Techniken für das Arbeiten mit RNA

3.6.1. Lösungen und Puffer zum Arbeiten mit RNA

Der Umgang mit RNA erfordert äußerst sauberes Arbeiten, um eine Kontamination mit den sehr stabilen RNasen zu vermeiden. Aus diesem Grund wurden alle thermostabilen Lösungen, Glaswaren, Pipettenspitzen und andere Materialien, die für das Arbeiten mit RNA notwendig waren, 2x bei 121°C und 2 bar für 20 min autoklaviert. Die Arbeiten wurden ausschließlich mit Handschuhen durchgeführt. Der Arbeitsplatz und sämtliche notwendigen Gerätschaften wie z.B. Pipetten wurden wiederholt mit 70%igem Ethanol (v/v) gesäubert.

5x DNase Puffer

MgSO4 25 mM

Na-Acetat, pH 5,0 500 mM 2x autoklaviert

10x MOPS-Puffer (pH 7,0)

MOPS 200 mM

Na-Acetat 50 mM

EDTA 10 mM

pH-Wert mit NaOH einstellen

RNA-Auftragspuffer

Formamid 6,5 ml

Formaldehyd 1,2 ml

10x MOPS 2,0 ml

50% Saccharose 0,4 ml

Bromphenolblau 20 mg

Xylencyanol 20 mg

Ethidiumbromid (10 mg/ml) 5 µl

TE-Puffer (pH 8,0)

Tris 10 mM

EDTA 1 mM

2x autoklaviert

3.6.2. Isolierung von RNA aus B. licheniformis

Für die Isolierung von RNA aus Zellen von B. licheniformis ist ein enzymatischer Zellaufschluss ungeeignet. Die Inkubationszeiten und –temperaturen hätten einen vorzeitigen Abbau der RNA zur Folge, da RNA eine kurze Halbwertszeit von wenigen Minuten aufweist. Aus diesem Grund wurden die Zellen mit dem Dismembrator im tiefgekühlten Zustand aufgeschlossen (vgl. 3.4.2.1.).

Um RNA aus B. licheniformis-Zellen zu isolieren, wurden Aliquots von 40 ml aus dem Kulturgefäß entnommen, mit jeweils 10 ml vorgekühltem Methanol versetzt und zügig bei –20°C geerntet (9000 U/min, 5 min). Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in flüssigen Stickstoff gegeben und anschließend bei -70°C gelagert.

Zum Zellaufschluß wurden die Pellets der 40 ml Aliquots in 1 ml sterilem TE-Puffer resuspendiert und bei –9°C gewaschen (13000 U/min, 2 min). Im Anschluss daran wurde das Pellet in 200 µl sterilem TE-Puffer resuspendiert. Parallel wurde das Teflongefäß mit der Chromstahlkugel des Dismembrators in flüssigem Stickstoff gekühlt. Die resuspendierten Zellen wurden in den etwas flüssigen Stickstoff und die Chromstahlkugel enthaltenden PTFE-Zylinder pipettiert, das Gefäß verschlossen und in die Zellmühle eingespannt. Während des Aufschlusses bei 1600 U/min für 3 min wurden die Zellen zu einem weißen gekühlten Zellpulver zermahlen. Dieses wurde vorsichtig in 4 ml RLT-Puffer des RNeasy^® Midi Kits (Qiagen, Cat no. 75144), welchem zuvor 40 µl Mercaptoethanol zugesetzt wurden, resuspendiert. Dieser Puffer wirkt aufgrund einer hohen Guanidiniumhydrochlorid-Konzentration stark proteindenaturierend, so dass die gelösten Zellbestandteile bei 4°C über Nacht bis zur weiteren Präparation aufbewahrt werden konnten.

Die weitere Isolierung und Reinigung der RNA erfolgte mit Hilfe des RNeasy® Midi Kits nach Anleitung des Herstellers. Für die Eluation der RNA wurden 2 x 150 µl RNase freies und steriles H2O verwendet. Die RNA konnte bei -70°C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.

3.6.3. DNase-Verdau und Kontrolle der RNA

Um Verunreinigungen der RNA mit Resten chromosomaler DNA zu vermeiden, erfolgte eine Behandlung der RNA-Lösung mit DNase. Dazu wurden zu den maximal 300 µl wässriger RNA-Lösung, hervorgegangen aus der RNA Isolation, 65 µl 5x DNase-Puffer und 15 µl DNase (10 U/µl, Roche, REF 04716728001) gegeben.

Während einer Inkubation des Ansatzes für 90 min bei 25°C wurde verbliebene DNA durch die DNase hydrolysiert. Im folgenden Inkubationsschritt von 10 min bei 70°C im Thermoblock wurde die DNase inaktiviert. Um sicher zu gehen, dass sämtliche DNA abgebaut wurde, erfolgte eine PCR (3.7.4.) mit spezifischen Primern. Chromosomale DNA wurde als Positivkontrolle mitgeführt. Die PCR-Ansätze wurden anschließend gelelektrophoretisch aufgetrennt, wobei lediglich bei der Positivkontrolle ein Amplifikationsprodukt erscheinen durfte. Im anderen Falle musste die DNase-Behandlung wiederholt werden.

3.6.4. Extraktion und Fällung von RNA

Extraktion von RNA mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol

Die meisten Nukleinsäurepräparationen enthalten unerwünschte Protein-kontaminationen. Diese können mit einer Form der Phenol/Chloroform-Extraktion entfernt werden. Hierzu wurde der RNA 1 Vol saures Phenol zugegeben. Der Ansatz wurde 10 sec gevortext und 3 min bei 13000 U/min zentrifugiert. In diesem Schritt erfolgte eine Phasentrennung. Die obere, wässrige Phase enthielt die gelöste RNA, die denaturierten Proteine hingegen befanden sich in der Interphase. Die obere Phase wurde, unter Vermeidung der Interphase, in ein neues Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Die abgenommene RNA-haltige Phase wurde anschließend mit 1 Vol Chloroform/Isoamylalkohol (24/1 v/v) versetzt, ebenfalls 10 sec gevortext, 3 min bei 13000 U/min zentrifugiert und die entstandene obere Phase erneut in ein neues Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Um die RNA aufzukonzentrieren erfolgte als nächstes eine Fällung mit Ethanol.

Fällung der RNA mit Ethanol

Die in H2O gelöste RNA wurde mit 1/10 Vol Na-Acetat (3,3 M, pH 5,0) und 2,5 Vol -20°C kaltem, unvergällten Ethanol (96%) versetzt und gemischt. Die Fällung erfolgte bei -20°C über Nacht oder 2 Stunden bei -70°C. Nach einem Zentrifugationsschritt von 30 min bei 13000 U/min und -9°C wurde der Ethanol vorsichtig mit der Pipette abgenommen, ohne das transparente RNA-Pellet zu verletzen. Mit 1 ml –20°C kaltem 70%igen Ethanol (v/v) wurde das Pellet für 15 min bei 13000 U/min und -9°C gewaschen und der Ethanol erneut vorsichtig abgenommen. Das Eppendorf-Reaktionsgefäß mit dem RNA-Pellet wurde offen in einem mit Aluminiumfolie verschlossenem, zuvor zweimal autoklaviertem, Becherglas bei 37°C für ca. 15 min getrocknet, bis der Ethanol verdampft war. Gelöst wurde das Pellet in 15 µl RNase freiem H2O 2 Stunden auf Eis. Die Lagerung der RNA erfolgte bei -70°C.

3.6.5. RNA-Konzentrationsbestimmung

Die Bestimmung der Konzentration von RNA erfolgte analog der Konzentrationsbestimmung von DNA (3.4.2.10.). Eine OD260 von 1 entsprach einer Konzentration von 40 µg/ml RNA (Sambrook et al., 1989).

3.6.6. Qualitätskontrolle der RNA 3.6.6.1. Elektrophorese von RNA

Für die elektrophoretische Auftrennung der RNA wurden denaturierende Agarosegele verwendet. Zur Herstellung wurden zunächst 1 g Agarose in 72 ml H2O aufgekocht.

Nach Abkühlen auf 60°C wurden unter dem Abzug 10 ml 10x MOPS-Puffer sowie 18 ml Formaldehyd zugegeben und gut gemischt. Die Lösung wurde anschließend in einen abgegrenzten Bereich einer Gellaufkammer gegossen und ein Taschenkamm eingesetzt. Nach dem Aushärten wurde das Gel mit 1x MOPS-Puffer überschichtet und der Taschenkamm entfernt. Zur Probenvorbereitung wurde das 1 µg RNA entsprechende Volumen mit H2O auf 10 µl aufgefüllt, anschließend mit 1 Vol RNA-Auftragspuffer gemischt und für 15 min bei 65°C im Heizblock denaturiert. Nach einer

Inkubation der Proben für 1 - 2 min auf Eiswasser wurde das Gel zügig beladen. Zur Bestimmung der Transkriptgröße wurde ein identisch behandelter DIG-markierter RNA-Größenstandard (RNA Molecular Weight Marker I, DIG-labeled, Roche 1 526 529) mitgeführt. Die Elektrophorese erfolgte bei 100 V (Regel: ∼5 V / cm Elektrodenabstand) für ca. 2 Stunden, bis die vordere Bande ¾ der Gellänge durchlaufen hatte. Zur Dokumentation wurde das Gel unter UV-Licht fotografiert.

3.6.6.2. Bioanalyzer

Eine weitere Möglichkeit der Auftrennung von RNA stellt der Agilent 2100 Bioanalyzer dar. Die verwendeten RNA Chips des RNA 6000 Nano Kits (Agilent, Cat. No 5067-1511) wurden nach Anweisung des Herstellers präpariert und beladen.

Als Matrix diente hierbei ein Gel-Farbstoff-Gemisch. Während der Analyse wandern die Proben aus den beladenen Wells in den Separationskanal des RNA-Chips und werden dort elektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend werden die Komponenten über ihre Fluoreszenz detektiert und in ein gelähnliches Bild und ein Elektropherogramm umgewandelt.

3.6.6.3. Kontrolle der RNA-Integrität

Die Qualität der RNA wurde mittels ’Reverser Transkription’ (3.7.5.), wie bei der Kontrolle der RNA (3.6.3.), mit spezifischen Primern überprüft. Auch hier erfolgte anschließend eine Auftrennung der Ansätze durch Agarose-Gelelektrophorese, wobei hier für jeden RNA enthaltenden Ansatz ein Amplifikationsprodukt zu sehen sein musste.