Inhibition der humanen β-III Tryptase mit dem dimerisierten EETI-II TR-1 Protein

eingeführte singuläre Lysin Reste mittels bifunktionaler NHS-Ester zu di

HPLC.

Im vorangehenden Abschnitt konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, Mikroproteine über merisieren. Für die Dimerisierung von EETI-II TR-1 wurde DSS benutzt, was zu einem sieben C-Atome langen linker zwischen den beiden Stickstoffatomen der Lysine führt (Abbildung 4.2.10.). Ob sich

dieser linker für eine optimale Passung der beiden Mikroprotein Kopfgruppen in zwei gegenüberliegende S1 Taschen der Tryptase Monomere eignet, sollte über die Messung der inhibitorischen Aktivität von monomerem und dimerem EETI-II TR-1 bestimmt werden. Wie aus Tabelle 4.2.6. ersichtlich, hat sich der Ki Wert gegenüber Trypsin des monomeren EETI-II TR-1 im Vergleich zur Ausgangsvariante –M7I durch die Modifikationen nicht verschlechtert. Jedoch zeigte sich bei keiner der drei getesteten Dimer Fraktionen ein positiver Effekt, d.h. offensichtlich konnten die Mikroprotein Kopfgruppen mit dem verwendeten linker nicht in optimaler Weise positioniert werden.

Variante Aktivität [%] ^a Kiapp vs Trypsin [nM] Kiapp vs Tryptase [nM]

Barnase-EETI-II M7I 65 0,1 1300

EETI-II TR-1 38 0,1 1000

EETI-TR-1 Dimer Fr.1 3 0,1 > 1500

EETI-TR-1 Dimer Fr.2 78 0,2 1100

EETI-TR-1 Dimer Fr.3 31 0,1 1100

Tabelle 4.2.6.: Ergebnisse der Tryptase Inhibitionstests. ^a, bestimmt mittels active site Titration mit Trypsin. Die Werte wurden in der Abteilung Dr. Sommerhoff bestimmt.

Schaschke et al. machten bei ihren Untersuchungen mit bivalenten chemisch synthetisierten Inhibitoren die Beobachtung, dass schon der Austausch eines Glycin gegen ein β-Alanin zu einer deutlichen Veränderung in der inhibitorischen Aktivität gegenüber Tryptase führte [Schaschke et al., 2001]. Bei der Dimerisierung von EETI-II TR-1 mit DSS handelte es sich lediglich um einen ersten sondierenden Versuch. Weiterführende Untersuchungen sollten auf die Variation der Länge des linkers und der Position des Verknüpfungspunktes in der Peptidkette abzielen.

4.2.3. Diskussion und Ausblick

In dem zurückliegenden Kapitel wurde das Konzept der Neufunktionalisierung von Cystin-Knoten Mikroproteinen anhand zweier Beispiele eingeführt. Da es sich bei den als

Abschnitt konnte gezeigt werden, dass durch Transplantation des N-terminalen Grundgerüst verwendeten Proteinen EETI-II, McoEeTI bzw. McoTI um Trypsin Inhibitoren handelt, wurde zunächst die naheliegende Möglichkeit einer Generierung von Inhibitoren therapeutisch interessanter Serinproteasen ergründet.

Im ersten

Bereichs des Elastase Inhibitors MCEI-III in das Grundgerüst von EETI-II auch dessen Funktion auf das entstehende Hybridprotein übertragbar ist. Nach Produktion und Reinigung des konstruierten McEeTI Proteins als Barnase´ Fusion konnte ein Ki Wert von 5,0x10^–7 M (±

8,1x 10^-8) gegenüber Porcine Pankreas Elastase (PPE) bestimmt werden. Dieser Wert liegt

zwar um etwa zwei Zehnerpotenzen über dem von Hamato et al. bestimmten Wert für MCEI-III [Hamato et al., 1995], was z.B. auf eine sterische Behinderung durch die Fusionierung an Barnase´ zurückzuführen sein könnte. Er zeigt jedoch, dass die transplantierte Inhibitorschleife durch das Cystin-Knoten Grundgerüst von EETI-II in einer konformationellen Struktur positioniert wurde, die die Inhibition der Elastase ermöglichte.

Tryptasen sind die mengenmäßig dominierenden Proteine humaner Mastzellen. Die Trypsin-ähnlichen Serinproteasen wurden in den letzten Jahren in den Kontext verschiedener pathophysiologischer Prozesse gebracht. So wird der Tryptase eine Mediator Rolle in

allergischen und inflam es nj

A l., 1995] zugesprochen. Durch die tetramere Struktur der Tryptase in der aktiv ren zentrale e nur den Eintritt kleinerer Moleküle ermöglicht, wurden bisher hauptsächlich kleine chemisch synthetisierte Inhibitoren entwickelt. Obwohl die W ickelten ptase Inhibitoren in vitro bzw. z.B. bei dem Inhibitor APC-366 [Krishna et al., 2001] im Tierexperiment nachgewiesen werden konnte [Clark et al.,

15 verschiedene EETI-II bzw. McoEeTI Varianten und in 8 verschiedene McoTI Varianten hergestellt werden.

Diese wurden in der Abteilung von Prof. Dr. Sommerhoff auf ihre inhibitorische Aktivität gegenüber Tryptase getestet. Es zeigte sich, dass sich McoEeTI bzw. McoTI als Grundgerüst für die Generierung potenter Tryptase Inhibitoren eignet. Aufgrund ihrer geringen Größe werden im Gegensatz zum leech-derived-trypsin-inhibitor (LDTI) [Auerswald et al., 1994, Pohlig et al., 1996, Sommerhoff et al., 1994] alle vier Monomere der Tryptase besetzt und inhibiert. Neben der obligaten positiv geladenen Aminosäure in der P1 Position scheint eine matorischen Proz sen wie z.B. Rhinitis, Co unctivitis und vor allem sthma [Tanaka et a

en Form, de Por

irksamkeit der entw Try

1995], scheiterten zahlreiche Inhibitoren auf small-molecule Basis aus verschiedenen Gründen in der weiteren Entwicklung [Newhouse, 2002]. Die einzige Verbindung, die bisher die klinische Phase II durchlaufen hat, ist der dibasische Inhibitor APC-2059 [Rice et al., 2000, Tremaine et al., 2002].

Cystin-Knoten Mikroproteine besitzen im Vergleich zu small-molecules möglicherweise verschiedene Vorteile z.B. hinsichtlich ihrer Stabilität und Paßgenauigkeit. Es sollten daher im Rahmen dieser Arbeit Tryptase Inhibitoren auf Mikroprotein Basis generiert werden.

Insgesamt konnten

Zusammenarbeit mit Olga Avrutina

generelle positiv geladene Oberflächenstruktur wichtig für die inhibitorische Funktion von McoEeTI bzw. McoTI zu sein. Durch Einfügen der aminoterminalen Reste KKV von LDTI konnte der Ki Wert gegenüber β-III Tryptase von 20 (McoTI-K) auf 2 nM (McoTI-KKV)

gesenkt werden, was im Bereich veröffentlichter Daten von Inhibitoren auf chemischer Basis liegt.

Neben einer starken Inhibition der humanen Tryptase stellt insbesondere die Selektivität gegenüber anderen Proteasen einen entscheidenden Aspekt für therapeutische Applikationen dar. Daher wurden die drei generierten Inhibitoren McoTI-R, McoTI-KKV und McoEeTI auf

imerisierung eines Cystin-Knoten Mikroproteins beschrieben

ase´-inhibitorische Aktivität gegenüber anderen wichtigen Serinproteasen aus dem Pankreas, der Blutgerinnung, aus dem Bereich der Immunabwehr und zwei Vertreter der Kallikreine getestet (Tabelle 4.2.4.). Aus den (bisher nur vorläufigen) Werten wurde die Selektivität des jeweiligen Inhibitors gegenüber der jeweiligen Protease bestimmt und ein Vergleich mit den small-molecule Inhibitoren RWJ-56423, APC-366 und Babim (Tabelle 4.2.5.) angestellt. Alle drei Inhibitoren sind hinsichtlich der Selektivität gegenüber den getesteten Proteasen in einem vergleichbaren Bereich zu Babim, APC-366 und RWJ-56423.

Die spezielle tetramere Architektur der humanen Tryptase macht wie bereits mehrfach gezeigt wurde [Schaschke et al., 2002, Schaschke et al., 2001, Selwood et al., 2003] das rationale Design bivalenter Inhibitoren möglich. Durch die energetischen Vorteile dieser bivalenten Inhibitoren können theoretisch im Vergleich zum Monomer potenzierte Inhibitionskonstanten und damit verbunden auch drastisch erhöhte Selektivitäten erreicht werden. In Abschnitt 4.2.2.5. wurde erstmals die D

und damit die Grundlage für die Herstellung bivalenter Inhibitoren gelegt. Auf Basis von EETI-II wurde eine Variante mit einem singulärem Lysin Rest an Position #25 des Mikroproteins konstruiert. Diese als EETI-II TR-1 bezeichnete Variante wurde als Barn Fusion produziert und gereinigt. Nach Abspaltung des Trägerproteins konnte das Mikroprotein mittels DSS, einem homobifunktionalen N-Hydroxysuccinimid-Ester, über die Lysin Seitenkette erfolgreich dimerisiert werden. Eine Verbesserung der inhibitorischen Aktivität des generierten Dimers gegenüber Tryptase konnte jedoch nicht gemessen werden, was vermutlich auf eine ungeeignete Länge des verwendeten linkers zurückzuführen ist.

Es sollte daher für die Dimerisierung in Zukunft unter Verwendung der Kristallstrukturen von Barnase´-McoEeTI (Niemann et al., Manuskript in Vorbereitung) und der humanen β-II Tryptase [Pereira et al., 1998] eine genaue Analyse der für die optimalen Positionierung der Mikroprotein Kopfgruppen erforderlichen linker Länge durchgeführt werden. Des weiteren sollte in Zukunft neben der Optimierung der bestehenden McoEeTI bzw. McoTI Inhibitoren ein Nachweis der biologischen Wirksamkeit in vivo erfolgen.