Diskussion und Ausblick

In den vorangegangenen Abschnitten wurde ein neuartiges Expressionssystem für die Produktion und Reinigung von Cystin-Knoten Mikroproteinen in Escherichia coli [Schmoldt et al., 2005] bzw. in Pichia pastoris vorgestellt. Das Verfahren sieht die Expression der Mikroproteine als Fusion mit einer enzymatisch inaktivierten Variante (Barnase´) der extrazellulären RNase Barnase aus Bacillus amyloliquefaciens und die Reinigung des löslichen Fusionsproteins aus dem Kulturüberstand von E. coli bzw. P. pastoris vor. Im Gegensatz zur chemischen Synthese von Mikroproteinen [Avrutina et al., 2004, Daly et al., 1999, Le-Nguyen et al., 1989] und der rekombinanten Synthese, bei der das Protein aus inclusion bodies aufgearbeitet wird [Bolewska et al., 1995, Kojima et al., 1996, Wentzel et al., 1999], können die Mikroproteine im vorgestellten System als Barnase´-Fusion in korrekt gefalteter Form isoliert werden. Damit wird die oft schwierige Rückfaltung der Varianten in die native Konformation überflüssig. Der Nachweis für die korrekte Faltung konnte durch Bestimmung der inhibitorischen Aktivität zweier produzierter Trypsin Inhibitor Varianten erbracht werden (4.1.2.3.). Damit konnte zudem gezeigt werden, dass die Fusionierung an Barnase´ nicht zu einer Aufhebung der biologischen Funktion, z.B. durch sterische Effekte,

der Varianten führt, was eine Eignung für gewisse biochemische Tests als Fusionsprotein nahe legt.

Für die Produktion in E. coli 71-18 wurde der Vektor pBar100 [Schmoldt et al., 2005]

ausgehend von den Plasmiden pMT416 [Hartley, 1988] und pASKInt101 [Wentzel et al., 2001] konstruiert (4.1.2.1.). Es konnten mit dem E. coli System zunächst insgesamt vier verschiedene Varianten der Trypsin Inhibitoren EETI-II [Heitz et al., 1989, Polanowski et al., 1980] und McoEeTI, einem Hybrid Protein aus EETI-II und MCoTI-II [Felizmenio-Quimio et al., 2001, Hernandez et al., 2000], produziert und gereinigt werden. Die durchschnittliche Ausbeute der gereinigten Fusionsproteine betrug 22 mg/l Zellkultur bzw. pro 19 g Nassgewicht und liegt damit unter der von Fairlie et al. [Fairlie et al., 2002] von 25-75 mg/l Zellkultur bzw. von Döbili et al. [Döbeli et al., 1998] von 400-4800 mg pro 100 g Zell-Nassgewicht, die jedoch mit ihrem jeweiligen System keine Cystin-Knoten Mikroproteine, sondern lediglich Peptide mit einer Disulfidbrücke produzieren und reinigen konnten.

Mit dem Aufbau eines alternativen Barnase´-Expressiossystems in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris (4.1.3.) konnte die durchschnittliche Ausbeute auf etwa 200 mg Fusionsprotein pro l Zellkultur und damit auf einen etwa 10-fach höheren Wert im Vergleich zur Produktion in E. coli erhöht werden. Es konnten von Joop Van den Heuvel an der GBF in Braunschweig drei verschiedene Barnase´-Mikroprotein Fusionen produziert und von der Selecore GmbH gereinigt werden. Für die Expression in P. pastoris wurde der pPIC9K Vektor von Invitrogen benutzt, der den starken AOX1 Promotor der primären Alkoholoxidase trägt. Über ein enthaltenes Tn903 kanr Gen, das den Hefen Resistenz gegen Geniticin (G418) vermittelt, können die transformierten Hefen nach multi copy Transformanten (eine erhöhte Gendosis führt oft zu einer höheren Proteinproduktion) durchmustert werden. Das Barnase´-Fusionsprotein wird über das Präpropeptid des Pheromons α1 aus S. cerevisiae in das Kulturmedium sekretiert und kann von dort wie im E. coli System in korrekt gefalteter Form durch Kationenaustausch- und RP-Chromatographie isoliert werden.

In dieser Arbeit wurde damit zum ersten Mal die Produktion von Cystin-Knoten Mikroproteinen in einem eukaryontischen Expressionssystem beschrieben. Trotz der erhöhten Ausbeute an Barnase´-Fusionsprotein ist jedoch das E. coli System aufgrund der vergleichsweise hohen Generationszeit der Hefen effizienter. Demgegenüber steht als Vorteil der Produktion in Pichia die fehlende Bildung von Endotoxinen, was in Zukunft hinsichtlich der Entwicklung eines GMP (good manufacturing practice) konformen Prozesses für die

Herstellung von Mikroproteinen für therapeutische Applikationen von Relevanz werden könnte.

Für Applikationen, bei denen das solitäre Mikroprotein benötigt wird, wurden zwei alternative Möglichkeiten für die Abspaltung des Barnase´-Trägerproteins dargelegt (4.1.2.4.). Zum einen steht die selektive chemische Spaltung des Fusionsproteins an Methioninresten mit Bromcyan [Villa et al., 1989] [Kaiser und Metzka, 1999] zur Verfügung, die seit Jahren etabliert und extrem kosteneffizient ist. Zum anderen wurde, als Alternative für die Abspaltung von Mikroproteinen mit internen Methioninen, die proteolytische Spaltung mit Thrombin bzw. mit Faktor XA Protease untersucht. Während sich Faktor XA Protease als ungeeignet für die effektive Spaltung von Barnase´-Fusionsproteinen herausstellte, erwies sich Thrombin als spezifische und effiziente Alternative zu Bromcyan. Die Trennung des Mikroproteins vom abgespalteten Trägerprotein kann mittels RP-HPLC geschehen.

In Abschnitt 4.1.4. wurde die Reinigung und die Aufklärung der Struktur von Barnase´-McoEeTI beschrieben. Es sollte in Zusammenarbeit mit Hartmut Niemann von der GBF an diesem Beispiel untersucht werden, ob sich die zur Expression und Reinigung gedachte Fusionierung der Mikroproteine an Barnase´ für die Erleichterung der Kristallisation von (solitär schlecht kristallisierenden) Cystin-Knoten Mikroproteinen eignet.

Die Struktur des Fusionsproteins konnte von H. Niemann in kurzer Zeit durch molekularen Ersatz mit einem Monomer von Barnase w.t. [Mauguen et al., 1982] als Suchmodell mit einer Auflösung von 1,3 Ǻ gelöst werden. Sie stellt eine von nur wenigen Kristallstrukturen von nicht komplexierten Cystin-Knoten Mikroproteinen und die einzige als Fusion mit einem Trägerprotein dar. McoEeTI zeigt die für Cystin-Knoten Mikroproteine charakteristische Verknüpfung der sechs Cystein Reste zu drei Disulfibrücken. Die erfolgreiche Lösung der Struktur bestätigt den konzeptionellen Ansatz und legt eine generelle Eignung der Fusionierung von Barnase´ für die Kristallisation von Cystin-Knoten Mikroproteinen nahe.

Zudem stellt die erhaltene McoEeTI Struktur die Grundlage für die struktur-basierte Weiterentwicklung der Tryptase-inhibitorischen Eigenschaften des Moleküls dar (Kapitel 4.2.2.).

Für die Zukunft können noch einige Optimierungen des beschriebenen Expressions- und Reinigungsprozess vorgenommen werden. So könnten z.B., um die den Reinigungsprozess erschwerenden Peptide aus dem Medium zu entfernen, Minimalmedien verwendet oder das verwendete TB-Medium durch Ultrafiltration vor dem Autoklavieren vorfraktioniert werden.

Des weiteren könnte die starke Bindung von Barnase an seinen natürlichen Inhibitor Barstar,

der mit Barnase einen Komplex mit einer sehr hohen Dissoziationskonstante von ca. 10^-14 M ausbildet [Hartley, 2001, Schreiber und Fersht, 1996], für eine alternative Reinigungsstrategie ausgenutzt werden. Unter der Voraussetzung, dass die His¹⁰²Ala Mutation in Barnase´ diese starke Bindung nicht zerstört, wäre eine affinitätschromatographische Reinigung mit immobilisiertem Barstar Protein, das wie Barnase gut in E. coli exprimiert werden kann [Hartley, 1988], denkbar. Solch eine Strategie wurde kürzlich von Deyev et al. [Deyev et al., 2003] in umgekehrter Konstellation (Barnase wurde immobilisiert) für die Reinigung von scFV Antikörperfragmenten beschrieben.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit dem in diesem Kapitel beschriebenen Barnase´-Expressionssystem die Grundlagen für die Generierung rational designter Protease Inhibitoren bzw. Thrombopoietin mimetischer Mikroprotein Varianten gelegt worden sind.