Molekularbiologische Arbeitsmethoden

3.2.1. Vorbereitung von Geräten und Lösungen

Hitzestabile Geräte wurden durch Erhitzen für 20 min auf 181 °C sterilisiert. Hitzestabile Lösungen wurden für 20 min bei 121 °C autoklaviert. In der Hitze nicht beständige Geräte wurden mit 70 % (v/v) Ethanol gereinigt und getrocknet. Hitzelabile Bestandteile von Lösungen wurden als konzentrierte Stammlösungen hergestellt und vor der Zugabe zu bereits sterilen Lösungen durch einen Membranfilter der Porengröße von 0,2 µl sterilfiltriert.

3.2.2. Fällung von DNA aus wässrigen Lösungen

3.2.2.1. Fällung von DNA mit Ethanol

Die Ethanolfällung diente der Konzentration von DNA und der Entfernung von Proteinen, Salzen und freien Nukleotiden. Proteine und Salze wurden zwar nicht vollständig, für viele Zwecke jedoch in ausreichendem Maße entfernt. Dabei wurde die Konzentration monovalenter Kationen erhöht, was durch Erhöhung der Dielektrizitätskonstante die Abstoßung des negativ geladenen Phosphodiester-Rückgrats verminderte, wodurch bei Lösungsmittelentzug durch Zugabe von Ethanol die DNA-Fällung ermöglicht wurde.

Die DNA-haltige Lösung wurde mit 1/10 Vol 7 M Ammonimacetatlösung und 3 Vol 96 % Ethanol p.A. je nach zu erwartender DNA-Menge 5 bis 45 min bei -20 °C gefällt und danach bei 13000 u/min in der Tischzentrifuge abzentrifugiert. Das Pellet wurde optional mit 70 % (v/v) Ethanol gewaschen und 10 min bei gleichen Bedingungen zentrifugiert. Der Ethanol wurde dann so gut wie möglich abgetrennt. Dazu wurden die Gefäße nach Entfernen des Überstandes offen 10 min bei 37 °C im Heizblock stehen gelassen. Anschließend wurde das DNA-Pellet je nach gewünschter Konzentration in einem entsprechenden Endvolumen Millipore-Wasser oder TE-Puffer aufgenommen.

3.2.2.2. Fällung von DNA mit Isopropanol

DNA kann auch mit Isopropanol anstelle von Ethanol gefällt werden. Bei der Verwendung von Isopropanol wird dabei die Präzipitation von Salzen vermindert. Diese Art der Fällung bietet sich besonders dann an, wenn Salze aus der zu fällenden Lösung entfernt werden sollen.

Dazu wurde analog zur DNA-Fällung mit Ethanol verfahren. Im Unterschied dazu wurden jedoch nur 0,7 Vol bis 1 Vol Isopropanol eingesetzt. Wie auch nach der Ethanolfällung wurde anschließend mit 70 % (v/v) Ethanol gewaschen.

3.2.3. Extraktion von DNA in wässrigen Lösungen mit organischen Lösungsmitteln

3.2.3.1. Präparation einer Phenollösung [Grinsted und Bennett, 1988]

500 g festes Phenol wurden in 130 ml Wasser, 7,5 ml 2 N NaOH und 6 ml 1 M Tris-HCl, pH 7,5 gelöst. Zum Schutz vor Oxidation wurde 8-Hydroxychinolin (0,1 % (w/v)) hinzugefügt und die Lösung lichtgeschützt in einer dunklen Flasche bei Raumtemperatur gelagert.

Die so präparierte Phenollösung wird im Folgenden als Phenol, die Mischung aus je 50 % (v/v) Phenollösung und Chloroform wird im Folgenden als Phenol/Chloroform bezeichnet.

3.2.3.2. Extraktion von DNA mit Phenol, Phenol/Chloroform oder Chloroform

Zur Entfernung von Proteinen, Ethidiumbromid oder Resten anderer hydrophober Kontaminationen diente die Extraktion von DNA mit Phenol, Phenol/Chloroform und Chloroform. Die Extraktion mit Chloroform diente auch der Entfernung von Phenol aus der wäßrigen Phase. Die DNA-Lösung wurden mit 1 Vol Phenol, Phenol/Chloroform oder Chloroform versetzt und gründlich gemischt. Um die zwei Phasen zu trennen, wurde der Ansatz zentrifugiert (Tischzentrifuge, 13 000 u/min, 3 min, RT) und anschließend die wässrige Oberphase in ein neues Reaktionsgefäß überführt. In der Regel folgte auf eine Extraktion mit Phenol/Chloroform eine Ethanolfällung, wodurch evtl. vorhandene Chloroformreste entfernt werden können.

3.2.4. Agarosegelelektrophorese

Die Auftrennung von doppel- und einzelsträngiger DNA wurde in Agarosegelen unterschiedlicher Größe und Konzentration (1 % - 2 % (w/v) Agarose in TBE-Puffer) durchgeführt. Lange Fragmente wurden in niederprozentigen, kurze Fragmente in höherprozentigen Gelen oder in HEC (Hydroxyethyl-Cellulose)-Gelen aufgetrennt, bei der eine benötigte Menge einer 2%igen HEC-Stammlösung (2% HEC in 10 mM Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) 1:1 mit einer 2%igen Agarose-Lösung gemischt und aufgekocht wurde.

Die Agarose wurde im Puffer bis zur vollständigen Lösung in einem Mikrowellenofen aufgekocht. Nach Abkühlen der Lösung auf ca. 60 °C wurde zum Anfärben von DNA in der Regel 0,5 µg/ml Ethidiumbromid zugesetzt. Das Gel wurde in eine Flachbett-Gelkammer (100 x 7 x 0,5 mm), direkt in einen abgegrenzten Bereich der Elektrophoresekammer gegossen und der Taschenkamm gesetzt. Nach dem Erstarren des Gels wurde der Taschenkamm entfernt und soviel TBE-Puffer hinzugefügt, bis das Gel komplett bedeckt war.

Die Proben wurden mit mindestens 1/5 Vol Sucrosefarbmarker versetzt und in die Geltaschen gefüllt. Die Elektrophorese wurde bei einer konstanten Spannung zwischen 40 V und 130 V für 30 - 60 min durchgeführt (5 bis 10 V/cm Feldstärke). Die aufgetrennten DNA-Fragmente wurden im UV-Durchlicht (302 nm) durch Fluoreszenz des eingelagerten Ethidiumbromids sichtbar gemacht und fotografiert. Zur Längen- und Konzentrationsbestimmung für die resultierenden DNA-Banden wurden DNA-Fragmentlängenstandards (DNA-Konzentration:

100 ng/µl) verwendet.

3.2.5. Bestimmung der DNA-Konzentration in wässrigen Lösungen

Die DNA-Konzentration wurde in einem Eppendorf-Photometer (BioPhotometer) ermittelt.

Für doppelsträngige DNA wurde die Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm in einer Mikroküvette (Hellma, QS 1,000) gegen Wasser gemessen. Eine OD260 von 1,0 entspricht dabei einer Konzentration von 50 µg/ml. Durch zusätzliche Messung der Lösung bei 280 nm konnte eine Aussage über die Reinheit der Lösung gemacht werden. Für eine proteinfreie Nukleinsäurelösung sollte das Verhältnis von OD260/OD280 ungefähr 2:1 sein.

3.2.6. Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli

Zur Präparation von Plasmid-DNA im analytischen und präparativen Maßstab kamen Kits verschiedener Firmen zur Anwendung (analytisch: Invitek Invisorb Spin Plasmid Mini Kit, Promega Wizard^® Plus SV Minipreps, QUIAGEN QIAprep Spin Miniprep Kit; präparativ:

Genomed JetStar Plasmid Midiprep Kit 2.0, QIAGEN Plasmid Midi Kit), die auf dem Prinzip der alkalischen Lyse beruhen. Dabei werden die Zellen zunächst durch Zentrifugation pelletiert und in Resuspensions-Puffer aufgenommen. Im zweiten Schritt werden die Zellen durch Zugabe von Lysis-Puffer (enthält NaOH und SDS) lysiert und die DNA denaturiert.

Durch Zugabe von Neutralisierungs-Puffer (niedriger pH-Wert) wird dann der pH-Wert wieder in den neutralen Bereich abgesenkt; dabei fallen genomische DNA und Proteine aus, während die Plasmid-DNA aufgrund ihrer topologischen Eigenschaften wieder renaturiert.

Nach Zentrifugation kann schließlich die Plasmid-DNA über eine Silica-Säule isoliert werden.

3.2.7. Reinigung von DNA aus Agarosegelen

Zur Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde das Invisorb Spin DNA Extraction Kit (Invitek), das QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) oder das Wizard^® SV Gel and PCR Clean-up System (Promega) verwendet. Die aus dem Gel zu isolierende DNA wurde auf dem UV-Durchlicht-Tisch mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten und entsprechend der Instruktionen des jeweiligen Kits gereinigt.