Isolierung von DNA

Jede einzelne kernhaltige Zelle eines Organismus enthält das vollständige Genom, also die Gesamtheit der genetischen Information eines Organismus. Das haploide canine Genom umfasst laut Schätzungen 2,4 x 10⁹ bp (Lindblad-Toh et al. 2005). Der überwie-gende Anteil des Genoms ist im Zellkern lokalisiert, allerdings enthalten auch Mitochondrien DNA. Das mitochondriale Genom des Hundes ist vollständig sequen-ziert und umfasst 16728 bp (NCBI-Sequence: NC_002008) (Kim et al. 1998).

Als Ausgangsmaterial für die Isolierung genomischer DNA sind grundsätzlich alle Prä-parate geeignet, die kernhaltige Zellen enthalten. Typische Materialien sind Gewebeproben, Schleimhautabstriche, Blut, Sperma oder Haare. Üblicherweise werden zunächst durch Inkubation des Ausgangsmaterials mit geeigneten Enzymen oder Rea-genzien alle Substanzen außer der DNA lysiert. So werden Zellwände und Kernmembranen zerstört und die DNA befindet sich frei im Medium. Die Isolierung der

DNA von den übrigen Substanzen des Mediums erfolgt unter Nutzung spezifischer Zentrifugations- und Bindungseigenschaften von Nukleinsäuren gegenüber anderen Verbindungen. Geeignete Protokolle finden sich bei Schrimpf (2002) und bei Ausubel et al. (1993).

Für den Nachweis einer Mutation in mitochondrialer DNA ist es unter Umständen von Interesse, reine Mitochondrien-DNA zu isolieren. Die DNA des Zellkerns enthält ein-zelne gleichmäßig verteilte mitochondriale Sequenzfragmente (mitochondriale Pseudogene) (Woischnik und Moraes 2002). Dadurch besteht das Risiko, bei einer PCR mit dem Ziel der Amplifikation eines bestimmten Abschnitts mitochondrialer DNA ungewollt Teile der Zellkern-DNA zu amplifizieren. Um dieses Problem zu umgehen, kann entweder die Länge des zu amplifizierenden DNA-Abschnitts erweitert werden (Li et al. 2006), oder man arbeitet mit reiner mitochondrialer DNA.

Die Isolierung mitochondrialer DNA erfolgt per Zerstörung der Zellwände, beispiels-weise durch den Einsatz von Zymolase in Verbindung mit mechanischer Bearbeitung durch Schütteln und gegebenenfalls Ultraschallbehandlung, und anschließende Tren-nung der Mitochondrien von Zellmaterial und Zellkernen. Dabei macht man sich die spezifischen Zentrifugationseigenschaften von Mitochondrien zunutze. Die anschlie-ßende Isolierung der DNA aus den Mitochondrien erfolgt mit ähnlichen Methoden wie bei der Isolierung genomischer DNA (Defontaine et al. 1991).

2.3.2 Polymerasekettenreaktion (PCR)

Das Prinzip der Polymerasekettenreaktion (PCR), einem um die Mitte der 80er Jahre entwickelten Verfahren zur Vervielfältigung spezifischer DNA-Fragmente (Saiki et al.

1985; Mullis und Faloona 1987), beruht auf der Nachahmung der Vorgänge bei der na-türlichen Replikation. Es werden Oligonukleotide (Primer) konstruiert, die an die ersten Basen des Matrizenstranges des zu amplifiziernden Fragments in Leserichtung bzw. an die letzten Basen des Fragments in revers komplementärer Richtung binden.

Eine DNA-Menge zwischen 0,1-1,0 µg wird mit einer entsprechenden Menge Primer, einer entsprechenden Menge der vier Desoxynukleotide (kurz: dNTPs), aus denen die DNA zusammengesetzt ist (Desoxyadenosintriphosphat, Desoxyguanosintriphosphat, Desoxycytosintriphosphat und Desoxythymintriphosphat), und DNA-Polymerase in

einem Puffer inkubiert. Die Amplifikation erfolgt im Verlauf von zyklisch wiederhol-ten, gezielten Temperaturwechseln. In einem Denaturierungsschritt bei einer Temperatur zwischen 90°C und 94°C werden die Doppelstränge der DNA denaturiert.

Für den anschließenden Hybridisierungsschritt wird die Reaktion in auf eine Tempera-tur von ≥50°C abgekühlt. Dabei richtet sich die Temperatur nach der Sequenz der verwendeten Primer mit dem Ziel, optimale Bedingungen für die Anlagerung der Pri-mer am Matrizenstrang und am revers komplementären Strang zu schaffen. Dieser Vorgang wird auch als Annealing bezeichnet. Im Extensionsschritt bei einer Temperatur von üblicherweise 72°C werden, katalysiert durch die Polymerase, die hybridisierten Primer durch Anlagerung von komplementären Nukleotiden am Matrizen- bzw. am revers komplementären Strang entlang verlängert. Der Ablauf dieser drei Schritte wird als PCR-Zyklus bezeichnet. Es werden so viele Zyklen durchgeführt, bis die erwünschte Anzahl an Kopien hergestellt ist (Schrimpf 2002).

Die genaue Menge der einzelnen Komponenten des PCR-Ansatzes, die genaue Annea-lingtemperatur, die Dauer der einzelnen Schritte und die Anzahl benötigter Zyklen hängt unter anderem von bestimmten Eigenschaften des zu amplifiziernden Fragments und der Primer, von der Art der verwendeten Polymerase und zahlreichen weiteren Voraussetzungen ab und muss daher stets an die jeweiligen Bedingungen angepasst werden.

2.3.3 Elektrophorese

Die Elektrophorese dient der Bestimmung der Größe einzelner DNA-Fragmente und der Sortierung von unterschiedlich großen Fragmenten in einer Probe. Bei der Gele-lektrophorese, dem gebräuchlichsten Verfahren, werden die zu untersuchenden Proben nebeneinander in die Taschen eines porösen Gels aus Agarose oder Polyacrylamid gela-den. Das Gel befindet sich in einer Elektrophoresekammer und wird von einem geeigneten flüssigen Medium, meist TBE- (Tris-Borat-EDTA-) Puffer, umgeben. An das so vorbereitete Gel wird ein elektrisches Feld angelegt. Da DNA-Moleküle negativ geladen sind, wandern sie innerhalb dieses Feldes durch die Poren des Gels zur Katho-de. Die Geschwindigkeit der einzelnen Moleküle hängt dabei von ihrer Größe im Verhältnis zur Porengröße ab: kleine Moleküle wandern schneller als große Moleküle.

Moleküle derselben Größe wandern mit derselben Geschwindigkeit und bilden im Gel

Banden. Wird die Wanderung nach einer gewissen Zeit durch Aufhebung des elektri-schen Feldes unterbrochen, befinden sich größere Moleküle in Banden in der Nähe der Anode, während kleinere Moleküle in Banden in der Nähe der Kathode lokalisiert sind.

Durch den Zusatz von Ethidiumbromid, das sich an die Wasserstoffbrücken zwischen den Basenpaaren anlagert und unter UV-Licht fluoresziert, lassen sich die einzelnen Banden visualisieren. Die Größenbestimmung der Banden erfolgt anhand von bekann-ten Standardmarkern, die mit auf das Gel aufgetragen werden (Mülhardt 2000;

Schrimpf 2002).

2.4 Genotypisierungsverfahren