Spermauntersuchungen

3.4.3.1 Sperm chromatin structure assay (SCSA)

Bei dieser Methode werden Spermien mit intakter und nicht intakter Chromatinstruktur unterschieden. Dabei wird auf das Prinzip zurückgegriffen, dass vorgeschädigtes Chromatin leichter durch eine physikalische Noxe denaturierbar ist.

Die Zugabe einer Säure in die Spermiensuspension bewirkt, dass sich die Doppelhelix der DNS in ihre Einzelstränge aufteilt. Anschließend wird eine Färbung mit Akridinorange (AO) durchgeführt, wobei sich der Farbstoff an die DNS anlagert.

Die Fluoreszenz der Doppelstränge ist grün, die der Einzelstränge rot. Die Detektion des emittierten Lichts kann mit Hilfe eines Durchflusszytometers durchgeführt werden. Die Messung erfolgte nach dem von EVENSON und JOST (2000) beschriebenen Verfahren.

Bei den Messungen wurde das Durchflusszytometer FACScan^TM (Fa. Becton Dickinson, Heidelberg) verwendet. Das Gerät arbeitet mit einem luftgekühlten Argonlaser mit einer Wellenlänge von 488 nm und einer Leistung von 15 mW. Zur Auswertung standen drei Filter zur Auswahl: FL-1 (530/30 nm) für die grüne Fluoreszenz, FL-2 (585/42 nm) für die orange Fluoreszenz und FL-3 (650 LP nm) für die rote Fluoreszenz. Es wurden FL-1 und FL-3 verwendet. Die Analyse der Daten

fand mit Hilfe der Cellquest ^TM Software auf einem Power Mac G4-Computer (Apple Computer Inc.) statt.

Bei der Auswertung über Punktwolkendiagramme wurde für jedes Spermium der Anteil der Rotfluoreszenz an der Gesamtfluoreszenz (rote und grüne Fluoreszenz zusammen) berechnet. Dieser Wert wird als DFI-Wert (DNA Fragmentations Index) bezeichnet. Der DFI-Wert wird aus einem Verteilungshistogramm erstellt, wobei zwei Populationen unterschieden werden können: Die Hauptpopulation mit niedrigem DFI-Wert und eine kleinere Population mit hohem DFI-DFI-Wert (EVENSON et al. 2002).

Durch manuelles Einziehen einer Linie zwischen den erhöhten und niedrigen DFI-Werten konnte der Computer den prozentualen Anteil der Spermien mit erhöhtem DFI-Wert an der Gesamtpopulation errechnen. Dieser prozentuale Wert lässt eine Aussage über den Gesamtzustand der Chromatinstruktur der Probe zu.

3.4.3.2 FITC PNA/PI-Färbung

Bei dieser durchflusszytometrischen Methode werden die Spermien mit zwei verschiedenen Farbstoffen angefärbt. Der erste Farbstoff, Arachis hypogaea Lectin (Peanut Agglutinin, kurz PNA), ist dabei an Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC) gebunden und detektiert den akrosomalen Status der Spermien. PNA geht eine Verbindung mit Spermien ein, deren Akrosom reagiert hat (CHENG et al. 1996) und emittiert nach Anregung durch den Laser grünes Licht. Der zweite Farbstoff, Propidiumjodid (PI), bindet an die DNS, ist aber nicht membranpermeabel (GARNER et al. 1994). Somit färbt dieser Farbstoff den Zellkern von Zellen an, deren Membran geschädigt ist. Er fluoresziert dann rot. Dadurch kann nach dieser kombinierten Färbung zwischen vier Populationen unterschieden werden:

- Spermien mit intakter Plasmamembran und intaktem Akrosom: fluoreszieren nicht (SP1)

- Spermien mit geschädigter Plasmamembran und intaktem Akrosom: fluoreszieren rot (SP2)

- Spermien mit geschädigter Plasmamembran und geschädigter Akrosommembran:

fluoreszieren rot mit grüner Kopfkappe (SP3)

- Spermien mit intakter Plasmamembran und geschädigter Akrosommembran:

fluoreszieren mit grüner Kopfkappe (SP4)

Dargestellt auf einem Punktwolkendiagramm können die vier Populationen voneinander unterschieden werden. Die verschiedenen Anteile werden in Prozent ausgedrückt. Die Summe von SP1 und SP4 gibt die gesamten membranintakten Spermien, die Summe aus SP3 und SP4 die gesamten Spermien mit positiv akrosomalen Status an. Um die Induzierbarkeit der Akrosomreaktion zu testen, wird das Calcium-Ionophor A23187 verwendet.

Bei dem verwendeten Durchflusszytometer handelte es sich um ein Cell Lab Quanta^TM SC (Fa. Beckmann Coulter, Krefeld). Auch dieses arbeitet mit einem Argonlaser bei einer Wellenlänge von 488 nm und es wurden auch die Filter Fl-1 (grüne Fluoreszenz) und FL-3 (rote Fluoreszenz) verwendet. Die Daten wurden über das dazugehörige Software-Programm Cell Lab Quanta^TM SC MLP bearbeitet und ausgewertet. Die morgens gewonnenen Spermaproben wurden mit Magermilchverdünner (INRA 82) auf eine Dichte von 50 Millionen Spermien pro Milliliter verdünnt und nachmittags ausgewertet. Zunächst wurden 5 µl der Probe mit 485 µl HBS vermischt. Diese Suspension wurde erst mit 7,5 µl PNA, dann mit 2,5 µl PI versetzt und 10 Minuten inkubiert, um anschließend gemessen zu werden. Bei der Akrosominduktion werden vor der Farbstoffzugabe 3,5 µl des Ca-Ionophors A23187 hinzu gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 15 Minuten bei 37°C unter Lichtausschluss wird dann verfahren, wie bei der normalen FITC PNA/PI-Färbung und -Messung. Parallel wird noch eine Kontrollgruppe ohne Ca-Ionophor inkubiert und gemessen. Nach 24 Stunden wurden Rückhalteproben erneut auf ihre Membran- und Akrosomintaktheit gemessen, um den Alterungsprozess der Membranen beurteilen zu können.

3.4.3.3 Bestimmung der Spurenelementgehalte

Die Bestimmung der Gehalte von Selen, Zink und Eisen im Ejakulat (in nmol/g und nmol/ml), im Seminalplasma (in nmol/g und nmol/ml) und in den Spermien (in nmol/g und nmol/Mrd. Samenzellen) erfolgte aus den in flüssigem Stickstoff konservierten Nativproben. Diese wurden zur Auswertung in einem Container für Tiefgefriersperma ins Helmholtz-Zentrum Berlin für Materialien und Energie GmbH versendet. Dort erfolgte die weitere Aufbereitung und Auswertung der Proben.

Zur Bestimmung der Spurenelemente in den Ejakulaten und dem Seminalplasma wurde die Neutronenaktivierungsanalyse (NAA) verwendet, die sich allgemein zur Spurenelementanalyse bei biologischen Proben eignet. Die Spurenelementwerte in den Spermien wurden dann aus den Werten für das Ejakulat und das Seminalplasma errechnet, beispielsweise für Selen bezogen auf die Feuchtmasse:

Se in den Spermien [nmol/Mrd.]= ((Se im Ejakulat [nmol/ml] – Se im Seminalplasma [nmol/ml]) / Spermienanzahl [Mio./ml]) x 1000

Hierbei werden durch Bestrahlung mit thermischen (langsamen) Neutronen die stabilen Isotope der Spurenelemente in der Probe in radioaktive Isotope verwandelt.

Die Strahlung, die bei dem Zerfall dieser Isotope frei wird, kann gemessen werden.

Die Strahlungsintensität ist dabei proportional zur Konzentration des Elements in der Probe. Der Neutronenfluss unterliegt hierbei Schwankungen, daher werden mit der Probe zusammen entsprechend definierte und zertifizierte Standards als Referenz bestrahlt und gemessen. Die Isotope, Halbwertszeiten und Emissionslinien hierzu sind in Tabelle 13 angegeben.

Tabelle 13: Isotope, Halbwertszeiten und gemessene Emissionslinien der untersuchten Elemente (BLAAVW 1996)

Zur Vorbereitung wurde jede Probe zunächst halbiert und die eine Hälfte mit 16000 g für 30 Minuten zentrifugiert, um das Seminalplasma von den Spermien zu trennen.

So entstanden drei Fraktionen: Sperma, Seminalplasma und Spermien. Diese wurden jede für sich weiter verarbeitet.

Vor der weiteren Aufbereitung wurden die Proben zunächst gewogen, um ihre Feuchtmasse zu bestimmen. Dazu wurde eine Waage verwendet (MC 210 P, Fa.

Satorius, Göttingen), welche sich automatisch selbst kalibriert. Der Fehler der Einzelmessung beträgt laut Hersteller 20 µg. Anschließend erfolgte eine Gefriertrocknung (Labonco FreeZone 6, Piatrowski Forschungsgeräte, München) für drei Tage bei -20°C und eine weitere Wägung zur Bes timmung der Trockenmasse.

Nach diesem Schritt wurde jede Probe mit einem Achatmörser (Fa. Lembke GmbH, Technische Steine- und Laborbedarf, Bruchweiler) homogenisiert. Achat eignet sich hierbei besonders gut, da der Abrieb von diesem Material vernachlässigbar gering ausfällt. Somit gelangt keine Verunreinigung in die Probe, die das Ergebnis verfälschen könnte. Das entstandene Pulver wurde zu je 10-25 mg in spezielle Quarzampullen gefüllt, welche durch Zuschweißen aus Quarzrohren (Heraeus, Hanau) entstanden. Die dazu benötigte Wasserstoff/Sauerstoff Flamme wurde von einem eigens zu diesem Zweck konstruierten Apparat (Fa. Toss GmbH, Potsdam) erzeugt.

Die Ampullen mit den Proben wurden dann in die aus Aluminium bestehenden Bestrahlungsbüchsen gesteckt. Zusätzlich wurden eine Leerampulle (Blindwertkontrolle), zwei Ampullen mit je einem Multielementstandard 10090c184a und 10090c183a (Merck, Darmstadt) sowie eine Ampulle mit dem zertifizierten Referenzmaterial Bovine Liver 1577b (National Institute of Standards and Technology, Washington) in den Büchsen hinzugefügt. Diese Büchsen wurden im Kern des Reaktors BER II des Helmholtz-Zentrums für drei Tage bestrahlt. Nach der Bestrahlung mussten die Proben zunächst sechs Wochen abklingen.

Um das radioaktiv kontaminierte Beckenwasser des Reaktors zu beseitigen, war es anschließend notwendig die Ampullen nacheinander dreimal in 15%ige Flusssäure (Merck, Darmstadt) zu tauchen, dreimal mit bidestilliertem Wasser, einmal mit 98%igem Ethanol (Merck, Darmstadt) und einmal mit 100%igem Aceton (Merck, Darmstadt) zu waschen.

Die Messung der frei werdenden Gamma-Stahlung erfolgte mit einem Detektor aus Reinstgermanium mit planarer Geometrie (GC 6520, Canberra, Mainz). Jede Probe wurde vier bis sechs Stunden gemessen. Die Auswertung der Peaks der

aufgenommen Gamma-Spektren erfolgte über ein spezielles Computerprogramm (Genie System Spectroscopy Applications, Canberra, Mainz) (BERTELSMANN 2002).

Bei einigen Proben lag der Wert für Eisen im Seminalplasma unter der Nachweisgrenze. Sie wurden deswegen weitere sieben Tage bestrahlt und nach einer Abklingzeit von sechs Wochen jeweils fünf Stunden lang nochmals gemessen.