Die Steroidhormonkonzentrationen in der Follikelfüssigkeit üben einen wichtigen Einfluss auf die normale Entwicklungs- und Befruchtungsfähigkeit von Eizellen aus (HAZALEGER et al. 1995). Zunächst liegt während der Follikelreifung eine Östrogendominanz vor. Durch den LH-Einfluss kurz vor der Ovulation wird mit beginnender Luteinisierung der Follikelzellen die Progestronsynthese induziert und die Östrogensynthese herabreguliert (RICHARDS 1994). Im Follikel produzieren hauptsächlich die Granulosazellen die Steroidhormone, aber auch die Kumuluszellen sind in der Lage 17β-Estradiol und Progesteron zu sezernieren. Die Steroidhormonproduktion in den Kumuluszellen wurde als Parameter gewählt, um den Einfluss der Eizelle auf die Follikelentwicklung näher zu untersuchen, da die Kumuluszellen als erste Zielzellen der Beeinflussung durch die Eizelle am intensivsten ausgesetzt sind.
3.3.1 Einfluss der MAPK
Publikation 4: Steroidogenesis and the influence of MAPK activity during in vitro maturation of porcine cumulus oocyte complexes.
Bevor der Einfluss der Oozyte auf die Steroidhormonproduktion in den sie umgebenden Kumuluszellen untersucht wurde, wurde in dieser Studie die Steroidgenese an sich und eine mögliche Abhängigkeit von der Aktivität der MAPK in den Kumuluszellen während der IVM von porcinen KOKs untersucht. Gruppen von jeweils 20 KOKs wurden für 0, 5, 26 oder 46 Stunden mit und ohne Zusatz des MEK-Inhibitors U0126 in vitro maturiert. Im Anschluss wurde die Phosphorylierung der MAPK in den Kumuluszellen und Oozyten untersucht und die Konzentrationen von 17β-Estradiol und Progesteron im Medium bestimmt. Mittels RT(reverse transcriptase)-PCR und anschließender semiquantitativer Auswertung wurde die mRNA-Expression der steroidalen Enzyme StAR, Cyp11A1, 3β-HSD und Cyp19A1 analysiert. Das StAR Protein vermittelt den Transport des Substrates Cholesterin von der äußeren zur inneren mitochondrialen Membran. Cyp11A1 ist das kodierende Gen für das cytochrome P450 cholesterol side-chain cleavage enzyme, welches Cholesterin zu Pregnenolon umsetzt. Im Anschluss wird Pregnenolon durch die 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3β-HSD) in Progesteron umgewandelt. Durch die P450 Aromatase, das Protein des Genes Cyp19A1, wird aus Testosteron 17β-Estradiol gebildet (Übersicht Steroidhormonsynthese s. Abb. 4).
Im Immunoblot konnte der Verlauf der Phosphorylierung der MAPK in Kumuluszellen und Oozyten bestätigt werde. Durch den Hemmstoff U0126 wurde die Aktivität der MAPK in den Oozyten komplett gehemmt. In den Kumuluszellen wurde die MAPK nur nach 0 und 5 Stunden komplett gehemmt. Nach 26 h war eine schwache Phosphorylierung festzustellen und nach 46 h sogar eine deutlichere als nach der Kultivierung ohne Hemmstoff. Nach 5stündiger Kultivierung hatte sich die 17β-Estradiolkonzentration im Medium noch nicht verändert (0 h: 0,4 ng/ml; 5 h: 1,6 ng/ml). Nach 26 h IVM war sowohl mit als auch ohne U0126 ein deutlicher Anstieg zu beobachten (ohne U0126: 9,0 ng/ml;
mit U0126: 6,5 ng/ml). Ohne den MEK-Inhibitor sank die 17β-Estradiolkonzentration nach 46 h auf 5,4 ng/ml, mit U0126 hingegen stieg die Konzentration nach 46 h weiter auf 10,3 ng/ml an. Die Progesteronkonzentration im Medium war unabhängig vom
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Hemmstoffeinsatz während der ersten 26 h sehr niedrig (16,0-61,0 ng/ml). Zwischen 26 und 46 Stunden stieg die Progesteronkonzentration im Medium jedoch um das ungefähr neunfache auf 565,5 ng/ml an. Diese vermehrte Sekretion wurde durch den MEK-Inhibitor deutlich gehemmt (46 h mit U0126: 39,0 ng/ml).
Bei der mRNA-Expression von StAR und Cyp11A1 konnte kein Einfluss des U0126 beobachtet werden. Die Expression von StAR nahm zwischen 5 und 26 h deutlich zu und blieb auch nach 46 h auf diesem Niveau. Die Expression von Cyp11A1 blieb während der ganzen Kultivierungszeit weitestgehend unverändert. Die Hemmung der MAPK beeinflusste aber die mRNA-Expressionen von 3β-HSD und Cyp19A1. Die Expression des 3β-HSD wurde durch den Einsatz des Hemmstoffes bei allen Untersuchungszeitpunkten reduziert. Somit wurde auch der Anstieg zwischen 26 und 46 Stunden verhindert. Das Cyp19A1 wurde nach fünfstündiger IVM am stärksten exprimiert. Durch die Kultivierung mit dem MEK-Inhibitor wurde die Expression nach 5 h leicht reduziert, aber nach 26 und 46 h stiegen die mRNA-Levels unter der Wirkung des U0126 deutlich an.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die MAPK an der Steroidhormonproduktion von porcinen Kumuluszellen beteiligt ist. Während der In-vitro-Maturation wird der Wechsel von anfänglicher 17β-Estradiolsynthese zur Progesterondominanz am Ende der Reifung durch die Regulation der Expression von 3β-HSD und Cyp19A1 gesteuert. Für diesen Vorgang ist die Aktivität der MAPK erforderlich. Die MAPK ist somit an der Einleitung der Luteinisierung beteiligt.
3.3.2 Wirkung von BMP-6
Publikation 5: Bone morphogenetic protein-6 (BMP-6): mRNA expression and effect on steroidogenesis during in vitro maturation of porcine cumulus oocyte complexes.
Das bone morphogenetic protein-6 (BMP-6) ist ein potentieller oocyte-secreted factor. Die Zugabe von BMP-6 zu Granulosazellkulturen bewirkt eine Reduzierung der Progesteronproduktion. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von BMP-6 als möglichen von der Oozyte serzernierten Faktor auf die Steroidhormonsynthese in porcinen Kumuluszellen während der IVM zu untersuchen. Weiterhin sollte geklärt werden, ob die Wirkung des BMP-6 über die MAPK vermittelt wird. Dafür wurden KOKs aus Ovarien von Schlachtschweinen für 0, 5, 26 und 46 Stunden in vitro maturiert. Im Anschluss wurden im Medium die Konzentrationen von 17β-Estradiol und Progesteron gemessen. In den Kumuluszellen wurde die Expression von den steroidalen Enzymen StAR, 3β-HSD und Cyp19A1 semiquantitativ mittels RT-PCR analysiert und die Phosphorylierung der MAPK im Immunoblot bestimmt. Weiterhin wurde die BMP-6 mRNA-Expression in den Kumuluszellen und Oozyten untersucht. Um den Einfluss der Oozyte untersuchen zu können, wurden die gleichen Versuche auch mit Kumuluskomplexen (KKs) ohne Oozyten durchgeführt. Die Oozyten wurden jeweils vor der Kultivierung aus den KOKs entfernt. In einem dritten Versuchsansatz wurden dann KKs untersucht, bei denen während der Kultivierung BMP-6 dem Medium zugesetzt worden war (KKs +BMP-6).
Eine Expression von BMP-6 konnte in den Kumuluszellen und in den Oozyten nach jeder Kultivierungszeit nachgewiesen werden. Bei beiden Zelltypen war nach 5stündiger IVM die mRNA-Expression am höchsten. Nach einer Kultivierungsdauer von 5 h konnte bei der 17β-Estradiolsekretion weder ein Einfluss durch die Oozyte noch durch die Zugabe von BMP-6 beobachtet werden. Nach 26 h IVM war in den beiden Kulturen ohne Oozyten (KKs: 5,5 ng/ml; KKs + BMP-6: 4,1 ng/ml) weniger 17β-Estradiol vorhanden als in der Kultur mit Oozyten (KOKs: 9,0 ng/ml). Die Supplementation von BMP-6 konnte jedoch nach 46stündiger Kultivierungsdauer die Reduktion der 17β-Estradiolsekretion, die durch das Fehlen der Oozyte hervorgerufen wurde, wieder ausgleichen. Die 17β-Estradiolkonzentration im Medium betrug nach der IVM von KOKs 5,4 ng/ml und nach der Kultur von KKs 3,0 ng/ml. Durch die Zugabe von BMP-6 zu den KKs konnte die
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Konzentration auf 6,6 ng/ml erhöht werden. Im Gegensatz zum 17β-Estradiol wurde die Progesteronproduktion durch die Entfernung der Oozyten nicht beeinflusst. Bei allen drei Versuchsansätzen bewegten sich die Progesteronkonzentrationen im Medium zu den Zeitpunkten 0 h, 5 h und 26 h zwischen 0 und 124,2 ng/ml. Erst nach 46stündiger Kultivierung stiegt die Progesteronkonzentration in allen drei Versuchsgruppen deutlich an (KOKs: 565,5 ng/ml; KKs: 763,1 ng/ml; KKs + BMP-6: 684,8 ng/ml).
Die Expression der StAR und 3β-HSD Transkripte stieg während der IVM kontinuierlich an. Dabei konnte kein genereller Einfluss durch die Entfernung der Oozyte und/oder durch die Zugabe von BMP-6 beobachtet werden. Die Cyp19A1 Expression in den Kumuluszellen war bei der Kultivierung von KOKs nach 5 h am höchsten. In Kumuluszellen der KKs war die Expression von Cyp19A1 nach 5 h geringer, wenn auch nicht signifikant (P = 0,061). Die Zugabe von BMP-6 zum Maturationsmedium bewirkte eine sehr deutliche Steigerung der Cyp19A1 Transkription nach 5stündiger Kultivierung.
Auch nach 26 und 46 Stunden wurde Cyp19A1 in der Gruppe der KKs mit BMP-6 am stärksten exprimiert.
Die Phosphorylierung der MAPK in den Kumuluszellen stieg in allen drei Versuchsansätzen während der ersten fünf Stunden an. Nach 26 h wurde sie wieder etwas geringer. Nur in den Kumuluszellen aus der Kultur der Kumuluskomplexe mit BMP-6 blieb der Phosphorylierungsgrad auch nach 26 h noch relativ hoch. Nach 46stündiger Kultivierung war ein Einfluss durch die Entfernung der Oozyte unabhängig von der BMP-6 Supplementation zu beobachten. Die Phosphorylierung der MAPK war in den Kumuluszellen der KOKs niedriger als in denen von den KKs und den KKs mit BMP-6.
Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass BMP-6 ein potentieller oocyte-secreted factor ist. BMP-6 ist daran beteiligt, eine vorzeitige Luteinisierung zu verhindern, in dem es die 17β-Estradiolsynthese fördert. Diese Wirkung wird nicht über die MAPK vermittelt. Es wird angenommen, dass neben dem BMP-6 auch noch anderen Faktoren die Steroidhormongenese während der Eizell- und Follikelentwicklung regulieren.