Strategien zur Identifizierung molekulargenetischer Ursachen von Erbkrankheiten oder morphologischen Merkmalen

Für die Suche nach ursächlichen Mutationen für bestimmte morphologische Merkmale oder für Erbkrankheiten haben sich verschiedene Herangehensweisen etabliert, die

grundsätzlich entweder auf einem positionellen oder auf einem funktionalen Ansatz basieren.

Voraussetzung für den funktionalen Ansatz sind Kenntnisse über möglicherweise an der Ausprägung eines Merkmals oder einer Krankheit beteiligte Proteine und Kenntnis der für diese Proteine codierenden Gene. Die auf diesem Weg identifizierten Kandidatenge-ne könKandidatenge-nen dann mit entsprechenden Methoden auf MutatioKandidatenge-nen untersucht werden.

Der positionelle Ansatz beruht auf der Eingrenzung eines Genom-Bereiches, innerhalb dessen die Mutation mit einer hohen Wahrscheinlichkeit zu finden ist. Üblicherweise erfolgt diese Eingrenzung über die Identifizierung bestimmter Markersequenzen, die innerhalb einer Rasse mit dem Merkmal oder der Erkrankung gekoppelt vererbt werden.

Mögliche Markersequenzen sind kartierte Mikrosatelliten oder SNPs. Bei Hunden sind Rekombinationen innerhalb von Rassen äußerst selten. So lassen sich mit der beschrie-benen Methode Haplotypen mit drei bis fünf Allelen je Genort identifizieren, die sich teilweise über sehr lange Entfernungen erstrecken. Bruchstücke dieser Haplotypen mit einer Länge von ca. 100 000 Basenpaaren stimmen oft in mehreren Rassen überein.

Über die vergleichende Analyse einer definierten Zusammenstellung von Markern an reinrassigen Hunden und Kreuzungshunden lässt sich die Länge der mit dem Merkmal oder der Erkrankung assoziierten Haplotypen auf einige 1000 Basenpaare eingrenzen.

Innerhalb dieses Bereiches kann anschließend per Sequenzanalyse und durch Verglei-che mit homologen DNA-Regionen bei anderen Spezies nach mögliVerglei-chen Kandidatengenen und nach Mutationen gesucht werden (Holmes 1994; Lindblad-Toh et al. 2005; Parker und Ostrander 2005).

Ein weiteres Verfahren, das am ehesten zu den funktionellen Strategien gezählt werden kann, ist die Identifizierung von Genombereichen, die Mutationen enthalten könnten, mithilfe von Subtraktionsbibliotheken. Unter Anwendung einer als SSH (suppression subtractive hybridization) bezeichneten Methode (Diatchenko et al. 1996) werden zwei Subtraktionsbibliotheken erstellt. Eine der Bibliotheken enthält cDNA-Fragmente, die bei Merkmalsträgern in größerer Häufigkeit vorliegen als bei Nichtmerkmalsträgern.

Die zweite Subtraktionsbibliothek enthält cDNA-Fragmente, die bei Nichtmerkmalsträ-gern in größerer Häufigkeit vorliegen als bei MerkmalsträNichtmerkmalsträ-gern (Zhang et al. 1998).

Vereinfacht umfassen die einzelnen Schritte zur Erstellung von

Subtraktionsbibliothe-ken

- die Generierung von cDNA aus einer geeigneten Gewebeprobe eines Merkmalsträ-gers und eines NichtmerkmalsträMerkmalsträ-gers (besonders geeignet sind Gewebe, in denen eine mit dem zu untersuchenden Merkmal zusammenhängende unterschiedliche Ex-pression von mRNA bei Merkmalsträger und Nichtmerkmalsträger zu erwarten ist), - eine anschließende Restriktionsspaltung zur Herstellung von cDNA-Fragmenten

von einer amplifizierbaren Größe,

- die Ligation eines Aliquots A der cDNA-Fragmente des Merkmalsträgers mit einem Adapter 1 sowie eines zweiten Aliquots B der cDNA-Fragmente des Merkmalsträ-gers mit einem Adapter 2,

- die Mischung von Aliquot A1 mit Aliquot B2 und einem Aliquot C der cDNA-Fragmente des Nichtmerkmalsträgers

- sowie eine Denaturierung und anschließende Hybridisierung der cDNA-Einzelstränge.

Bei dieser Hybridisierung ergeben sich verschiedene Typen von cDNA-Molekülen, un-tere A1 und B1 Einzelstränge hybridisieren mit oberen A1 und B2 Einzelsträngen sowie mit oberen C Einzelsträngen, die übereinstimmende Sequenzen aufweisen. Durch die übereinstimmenden oberen C-Einzelstränge werden obere A1 und B2 Einzelstränge derjenigen cDNA-Fragmente verdrängt, die bei Merkmals- und Nichtmerkmalsträgern übereinstimmen. Eine Hybridisierung von A1 mit B2 Einzelsträngen findet bei cDNA-Fragmenten des Merkmalsträgers, die keine Übereinstimmung mit cDNA-Fragmenten des Nichtmerkmalsträgers aufweisen häufiger statt als bei cDNA-Fragmenten, die Überein-stimmungen mit Fragmenten des Nichtmerkmalsträgers aufweisen. Bei einer Amplifikation mit Primern, die spezifisch mit Adapter 1 bzw. Adapter 2 hybridisieren, werden also überwiegend cDNA-Fragmente amplifiziert, für die keine übereinstimmen-den Hybridisierungspartner in der cDNA des Nichtmerkmalsträgers vorliegen, und die daher eine erhöhte Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen relevanter Mutationen aufwei-sen. Auf diesem Weg lassen sich nur abweichende cDNA-Fragmente aus tatsächlich exprimierten Transkripten identifizieren. Eine Mutation, die zur vollständigen Deletion eines Transkriptes führt, bleibt bei diesem Vorgehen unerkannt. Solche Mutationen

können bei einer Umkehrung der Vorgehensweise identifiziert werden, indem die Adap-ter an zwei Aliquots der normalen cDNA-Fragmente ligiert werden und bei einer PCR mit den entsprechenden Primern vorrangig cDNA-Fragmente amplifiziert werden, für die keine übereinstimmenden Hybridisierungspartner aus der cDNA des kranken Hun-des existieren.

Die mit dieser Methode amplifizierten Fragmente werden kloniert und in Subtraktions-bibliotheken archiviert. Durch systematische Sequenzierung der einzelnen DNA-Abschnitte und Vergleich mit der entsprechenden Sequenz normaler Vergleichshunde können Mutationen gefunden werden.

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3 Monogene Erbmerkmale des Hundes: Phänotyp, genetischer Hintergrund,