Allelspezifische PCR (ASP)

Bei diesem Verfahren werden zwei Primerpaare konstruiert, von denen eines nur an das mutierte und das andere nur an das Wildtypallel bindet. Diese Spezifität der Primer be-ruht auf dem letzten Nukleotid am 3’-Ende der Primer. Die zu untersuchenden Proben werden in zwei verschiedenen Ansätzen unter Verwendung jeweils eines der Primerpaa-re amplifiziert. Bei Proben von homozygot normalen Individuen wird nur bei Einsatz des für das Wildtypallel spezifischen Primerpaares ein Fragment amplifiziert. Bei Pro-ben von homozygot mutierten Individuen wird nur unter Verwendung des für das mutierte Allel spezifischen Primerpaares ein Fragment amplifiziert. Bei heterozygoten Individuen erfolgt mit beiden Primerpaaren eine erfolgreiche Amplifikation. Weitere Bezeichnungen für dieses Verfahren sind ARMS (amplification refractory mutation system – System der amplifizierungsresistenten Mutation), PASA (PCR-Amplifikation spezifischer Allele) oder ASA (allelspezifische Amplifikation) (Newton und Graham 1997).

2.4.2 Sequenzierung

Eine Möglichkeit zur Genotypisierung ist die Amplifikation des zu untersuchenden DNA-Abschnitts mit anschließender Sequenzierung. Für die Aufbereitung der zu se-quenzierenden Proben sind in den gängigen Laborhandbüchern unterschiedliche Methoden beschrieben worden.

Die verschiedenen Methoden zur Sequenzierung beruhen auf der Erzeugung einer ho-hen Anzahl von unterschiedlich vollständigen Kopien des zu sequenzierenden Fragments. Ein geringer Teil dieser Kopien entspricht dem gesamten zu sequenzieren-den DNA-Abschnitt. Die Sequenz der übrigen Kopien beginnt stets am ersten Nukleotid des 5’-Endes und endet an unterschiedlichen Positionen innerhalb des zu sequenzieren-den Fragments, so dass ein Gemisch von Fragmenten vorliegt, die jede mögliche Länge zwischen der Gesamtlänge des zu sequenzierenden Fragments und weinigen Nukleoti-den repräsentieren. Per Elektrophorese gelingt es, die einzelnen Fragmente dieses Gemischs auf eine Basenlänge genau nach Größe geordnet in diskreten Banden zu sepa-rieren. Mit unterschiedlichen Methoden wird sichergestellt, dass die jeweils letzten Nukleotide am 3’-Ende der einzelnen Fragmente eindeutig bestimmt werden können. So lässt sich die Sequenz des gesamten DNA-Abschnitts von der kürzesten über die jeweils um ein Nukleotid längeren Fragmente bis zum längsten Fragment ablesen (Gassen und Minol 1996).

Zur Erzeugung der unterschiedlich langen Fragmente und zur Bestimmung der Nukleo-tide am 3’-Ende der Fragmente sind verschiedene Vorgehensweisen beschreiben worden, die in chemische und enzymatische Verfahren unterteilt werden können. Bei chemischen Sequenzierungsmethoden nach Maxam und Gilbert (Maxam und Gilbert 1977; Maxam und Gilbert 1980) werden ³²P-markierte Einzelstränge des zu sequenzie-renden Fragments hergestellt und in vier Aliquots aufgeteilt. Jedes dieser Aliquots wird mit einer Chemikalie behandelt, die spezifisch an einem der vier Nukleotide der DNA eine Spaltung herbeiführt. So wird sichergestellt, dass die unterschiedlich langen Spalt-produkte des zu sequenzierenden Fragments in jedem der vier Aliquots jeweils mit demselben Nukleotid enden. Die Aliquots werden nebeneinander auf ein Elektrophore-segel geladen, elektrophoretisch nach Größen sortiert und per Autoradiographie visualisiert (Gassen und Minol 1996).

Eine weitere, zur selben Zeit entwickelte Methode ist die Kettenabbruchmethode nach Sanger (Sanger et al. 1977), die die Basis aller heutzutage üblichen Sequenzierverfahren darstellt. Die zu sequenzierende DNA wird denaturiert, mit einem Primer hybridisiert und dieser mit Hilfe einer Polymerase verlängert, ähnlich wie bei der PCR. Zusätzlich zu den vier üblichen 2’-Desoxynukleotiden enthält der Ansatz allerdings auch noch eine gewisse Menge eines fünften Nukleotids, das sich insofern von den anderen

unterschei-det, als ihm am dritten C-Atom der Ribose die notwendige Hydroxylgruppe fehlt, an die üblicherweise das nächste Nukleotid geknüpft wird. Wird statt eines dNTPs ein solches 2’,3’-Didesoxynukleotid (ddNTP) eingebaut, kann der Strang nicht weiter verlängert werden. Der Einbau von dNTPs und ddNTPs erfolgt zufällig. Die neuen DNA-Stränge, die in diesem Ansatz synthetisiert werden, haben folglich sehr unterschiedliche Längen.

Das Didesoxynukleotid, das eingesetzt wird (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), be-stimmt, mit welcher Base die neu synthetisierten DNA-Fragmente enden.

Um bei den einzelnen synthetisierten DNA-Strängen zu unterscheiden, welches der vier möglichen Nukleotide am 3’-Ende vorliegt, existieren verschiedene Methoden. Eine Möglichkeit ist die Aufteilung jeder zu untersuchenden Probe in vier Aliquots und der Zusatz von jeweils einem der vier ddNTPs je Aliquot. Die Detektion der Fragmente erfolgt per radioaktiver Markierung oder alternativ mittels Silberfärbung oder über die Markierung mit Digoxigenin (Mülhardt 2000).

Bei neueren automatischen Sequenzierverfahren erfolgt eine Markierung der vier Dide-soxynukleotide mit vier unterschiedlichen Fluorophoren. Im Anschluss an die Sequenzierungs-PCR wird eine Kapillarelektrophorese durchgeführt. Die Kapillaren sind mit einem Polymer gefüllt und in einen Stromkreis eingeschlossen, so dass wie bei der Gelelektrophorese eine Wanderung der einzelnen PCR-Fragmente durch die Poren des Polymers herbeigeführt wird. Per Laserbestrahlung werden die Fluorophoren an den einzelnen PCR-Fragmenten angeregt und emittieren Licht einer spezifischen Wellen-länge. Während der Elektrophorese passieren die fluoreszenzmarkierten PCR-Fragmente ein Photometer, das die Abfolge der unterschiedlichen Fluoreszenzemissio-nen detektiert. Mit einer geeigneten Software zur Datenaufbereitung wird anhand dieser Informationen ein Chromatogramm erstellt, aus dem unter Verwendung spezieller Ana-lysesoftware schließlich die Basensequenz der Matrizen-DNA berechnet wird (Mülhardt 2000).

2.4.3 Pyrosequenzierung

Diese Methode basiert auf der Detektion von während der DNA-Synthese freigesetzten Pyrophosphaten. Dazu wird das per PCR amplifizierte zu sequenzierende DNA-Fragment in einzelsträngiger Form mit den vier Enzymen DNA-Polymerase,

ATP-Sulfurylase, Luciferase und Apyrase sowie den Substraten Adenosin-5’-Phosphosulfat und Luciferin inkubiert. Im ersten Schritt wird eine begrenzte Menge eines bestimmten Desoxynukleotidtriphosphates zugegeben. Die Polymerase katalysiert den Einbau des Desoxynukleotids in den neuen DNA-Strang, sofern die zugegebene Base komplemen-tär zur Base des Matrizenstranges ist. Bei jedem Einbauvorgang wird eine bestimmte Menge an Pyrophosphat freigesetzt, die proportional zur Anzahl an eingebauten Nukle-otiden ist. Das freigesetzte Pyrophosphat reagiert unter der katalytischen Einwirkung von ATP-Sulfurylase mit Adenosin-5’-Phosphosulfat zu Adenosintriphosphat (ATP).

ATP setzt eine luciferasegesteuerte Umwandlung von Luciferin zu Oxyluciferin in Gang. Bei diesem Prozess wird Energie in Form von sichtbarem Licht freigesetzt. Die Menge des emittierten Lichtes ist proportional zur Menge des generierten ATP und da-mit zur Menge an eingebauten Nukleotiden. Die Menge an eda-mittiertem Licht lässt sich mithilfe einer speziellen Kamera in einem Pyrogramm aufzeichnen. Erfolgt kein Einbau des zugegebenen Nukleotids, wird kein Licht emittiert. Überschüssiges ATP und nicht-eingebaute Nukleotide werden durch Apyrase abgebaut. Nach vollständigem Abbau wird das nächste Nukleotid zugegeben und die beschriebenen Vorgänge wiederholen sich. Durch wechselweise Zugabe der vier verschiedenen Nukleotide, aus denen die DNA zusammengesetzt ist, lässt sich anhand des Pyrogramms Anzahl und Art der ein-gebauten Nukleotide und damit die Sequenz des zu untersuchenden DNA-Fragments bestimmen. Um falsch positive Signale bei Zugabe von Desoxyadenosintriphosphat zu vermeiden, wird ersatzweise Desoxyadenosin-alpha-Thiotriphosphat verwendet, das zwar durch die Polymerase effizient in die DNA eingebaut wird, von der Luciferase jedoch nicht genutzt werden kann (Ronaghi et al. 1996).

2.4.4 Heteroduplexanalyse

Bei dieser Methode wird durch spezielle PCR-Bedingungen die Formation von Hetero-duplices aus einem mutierten und einem normalen DNA-Strang begünstigt. Diese DNA-Moleküle weisen aufgrund der Fehlpaarung in der mutierten Region eine abwei-chende Konformation auf und migrieren daher in einer Elektrophorese deutlich langsamer als mutierte oder normale Homoduplices. Bei der Konformationsänderung handelt es sich nach einer Theorie von Ganguly et al. (1993) um einen Knick, der durch eine asymmetrische Verschiebung der fehlgepaarten Basen entsteht, indem eine der Basen in der Helix verbleibt, während die andere aus der Helix herausgedreht wird. Da

Heteroduplices nur bei heterozygoten Individuen entstehen können, ist diese Methode zur Identifizierung heterozygoter Defektträger geeignet, nicht aber zur Unterscheidung zwischen homozygot normalen und homozygot mutierten Individuen. Eine solche Un-terscheidung kann durch die Untersuchung dreier Aliquots je Probe erreicht werden.

Dabei wird das erste Aliquot mit der Probe eines homozygot defekten Individuums vermischt und das zweite Aliquot mit der Probe eines homozygot normalen Indivi-duums. Das dritte Aliquot wird pur analysiert. Bei homozygot normalen Individuen ergibt die Untersuchung des ersten Aliquots Heteroduplices, beim homozygot defekten Individuum treten hingegen im zweiten Aliquot Heteroduplices auf.