In den beschriebenen Studien wurde die Rolle der MAPK für die Signalvermittlung während der Reifung von porcinen Kumulus-Oozyten-Komplexen untersucht. Die Versuche basierten darauf, dass die Aktivierung der MAPK anhand ihres Phosphorylierungsgrades zu bestimmten Zeitpunkten untersucht wurde. Mittels Inaktivierung der MAPK durch den MEK-Inhibitor U0126 wurden vor allem funktionelle Auswirkungen untersucht: Wird die Meiose von der Eizelle trotz Hemmung der MAPK wieder aufgenommen? Wie verändert sich die Steroidhormonproduktion? Gibt es Auswirkungen auf die Entwicklungskompetenz der Eizelle?
Es konnte gezeigt werden, dass die MAPK bei unterschiedlichen Prozessen von Bedeutung ist. Sie vermittelt den gonadotropin-induzierten GVBD. Dafür ist die Aktivierung der MAPK in den Kumuluszellen während der ersten Stunden der IVM von Bedeutung (Publikation 1). Weiterhin wirkt die MAPK mit bei der Steuerung der Steroidhormonproduktion in den Kumuluszellen. Durch die Aktivierung der MAPK wird die vermehrte Progesteronproduktion gegen Ende der Reifung eingeleitet und die Estradiolproduktion vermindert (Publikation 4). Die MAPK ist ebenfalls an der Aufrechterhaltung der Befruchtungsfähigkeit von Oozyten in der Metaphase II beteiligt.
Eine Reduktion der Aktivität der MAPK im Rahmen der Alterung von Metaphase II Oozyten korrelierte mit höheren Fragmentations- und Degenerationsraten nach parthenogenetischer Aktivierung (Publikation 3).
Die konkretere Signalvermittlung ober- und unterhalb der MAPK ist sehr komplex.
Einzelne Einflüsse sind schon geklärt (Abb. 5), aber es gibt noch genug offene Fragen. Die Aktivierungssysteme können parallel wirken, es gibt diverse Rückkoppelungsmechanismen und es besteht eine Abhängigkeit vom Entwicklungsstand der Zelle. In der Eizelle gibt es die Aktivierungskette Mos MEK MAPK p90rsk (SEGER u. KREBS 1995). Diese ist jedoch nicht als „einspurige Einbahnstraße“ zu verstehen. Es bestehen noch Alternativen zur Aktivierung. Zum Beispiel wird die MEK
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auch über die Kinasen Ras und Raf aktiviert. Weiterhin existieren Rückkopplungsmechanismen, u. a. auch vom MPF (GOTOH et al. 1991).
Abb. 5: : Wirkungsmechanismus der MAPK beim GVBD.
(Schema modifiziert nach LIANG et al. 2007)
Die Signalwege der MAPK in Kumulus- und Eizelle bei der Vermittlung der Wiederaufnahme der Meiose bei Säugetieren wurden vereinfacht schematisch dargestellt.
Zur besseren Übersicht wurden nur die wichtigsten Signalwege aufgezeichnet. Es existieren noch diverse bekannte und unbekannte Zwischenstufen und Rückkopplungsmechanismen.
cAMP= cyclisches Adenosinmonophosphat, cdc25= cell division cycle kinase 25, GVBD=
germinal vesicle breakdown, MAPK= mitogen-activated protein kinase, MEK= MAPK Kinase, Mos= MAPK-Kinase-Kinase, Produkt des c-mos Gens, MPF= M-phase promoting factor, Myt1= myelin transcription factor 1, p90rsk= protein 90 ribosomal S6 kinase, PDE3= Phosphodiesterase 3, PDE4= Phosphodiesterase 4, PKA= Proteinkinase A, PKC=
Proteinkinase C, Wee1= wee schottisch bzw. irisch umgangssprachlich für small
cAMP PKA
In den Kumuluszellen kann die MAPK über mindestens zwei verschiedene Wege aktiviert werden. Unterhalb des Gonadotropin-Rezeptors kann das Signal über die cAMP-abhängige Proteinkinase A oder über die Proteinkinase C weitergeleitet werden (LIANG et al. 2007;
FAN et al. 2004). Die genauen Mechanismen von der Vermittlung des Gonadotropinsignals über den Rezeptor bis zur MAPK sind dabei noch nicht vollständig geklärt.
Die beschriebenen Untersuchungen zeigen, dass der Einfluss und die Wirkungsweise der MAPK von der Zellart abhängig sind. Der Unterschied zwischen Eizelle und Kumuluszelle bezüglich der MAPK zeichnet sich nicht nur durch die unterschiedlichen Phosphorylierungsmuster aus. In den Oozyten konnte die p90rsk der MAPK als mögliches Substrat zugeordnet werden. Die p90rsk wurde im gleichen Zeitraum wie die MAPK aktiviert und die Aktivierung der p90rsk konnte durch die Hemmung der MAPK verhindert werden (Publikation 2). In den Kumuluszellen allerdings wurde die p90rsk während der Reifung, sowohl in vitro als auch in vivo, nicht aktiviert und scheint somit dort keine Rolle als Substrat der MAPK zu spielen. Allerdings zeigten FAN und Mitarbeiter (2003) in den Kumuluszellen eine Aktivierung der p90rsk durch vermehrte Phosphorylierung ab 12stündiger IVM, die sich innerhalb der nächsten 12 h noch steigerte. Dieser Unterschied könnte auf unterschiedliche Zusätze zum Maturationsmedium beruhen.
Weiterhin unterscheidet sich der Einfluss des second messengers cAMP (cyclisches Adenosinmonophosphat) auf die MAPK (TSAFRIRI et al. 1996). In den Kumuluszellen bewirkt ein erhöhter cAMP-Spiegel die Aktivierung der MAPK und somit die Wiederaufnahme der Meiose durch die Eizelle. In Eizellen hingegen resultiert die Erhöhung der cAMP-Konzentration durch die Hemmung der Phosphodiesterase 3 in einer Verhinderung des GVBD (LIANG et al. 2005). Der anscheinend für den GVBD benötigte Abfall der cAMP-Konzentration in der Eizelle kann zum einen durch den vermehrten Umsatz in der Eizelle erreicht werden. Zum anderen werden aber auch durch die Aktivierung der MAPK in den Kumuluszellen die Proteine Connexin 43 und Connexin 37 vermehrt phosphoryliert. Bei Connexin 43 und Connexin 37 handelt es sich Strukturproteine in den gap junctions. Durch die Phosphorylierung wird der Austausch von
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cAMP zwischen den somatischen Zellen und zwischen den Kumuluszellen und der Eizelle unterbrochen (SELA-ABRAMOVICH et al. 2005; LIANG et al. 2007).
In der Publikation 5 wurde untersucht, ob die Wirkung des BMP-6 über die MAPK vermittelt wird. BMP-6 verhindert eine vorzeitige Luteinisierung der Kumuluszellen während der IVM. Für diese Wirkung müsste BMP-6 die MAPK inaktivieren. Die Ergebnisse zeigten jedoch, dass die Supplementation von BMP-6 zu Kulturen mit Kumuluskomplexen ohne Eizellen keinen Einfluss auf die MAPK hatte. Vielmehr bewirkte die Entfernung der Eizelle unabhängig von einer BMP-6-Zugabe eine Verhinderung der Dephosphorylierung der MAPK in den Kumuluszellen nach 46stündiger IVM. Auch bei Granulosazellkulturen mit Zellen von Ratten hatte BMP-6 keinen Einfluss auf die Aktivität der MAPK (MIYOSHI et al. 2007). Daraus kann man schließen, dass im Follikel BMP-6 die Steroidhormonsynthese in der Signalkaskade unterhalb der MAPK oder unabhängig von ihr beeinflusst. In den somatischen Follikelzellen scheint das BMP-6 über den Smad 1/5/8 Signalweg zu agieren (GLISTER et al. 2004; HUSSEIN et al. 2005).
Die vorliegenden Untersuchungen konnten Hinweise auf die Bedeutung des BMP-6 als möglichen oocyte-secreted factor (OSF) geben. In wieweit BMP-6 wirklich von der Eizelle sezerniert wird, ist jedoch noch nicht belegt. Es wurde zwar bereits in porciner Follikelflüssigkeit nachgewiesen (BRANKIN et al. 2005a), aber im Gegensatz zu anderen OSFs wie GDF-9 und BMP-15 wurde die Expression von BMP-6 nicht nur in der Eizelle, sondern auch in den somatischen Follikelzellen nachgewiesen (ZHU et al. 2008;
Publikation 5). Somit ist der Ursprung des BMP-6 in der Follikelflüssigkeit nicht eindeutig geklärt. Ein weiterer Beleg dafür, dass BMP-6 von der Oozyte sezeniert wird, wäre der Nachweis von BMP-6 im Medium gewesen. Die BMP-6-Konzentration im Medium hätte im Laufe der IVM der KOKs zunehmen müssen und bei der Kultivierung von Kumuluskomplexen ohne die Eizelle sollte dann keine oder nur eine sehr geringe Zunahme der BMP-6-Konzentration nachzuweisen sein. Dieser Nachweis wurde mittels Immunoblot versucht, aber er ist leider nicht gelungen. Lediglich der Zusatz des rekombinanten BMP-6 konnte im Medium nachgewiesen werden.