sechs proteinogenen Aminosäuren war erst zu beobachten, als L-Asparagin in geringer Konzentration bzw.

nicht mehr im Kulturüberstand zu detektieren war. Im letzteren Fall war reproduzierbar ein stark verlangsamtes Wachstum zu beobachten. Mit dem sich anschließenden signifikanten Verbrauch der sechs proteinogenen Aminosäuren ging eine zunehmende Bildung von Zellmasse einher.

Abbildung 4.35: Wachstumsverlauf von ΔmmgD auf einem definierten Medium mit einem Gemisch aus sieben Aminosäuren. Dargestellt ist das Wachstum von ΔmmgD ( ) und der Verbrauch der Aminosäuren L-Alanin ( ), L-Arginin ( ), L-Asparagin ( ), L-Aspartat ( ), L-Glutamin ( ), L-Glutamat ( ) und L-Prolin ( ). Die Abbildung zeigt repräsentative Einzelmessungen.

Abbildung 4.36: Wachstumsverlauf von ΔcitA auf einem definierten Medium mit einem Gemisch aus sieben Aminosäuren. Dargestellt ist das Wachstum von ΔcitA ( ) und der Verbrauch der Aminosäuren L-Alanin ( ), L-Arginin ( ), L-Asparagin ( ), L-Aspartat ( ), L-Glutamin ( ), L-Glutamat ( ) und L-Prolin ( ). Die Abbildung zeigt repräsentative Einzelmessungen.

Eine Deletion des für die Citratsynthase I kodierenden Gens citA zeigte bei diesen Experimenten in einem definierten Medium mit einem Gemisch aus sieben Aminosäuren keinen Phänotyp. Sowohl die Daten der Wachstumskurve, als auch die Analysen der Kulturüberstände zeigten keinen signifikanten Unterschied zum Wildtyp DSM13 (Abb. 4.36).

Neben den Citratsynthasen waren die Gene im Zusammenhang mit dem putativen Methylcitratzyklus von Interesse. Bei der Kultivierung der verbleibenden Mutanten ΔBLi04093, ΔmmgE, und ΔyqiQ konnte kein verändertes Wachstumsverhalten in einem definierten Medium mit einem Gemisch aus sieben Aminosäuren im Vergleich zu DSM13 beobachtet werden (Abb. 4.37).

Abbildung 4.37: Vergleichende Wachstumskurven. Dargestellt ist das Wachstum von DSM13 ( ), ΔBLi04093 ( ), ΔmmgE ( ) und ΔyqiQ ( ) auf einem definierten Medium mit einem Gemisch aus sieben Aminosäuren. Die Abbildung zeigt repräsentative Einzelmessungen.

In einem weiteren Experiment wurden die Mutanten in einem definierten Medium mit 50 mM Glucose als Kohlenstoffquelle und 10 mM Ammoniumchlorid als Stickstoffquelle kultiviert. Diese Untersuchungen zeigten, dass sowohl ΔcitA, als auch ΔBLi04093, ΔmmgE und ΔyqiQ keinen Wachstumsunterschied im Vergleich zu DSM13 bzw. MW3 aufwiesen (Abb. 4.38). Die Mutante der Citratsynthase III, ΔmmgD, konnte hingegen weder auf Festmedium (Abb. 4.38), noch in Flüssigkultur (Daten nicht gezeigt) kultiviert werden. Ergänzend soll in diesem Zusammenhang noch erwähnt werden, das die Mutante ΔyqiQ im Gegensatz zu DSM13 bzw. MW3 nicht

mehr in einem definierten Medium mit 60 mM Propionat zu kultivieren ist (Daten nicht gezeigt).

Abbildung 4.38: Vergleichende Darstellung des Wachstum von Wildtyp und Mutanten. Übersicht des Wachstums des Wildtyps und der in dieser Arbeit vorliegenden Mutanten auf einem definierten Festmedium mit 50 mM Glucose als Kohlenstoffquelle. Lediglich für die Mutante ΔmmgD konnte in diesem Zusammenhang ein Phänotyp beobachtet werden.

ΔmmgD DSM13

ΔcitA MW3

DSM13

MW3

ΔBLi04093 ΔyqiQ

ΔmmgD ΔmmgE