Die MAPK-Kaskade spielt eine Schlüsselrolle bei der Signalvermittlung während der Wiederaufnahme der Meiose durch die Oozyte. Um die Wirkung der MAPK in diesem Zusammenhang näher untersuchen zu können, wurden wie bei vielen anderen Fragestellungen zunächst Versuche unter In-vitro-Bedingungen durchgeführt. Für die Untersuchung von Vorgängen während der Eizellreifung bietet sich die In-vitro-Maturation (IVM) an. Es können dafür Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOKs) aus Ovarien von präpubertären Schlachtschweinen verwendet werden, so dass Tierversuche vermieden werden. Weiterhin wird durch die Verwendung von Schlachtorganen die Bereitstellung größerer Probenmengen, wie sie für die Proteinanalytik nötig sind, gewährleistet.
Allerdings kann nicht gänzlich auf die mit Tierversuchen verbundene In-vivo-Reifung verzichtet werden, da nur so überprüft werden kann, ob die unter In-vitro-Bedingungen gewonnenen Aussagen auf die physiologischen Verhältnisse übertragbar sind.
3.1.1 MAPK
Publikation 1: Mitogen-activated protein kinase phosphorylation patterns in pig oocytes and cumulus cells during gonadotropin-induced resumption of meiosis in vitro.
Ziel der Studie war es, das Phosphorylierungsmuster der MAPK sowohl in den Oozyten als auch in den Kumuluszellen näher zu charakterisieren. Die MAPK liegt in ihrem aktivierten Zustand im Vergleich zu ihrer inaktiven Form vermehrt phosphoryliert vor. Daher konnten vom Phosphorylierungsgrad der MAPK Rückschlüsse auf die Aktivität gezogen werden.
Zunächst wurden porcine KOKs für 0, 21, 25, 29 und 45 Stunden kultiviert. Im Anschluss wurde mittels Immunoblot die Phosphorylierung der MAPK in den Oozyten und
Kumuluszellen untersucht. Dabei wurden sowohl ein Antikörper gegen die phosphorylierte MAPK als auch ein Antikörper, der alle Formen der MAPK erkennt, eingesetzt.
In den Eizellen lag die MAPK zu Beginn der IVM zunächst unphosphoryliert vor. Nach 25stündiger Kultivierung waren ca. 50 % der MAPK phosphoryliert. Die Phosphorylierung der MAPK stieg dann weiter an, bis nach 45 Stunden fast die gesamte MAPK in den Oozyten phosphoryliert vorlag. Die beginnende Phosphorylierung korrelierte zeitlich mit dem GVBD. Nach 26 h IVM befanden sich ca. 82 % (n=149) der Eizellen in der Metaphase I. Bei der maximale Phosphorylierung/Aktivierung der MAPK hatten nach 45 h die meisten der Oozyten das Kernreifungsstadium der Metaphase II (ca. 87 %, n=119) erreicht. In den Kumuluszellen hingegen, war ein geringer Anteil der MAPK bereits schon vor der Kultivierung direkt nach der Isolierung aus dem Follikel aktiviert. Nach 21 h lag der höchste Phosphorylierungsgrad vor, welcher schon nach 25stündiger Kultivierung wieder deutlich abgenommen hatte. Nach 45 h IVM war die MAPK dann wieder annähernd komplett dephosphoryliert.
Diese Daten gelten für die gonadotropin-induzierte Maturation der Eizellen. Wurde auf den Zusatz der Hormone FSH und LH zum Maturationsmedium verzichtet, so verblieb die Mehrheit der Eizellen im Germinalvesikelstadium (nach 26 h: ca. 91 %, n=96; nach 46 h:
75 %, n=88) und nahm die Reifung nicht wieder auf. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, dass die Supplementation von FSH und LH nur in den ersten 10 Stunden der IVM für die Wiederaufnahme der Meiose notwendig ist. Wurde nur in dieser Zeit FSH und LH dem Maturationsmedium hinzugegeben, so hatten trotzdem nach 26 h ca. 83 % (n=81) der Eizellen den GVBD durchlaufen. Beim Vergleich der Aktivierung der MAPK in den Kumuluszellen nach nur 30minütiger und zweistündiger Kultivierung mit und ohne FSH und LH zeigte sich, dass nur mit den Gonadotropinen die Phosphorylierung der MAPK schon nach 30 Minuten deutlich anstieg. Ohne FSH und LH wurde die Phosphorylierung erst nach zwei Stunden deutlicher.
Um den Einfluss der MAPK auf die Eizellreifung näher bestimmen zu können, wurde diese mittels des MAPK-Kinase(MEK)-Inhibitors U0126 gehemmt. In den Eizellen wurde die MAPK durch den Zusatz des U0126 zum Medium vollständig gehemmt. Im Immunoblot konnte keine Erhöhung des Molekulargewichtes aufgrund vermehrter Phosphorylierung beobachtet werden. In den Kumuluszellen bewirkte der MEK-Inhibitor
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nur eine deutliche Reduktion der MAPK-Aktivität, vor allem in den ersten Stunden. Bei der IVM von KOKs wurde durch den Zusatz von U0126 die Wiederaufnahme der Meiose nach 26 h deutlich gehemmt, ca. 97 % der Eizellen verblieben im GV-Stadium (n=117).
Für die Vermittlung dieser Reifungshemmung des U0126 sind allerdings die Kumuluszellen nötig. Wurden KOKs für zunächst fünf Stunden ohne und dann für weitere 21 Stunden mit dem Hemmstoff inkubiert, so nahmen die Oozyten die Meiose nicht wieder auf (ca. 96 % im GV, n=84). Wenn man die Oozyten allerdings für den zweiten Inkubationsschritt mit dem U0126 denudierte, sprich die Kumuluszellen entfernte, so erreichten ca. 43 % die Metaphase I und sogar ca. 37 % die Metaphase II (n=67).
Diese Ergebnisse belegen die Rolle der MAPK bei der Signalvermittlung für die gonadotropin-induzierte Wiederaufnahme der Meiose durch die Oozyten. Dabei ist vor allem die schnelle Aktivierung der MAPK in den Kumuluszellen innerhalb der ersten Stunden der Reifung von Bedeutung.
3.1.2 p90rsk
Publikation 2: Phosphorylation pattern of the p90rsk and mitogen-activated protein kinase (MAPK) molecule: comparison of in vitro and in vivo matured porcine oocytes.
Die p90rsk ist das bekannteste Substrat der MAPK. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der p90rsk als Substrat der MAPK in Eizellen und Kumuluszellen während der Eizellreifung untersucht. Analog zur MAPK wird auch die p90rsk durch vermehrte Phosphorylierung aktiviert. Es wurde ein Antikörper verwendet, der alle Isoformen unabhängig vom Phosphorylierungsgrad erkennt. Durch eine vermehrte Phosphorylierung wird das Molekulargewicht der p90rsk erhöht. Dies wiederum bewirkt eine verkürzte Laufstrecke in der elektrophoretischen Auftrennung. Man spricht von einem sogenannten mobilityshift.
KOKs wurden für 22, 26, 30, 34 und 46 Stunden kultiviert und im Anschluss wurde die p90rsk in den Oozyten mittels Immunoblot analysiert. Nach einer IVM von 22 h lag die
p90rsk im Bereich von 90 kDa als Doppelbande vor. Nach 26 h wurde die Bande mit dem etwas geringeren Molekulargewicht schächer und nach 30 h war sie nicht mehr sichtbar.
Die obere Bande hingegen nahm in ihrer Intensität bis 30 h zu. Nach 34- und 46stündiger Kultivierung waren die beiden ursprünglichen Banden nicht mehr vorhanden, sondern nur noch eine weitere mit einem leicht höheren Molekulargewicht. Dieser mobilityshift während der In-vitro-Maturation ab 26 h bis 34 h gibt die vermehrte Phosphorylierung in dieser Zeit wieder. Diese Phosphorylierung wurde durch den Zusatz des MEK-Inhibitors U0126 zum Maturationsmedium komplett gehemmt. Dies spricht für die Aktivierung der p90rsk in den Oozyten durch die MAPK.
Weiterhin wurde versucht, nicht nur die Phosphorylierung sondern auch die eigentliche Aktivität der p90rsk direkt nachzuweisen. Dazu wurde ein kommerziell erhältlicher Kinase Assay Kit (S6 kinase assay kit, Upstate/Millipore, Schwalbach/Ts.) verwendet. Dieser Assay basiert darauf, die Aktivität der Kinase durch die Phosphorylierung eines bestimmten Substrates mit radioaktivem Phosphor darzustellen. Mit diesem Test konnte keine Zunahme der Aktivität festgestellt werden. Sie nahm sogar, wenn auch nicht signifikant, im Laufe der IVM etwas ab. Die dem Assay vorangeschaltete Immunopräzipitation der p90rsk war nicht spezifisch genug. Wahrscheinlich wurde mit dem Kinase Assay nicht die Aktivität der p90rsk, sondern die einer anderen S6 Kinase, der p70S6K, gemessen, deren Aktivität während der Eizellreifung abnimmt (SCHAB et al.
1999). Der Testkit wurde auch im Laufe der Versuche vom Hersteller von „S6 kinase assay kit“ in „p70S6K assay kit“ umbenannt.
Das Hauptanliegen dieser Studie war es jedoch zu überprüfen, ob die erhaltenen Ergebnisse aus der IVM mit den Vorgängen in vivo übereinstimmen. Dafür wurden weibliche Schweine im Schlachtalter mit eCG und hCG stimuliert. Die Ovarien wurden chirugisch nach 0, 22 und 30 Stunden nach der hCG-Injektion entfernt und im Anschluss die KOKs isoliert. Die Kernreifungsstadien dieser Eizellen stimmten mit denen aus der IVM in etwa überein. Zum Zeitpunkt 0 h befanden sich die Oozyten im GV-Stadium (in vitro: 99,1 % n=117; in vivo: 100 %, n=22). Nach 22stündiger Reifung befanden sich 35,5 % (n=93) der IVM Oozyten in der Metaphase I und bei den in vivo gereiften waren es 16,0 % (n=25). Nach 30 Stunden hatten jeweils um die 80 % (in vitro: n=81; in vivo: n=20) die Metaphase I erreicht. Die Zunahme des Phosphorylierungsgrads der p90rsk bei 30 h im
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Vergleich zu 22 h konnte bei der In-vivo-Reifung bestätigt werden. Allerdings lag hier die p90rsk in den Eizellen als Dimer vor, so dass die Banden der p90rsk bei etwas unter 200 kDa erschienen.
Die p90rsk wurde auch in den Kumuluszellen untersucht. Sowohl während der In-vitro-Reifung als auch bei In-vivo-In-vitro-Reifung lag die p90rsk stets als Monomer bei 90 kDa vor und wurde im Laufe der Maturation nicht weiter phosphoryliert.
Diese Untersuchung zeigt, dass die Phosphorylierung der p90rsk in den Oozyten während der Reifung zeitlich um den GVBD beginnt und beim Erreichen der Metaphase II in maximaler Form vorliegt. Weiterhin ist diese Phosphorylierung MAPK-abhängig. In den Kumuluszellen wird die p90rsk während der Eizellreifung jedoch nicht aktiviert. Sie scheint dort als Substrat der MAPK weniger von Bedeutung zu sein.
Die vivo-Versuche bestätigten die Phosphorylierungsmuster der p90rsk während der In-vitro-Maturation.