Transformation eines Trypsin in einen Elastase Inhibitor

Serinproteasen spalten die peptidische Bindung ihrer Substrate in charakteristischer Weise durch die Verwendung einer katalytischen Triade bestehend aus einem Histidin, einem Aspartat und einem Serin. Dabei übernimmt das Histidin ein Proton der Hydroxylgruppe des Serins, um dessen nukleophilen Angriff auf das Substrat zu ermöglichen, während das ebenfalls in räumlicher Nähe befindliche Aspartat die positiv geladene Form des Histidins stabilisiert. Die Proteasen Trypsin und Elastase gehören zu dieser Familie von Serinproteasen.

Sie unterscheiden sich unter anderem durch ihre Substratspezifität, die im Wesentlichen von der Art der Bindungstasche bestimmt wird [Czapinska und Otlewski, 1999]. Während Trypsin Arginin oder Lysin auf der Aminoseite der zu spaltenden Peptidbindung benötigt, greifen Elastasen spezifisch an Aminosäuren mit kleineren, hydrophoben Seitenketten in der sogenannten P1 Position an.

Elastasen kommen vor allem in polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN), Makrophagen und Endothelzellen vor. Der durch Neutrophilen bedingte Abbau von Proteoglykanen beruht hauptsächlich auf der proteolytischen Aktivität der Elastase. Ferner ist Elastase maßgeblich z.B. an der Gewebezerstörung bei Emphysemen, bei cystischer Fibrose und Rheumatoider Arthritis beteiligt. Autoantikörper (pANCA) gegen dieses Antigen sind assoziiert mit entzündlichen rheumatischen Erkrankungen wie rheumatoider Arthritis, Vaskulitis, Sjögren Syndrom und systemischem Lupus erythematodes (SLE). Elastase

Inhibitoren könnten daher eine Anwendung als anti-immflamatorische Wirkstoffe finden [Tremblay et al., 2003].

Vertreter der Cystin-Knoten Mikroproteine zählen zu den kleinsten bekannten natürlichen Protease Inhibitoren. Vor allem aus den Samen verschiedener Pflanzen konnte eine Vielzahl verschiedener Trypsin Inhibitoren isoliert und charakterisiert werden [Favel et al., 1989, Hamato et al., 1995, Hernandez et al., 2000, Miura und Funatsu, 1995, Otlewski et al., 1984, Polanowski et al., 1980, Wieczorek et al., 1985]. Hamato et al. [Hamato et al., 1995] gelang es, neben einem Trypsin Inhibitor, drei Cystin-Knoten Mikroproteine mit inhibitorischer Aktivität gegenüber Porcine Pankreas Elastase, die neben humaner Leukozyten Elastase zu den am besten charakterisierten Elastasen gehört [Bode et al., 1989], aus den Samen von Momordica charantia zu isolieren. Diese sind zwar sequenzhomolog zu den bekannten Trypsin Inhibitoren, besitzen jedoch statt eines Arginin oder Lysin ein Leucin in der P1 Position. Der potenteste dieser drei Elastase Inhibitoren ist MCEI-III mit einer Inhibitionskonstante von 4x10^-9 M.

In diesem Abschnitt soll, um die strukturelle Plastizität von Cystin-Knoten Mikroproteinen zu untersuchen, durch Transplantation des aminoterminalen Teils von MCEI-III auf den carboxyterminalen Teil von EETI-II ein Hybrid aus beiden Molekülen generiert werden (Abbildung 4.2.1.). Dieses als McEeTI bezeichnete Hybrid sollte daher in den Vektor pBar100 kloniert, über das vorgestellte Expressionssystem als Barnase´-Fusion produziert und gereinigt und dessen inhibitorische Aktivität gegenüber PPE bestimmt werden.

Abbildung 4.2.1.: Aminosäuresequenz und Disulfidverknüpfung des PPE Inhibitors MCEI-III aus Momordica charantia, des Trypsin Inhibitors EETI-II aus Ecbalium elaterium und des Hybridproteins McEeTI, das aus den 18 N-terminalen Resten von MCEI-III (rot) und den 13 C-terminalen Aminosäuren von EETI-II (grün) zusammengesetzt ist. Das C-terminale Serin wird aus Klonierungsgründen eingeführt.

4.2.1.1. Klonierung von pBar100-XA-McEeTI

Für die Produktion und Reinigung von McEeTI über das in Abschnitt 4.1.2. vorgestellte E.

coli Expressionssystem wurde McEeTI zunächst mittels PCR (3.3.3.) amplifiziert. Als Matrize diente der Vektor pBar100-XA-EETI-II. Die PCR wurde in abgewandelter Form zunächst für 10 Zyklen mit je 1 pMol der Oligonukleotide MCETIup1 und cat-Hind-Mitte-lo und dann für weitere 20 Zyklen nach Zugabe von je 10 pMol cat-Hind-Mitte-lo und MCEIupNco durchgeführt. Dabei wurde ein Fusionsgen aus McEeTI mit Nco I Schnittstelle am 5´-Ende und halbem Chloramphenicol Resistenzgen amplifiziert. Das PCR Produkt wurde mittels Phenol/Chloroform Extraktion (3.2.3.2.) und anschließender Ethanol Fällung (3.2.2.1.) gereinigt, mit Nco I und Hind III gespalten (3.3.1.) und mit dem gleichermaßen geschnittenen Vektor pBar100-EETI-II M7I ligiert (3.3.2.). Ein Schema der Klonierung ist in Abbildung 4.2.2. dargestellt.

Abbildung 4.2.2.: Schematische Darstellung der Klonierung von pBar100-XA-McEeTI. Beschreibung der Klonierung im Text. Die Pfeilrichtungen geben die funktionellen Orientierungen der genetischen Elemente an.

Cat, Chloramphenicol Resistenz Gen; Barnase´, Gen für Barnase His¹⁰²Ala; EETI-II, Gen für den Trypsin Inhibitor EETI-II; tac, Tac Promotor Region; tetR, Tetrazyklin Repressor Gen; f1 ori, Replikationsursprung des

Phagen f1; col E1 ori, col E1 Replikationsursprung; phoAs, Alkalische Phosphatase periplasmatische Signal Sequenz; McEeTI, Gen für das Hybrid Protein aus EETI-II und MCEI-III.

Nach Transformation von E. coli 71-18 pRep4 (3.1.5.) konnten insert-tragende Transformanten mittels Kolonie PCR (3.3.3.) mit den Oligonukleotiden cat-Hind-Mitte-lo und MCEIupNco und anschließender Restriktionsanalyse (3.3.1.) der präparierten Plasmid DNA (3.2.6.) von in der PCR positiven Klonen ermittelt werden. Die Sequenz eines Klons konnte durch DNA-Sequenzierung im Laboratorium für Genomanalyse verifiziert werden.

4.2.1.2. Produktion und Reinigung von Barnase´-McEeTI

Die Expression von Barnase´-McEeTI erfolgte nach Transformation von E coli 71-18 pRep4 mit dem in 4.2.1.1. erstellten Plasmid pBar100-XA-McEeTI im Schüttelkolben (3.1.7.1.). Es wurden 2 x 3 l Kolben mit je 1 l TB Medium und den entsprechenden Antibiotika mit 25 ml frischer Übernachtkultur angeimpft. Bei einer OD600 von 0,7 wurde die Genexpression durch Zugabe von IPTG angeschaltet und die Kultur ü.N. bei 30°C unter Schütteln inkubiert.

Die Aufarbeitung der induzierten Kultur erfolgte wie in Kapitel 4.1.2. beschrieben nach Ansäuerung mit Essigsäure aus dem Kulturüberstand. Das Barnase´-McEeTI Fusionsprotein wurde in einem ersten Schritt über kombinierte Kationenaustausch-/RP-Chromatographie (3.4.6.2.) gereinigt. Nach SDS-PAGE Analyse (3.4.1.) wurden Fusionsprotein enthaltene Fraktionen vereinigt und lyophilisiert. Das Protein wurde dann in 0,1 M Tris-HCl pH 7,8 mit 8 M Harnstoff aufgenommen, ü.N. gegen 50 mM Ammoniumacetat dialysiert (3.4.4.) und zur vollständigen Entfernung von Verunreinigungen erneut über Kationenaustausch-chromatographie (3.4.6.3.) an der Vision Biocad^® workstation gereinigt (Abbildung 4.2.3. A).

14.4

Abbildung 4.2.3.: Reinigung von Barnase´-McEeTI. (A) Chromatogramm der Kationenaustausch-chromatographie. In blau dargestellt ist der Verlauf der OD280, in rot der OD260 über die Zeit in min.

In grau: NaCl Gradient in % einer 3 M Stammlösung. (B) Analyse des gereinigten Barnase´-McEeTI Fusionsproteins auf einem 15 %igem SDS-Polyacrylamidgel. M, Molekulargewichts Standard (Größenangabe links in kDa); 1, gereinigtes Barnase´-McEeTI Fusionsprotein.

Die einzelnen Fraktionen der Reinigung wurden mittels SDS-PAGE (3.4.1.) analysiert.

Fraktionen, die das reine Fusionsprotein enthielten, wurden vereinigt und gegen 50 mM Ammoniumacetat dialysiert (3.4.4.). Abbildung 4.2.3. B zeigt das gereinigte Barnase´-McEeTI Fusionsprotein auf einem 15 %igem Polyacrylamidgel.

4.2.1.3. Untersuchung der inhibitorischen Aktivität von McEeTI

In den vorangegangenen Abschnitten wurde die Generierung und Reinigung eines Hybridproteins aus dem N-terminalen Bereich des PPE Inhibitors MCEI-III und dem C-terminalen Bereich des Trypsin Inhibitors EETI-II beschrieben. Unter der Voraussetzung, dass sich trotz der Zusammensetzung aus zwei verschiedenen Mikroproteinen eine stabile dreidimensionale Struktur ausbildet, sollte das generierte Mikroprotein die PPE Spezifität von MCEI-III übernommen haben, da mit dem N-terminalen Teil die Inhibitorschleife mit eingebracht wurde. Daher wurde die inhibitorische Aktivität von McEeTI als Barnase´-Fusionsprotein gegenüber PPE wie in Abschnitt 3.4.11. beschrieben durch Messung der verbleibenden Aktivität von PPE gegenüber dem chromogenen Substrat Suc-(Ala)3-pNA mit und ohne Inhibitor gemessen. Aus der erhaltenen Hemmkurve wurde die apparente Dissoziationskonstante Kiapp des Enzym/Inhibitor-Komplexes bestimmt. Es ergab sich ein Ki

Wert von 5,0x10^-7 M (± 8,1x10^-8). Dieser Wert liegt etwa zwei Zehnerpotenzen über dem von Hamato et al. [Hamato et al., 1995] gemessenen Wert für die Inhibition von PPE durch MCEI-III. Obwohl nicht ausgeschlossen werden kann, dass nicht korrekt Disulfid-verknüpfte Moleküle die dominante Form der Präparation darstellen, legt der ermittelte Ki Wert jedoch nahe, dass das Hybridprotein eine geordnete dreidimensionale Struktur mit der korrekten Verknüpfung der Cystin Reste angenommen hat. Der im Vergleich höhere Ki Wert könnte zum einen durch die im Hybridprotein nicht optimale Positionierung der Inhibitorschleife bzw. des P1 Restes in die PPE Bindungstasche zu erklären sein. Zum anderen könnten jedoch auch unterschiedliche Assays zur Bestimmung des Ki Wertes bzw. eine gewisse sterische Beeinträchtigung des Mikroproteins durch den Barnase´-Fusionspartner mögliche Gründe für den im Vergleich hohen Ki Wert sein.

Mit dem in diesem Abschnitt dargestellten Experiment konnte gezeigt werden, dass eine Neufunktionalisierung eines Cystin-Knoten Mikroproteins durch Austausch einer Schleife bzw. wie in diesem Fall durch Ersetzung des gesamten aminoterminalen Bereiches möglich ist. Diese Neufunktionalisierung bedeutet in diesem Fall die Transformation eines Trypsin in einen Elastase Inhibitor. Es könnte aber konzeptionell durch Transplantation entsprechender Sequenzen in das Cystin-Knoten Grundgerüst die Modulation verschiedener biomolekularer

Wechselwirkungen möglich sein, wie etwa die in Kapitel 4.3. beschriebene Generierung von Thrombopoeitin Rezeptor Agonisten.