Enzymatische Manipulation von DNA

3.3.1. Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen

Plasmid-DNA wurde mit Restriktionsendonukleasen unter den vom jeweiligen Hersteller des Enzyms empfohlenen Temperatur- und Pufferbedingungen gespalten. Gleichzeitige Spaltungen mit mehreren Enzymen wurden unter den Pufferbedingungen durchgeführt, bei

denen laut Hersteller die Endonukleasen mindestens 50 % bis 100 % Spaltaktivität besaßen.

War eine Doppelspaltung wegen Inkompatibilität der Enzyme in den mitgelieferten Puffern nicht möglich, wurde die DNA nach der ersten Spaltung mit Ethanol gefällt. In der Regel wurden pro µg DNA 2-3 Einheiten Enzym eingesetzt und der Ansatz für 1-3 h inkubiert.

Wurde über Nacht inkubiert, so wurden entsprechend der Herstellerangaben entsprechend geringere Mengen an Enzym verwendet.

3.3.2. Ligation von DNA-Fragmenten

Die Ligation von DNA-Fragmenten zu einem zirkulären Ligationsprodukt wurde mit einem bis zu fünffachen molaren Überschuß an DNA-Insert-Fragment gegenüber dem DNA-Vektor-Fragment durchgeführt. Verwendet wurde der T4 DNA-Ligase-Puffer und ca. 2 Einheiten T4 DNA-Ligase in einem Endvolumen von 20 µl. Die Reaktion erfolgte in der Regel über Nacht bei ca. 12 °C im Kühlschrank. Der Ligationsansatz wurde vor einer Transformation von E.

coli-Zellen mit Phenol/Chloroform und mit Chloroform extrahiert (optional zur Erhöhung der Transformationseffizienz, 3.2.3.2.) und mit Ethanol gefällt (3.2.2.1).

3.3.3. Polymerasekettenreaktion (PCR) [Mullis und Faloona, 1987] [Saiki et al., 1988]

Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion steht eine potente in vitro-Methode zur enzymatischen Amplifikation spezifischer DNA-Fragmente zur Verfügung. Mit ihr ist es möglich, aus einem komplexen DNA-Gemisch heraus selektiv eine DNA-Matrize zu vervielfachen. Im ersten Schritt wird die doppelsträngige DNA-Vorlage durch Erhitzen in einzelsträngige DNA überführt (Denaturierung). Beim Absenken der Temperatur lagern sich zwei Oligonukleotid-Primer an die Matrizen-DNA an (Primer-Annealing) und flankieren die zu amplifizierenden komplementären Zielregionen. Die Primer werden mit Hilfe einer thermostabilen Polymerase komplementär zur ursprünglichen Duplex-DNA bei hoher Temperatur verlängert (Primer-Extension), um unspezifische Hybridisierung der Primer an die Matrize zu verhindern. Es wird eine bestimmte Anzahl an Amplifikationszyklen durchgeführt, wodurch sich die durch die beiden Primer flankierte DNA-Region akkumuliert.

Die PCR-Bedingungen mussten je nach Länge der zu amplifizierenden Sequenz sowie der Länge und des G/C-Gehaltes der verwendeten spezifischen Primer angepasst werden. Die Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 50 µl durchgeführt. Als Matrize wurden ca.

5 - 10 ng DNA eingesetzt, in Einzelfällen war die DNA-Menge höher (bis 100 ng). Diente ein Oligonukleotid als Matrize, so wurde 1 fmol von diesem eingesetzt.

In die PCR-Reaktionsgefäße wurden zunächst 25 µl Taq-Puffer (1x) und Template DNA gegeben.

Als Mastermix wurden in einem Eppendorf Reaktionsgefäß zusammenpipettiert:

2,5 µl Puffer (10x)

1 µl 10 mM dNTPs

je 1 µl Primer (10 pMol/µl) ad 25 µl Wasser

Je 25 µl des Mastermix wurden in die Reaktionsgefäße gegeben. Zur Vermeidung von Primer-Fehlpaarungen wurde der Mastermix erst nach der initialen zweiminütigen Denaturierungsphase bei 98 °C zu der Matrizen-DNA gegeben. Diese Abwandlung der PCR wird als Hot Start-PCR bezeichnet. Im Allgemeinen wurde dieser der Vorzug gegenüber der konventionellen PCR gegeben. Die Reaktionsgefäße wurden vor Platzierung in dem PCR-Cycler mit PCR-Wachs (Chill-out 14, MJ Research) oder Mineralöl überschichtet.

Die Länge und die Temperatur der einzelnen Reaktionsschritte der PCR-Zyklen, sowie deren Anzahl wurde durch die Wahl der Matrize, die Basenzusammensetzung, Länge der Primer und durch die Länge der zu amplifizierenden Sequenz bestimmt. Die Elongationsreaktion (Primer-Extension) wurde bei 72 °C für 30 s pro 1000 bp durchgeführt. Die Anzahl der Zyklen betrug zwischen 20 und 30. Die Schmelztemperatur TM eines Oligonukleotids wurde nach folgender empirischer Formel (3.1) berechnet, welche sowohl den relativen G/C-Gehalt (% G/C) als auch die Länge der Oligonukleotide (n) berücksichtigt:

T_M 650n

Die errechnete Temperatur lag in der Regel zwischen 45 °C und 60 °C. Die optimale Annealing-Temperatur TA für eine Polymerasekettenreaktion wurde nach (2) bestimmt:

C

TM1 und TM2 stehen dabei für die Schmelztemperaturen der beiden verwendeten Primer. Die PCR wurde in einem Minicycler (MJ Research) oder einem Primus 96 Thermocycler (MWG Biotech) durchgeführt. Das Programm für die PCRs war:

98 °C für 2min

85 °C bis zur Zugabe des Mastermix 94 °C 30 s

annealing Temperatur (TA) 30 s

72 °C 1 min pro kb Produkt (Minimum 30 s)

25 oder 30 Mal nach Schritt 1

Zur direkten Amplifikation von DNA-Bereichen aus Bakterienzellen kam eine modifizierte PCR zur Anwendung ("Kolonie-PCR", [Hofmann und Brian, 1991]). Mit dieser Methode kann schnell und eindeutig das Vorhandensein eines definierten Plasmid-Abschnitts in Bakterienklonen nachgewiesen werden. In PCR-Gefäßen (0,2 ml) wurden 25 µl Taq-Polymerase-Puffer vorgelegt. Mit einem sterilen Zahnstocher wurden Zellen aus einer Bakterienkolonie aufgenommen, auf einer Mediumplatte ausgestrichen und die restlichen Zellen in dem Gefäß abgewaschen. Die Bakteriensuspension wurde in die PCR-Maschine gestellt, die übrigen Agenzien wurden in Form eines Mastermixes zusammengegeben und der Ansatz wurde mit 25 µl Chill out 14^ Flüssigwachs überschichtet.

Für 10 PCR- Reaktionen wurden 2 µl Taq-DNA-Polymerase, 30 µl 10 x Taq-Polymerase-Puffer , 10 µl dNTPs (je 10 mM), jeweils 50 pmol der zu verwendenden Primer und Wasser bis auf 300 µl zusammengegeben. Folgendes PCR-Programm wurde gestartet: 2 min 98 °C, Zugabe von 25 µl Mastermix bei 85 °C, 30 Zyklen á 30 s 94 °C, 30 s Hybridisierungstemperatur, 1 min/kb 72 °C, danach auf 4 °C. Die Hybridisierungstemperatur wurde wie oben beschrieben ermittelt. Der Erfolg der "Kolonie-PCR" wurde auf einem Agarosegel überprüft (3.2.4.).

In einigen Fällen konnte das zu generierende PCR Produkt nicht in einem Schritt hergestellt werden bzw. es sollte eine Restriktionsschnittstelle in der Mitte des Produktes entfernt werden. Hier wurde eine zweistufige SOE-PCR (Splicing by Overlapping Extension) durchgeführt. In einem ersten Amplifikationsschritt wurden zunächst mit zwei außen und zwei innen liegenden Oligonukleotiden zwei Fragmente generiert. Die beiden inneren Primer wurden dabei so definiert, dass die beiden Fragmente eine Überlappung von 22-24 Basen aufwiesen. Nach Reinigung der Fragmente über 1 bzw. 2%ige Agarosegele (3.2.7.) wurden diese in etwa gleichen Mengen als Matrize in einem zweiten PCR Schritt mit den beiden äußeren Oligonukleotiden eingesetzt. Das entstehende Endprodukt wurde schließlich mittels Phenol/Chloroform Extraktion (3.2.3.2.) und anschließender Ethanol Fällung (3.2.2.1.) für nachfolgende Anwendungen gereinigt.

3.3.4. Auffüllen von überhängenden Enden mit T4-DNA-Polymerase

Zur Erzeugung von „glatten“ DNA-Enden wurde T4-DNA-Polymerase (MBI, Fermentas) benutzt. Die Reaktion erfolgte in einem Gesamtvolumen von 20 µl in T4-DNA-Polymerase-Puffer (MBI, Fermentas) mit 0,5 mM dNTPs und 1 Einheit (u) Enzym für 20 min im

Kühlraum. Anschließend wurde die aufgefüllte DNA mittels Phenol/Chloroform Extraktion (3.2.3.2.) aufgereinigt und mit Ethanol gefällt (3.2.2.1.) .