Mittelwerte differenziert nach Alters- und Trächtigkeitsgruppen

Werden die Mittelwertverteilungen der Spurenelemente differenziert nach den drei Altersgruppen betrachtet, fallen bei einigen Gruppen signifikante Unterschiede auf.

Die Altersgruppen sind dabei wie folgt gewählt: Gruppe 1: 4-7 Jahre, Gruppe 2: 8-15 Jahre und Gruppe 3: 16-26 Jahre.

Bei den Blutwerten für Zink unterscheiden sich alle drei Gruppen signifikant voneinander. Gruppe 1 hat dabei die höchsten Zinkwerte, Gruppe 3 im Vergleich dazu die niedrigsten. Die Zinkwerte im Blut sind hochgradig signifikant negativ mit dem Alter korreliert (r=-0,66, p<0,001; s. Kapitel 5.5). Bei dem Blutwert für Kupfer unterscheidet sich Gruppe 1 (höchster Wert) signifikant von Gruppe 3 (niedrigster Wert).

Bei den Zinkwerten aus den Spermien gibt es signifikante Unterschiede und zwar sowohl bei den Ergebnissen bezogen auf die Trockenmasse als auch bei den Ergebnissen bezogen auf die Feuchtmasse. Hinsichtlich der Trockenmasse sind die Zinkgehalte in der mittleren Altersgruppe signifikant höher als die Gehalte in der Gruppe der ältesten Hengste. Bei der Feuchtmasse ist die mittlere Gruppe signifikant höher als die beiden anderen. Werden die Zinkwerte für das Ejakulat betrachtet, so ergibt sich für Gruppe 3 ein Wert, der signifikant niedriger ist, als der Wert der beiden jüngeren Gruppen. Bisherige Veröffentlichungen aus der Humanmedizin bringen

geringe Zinkwerte im Seminalplasma mit Infertilität in Verbindung (HUANG et al.

2000, CHIA et al. 2000). Eine weitere Untersuchung ergab eine negative Korrelation des Zinkgehaltes zur Motilität und eine positive zum Anteil der morphologisch abweichenden Spermien beim Menschen (HENKEL et al. 1999).

Im Seminalplasma sind die Gehalte von Eisen und Selen in der ältesten Gruppe signifikant höher, als bei den anderen beiden. Ein möglicher Grund hierfür könnte ein Auswertungsfehler sein. Das Seminalplasma wurde erst durch Zentrifugation aus den Ejakulaten gewonnen, nachdem die Proben eingefroren und verschickt worden sind. Daher besteht die Möglichkeit, dass die Spemienmembranen geschädigt wurden und somit Spurenelemente aus den Spermien in das Seminalplasma austraten. Die Wahrscheinlichkeit, dass die Spermien der älteren Hengste am anfälligsten für eine Schädigung durch Kälte sind, ist recht hoch. BERTELSMANN et al. (2005) konnten in ihrer Studie zu den Selengehalten in Ejakulatfraktionen keine solchen Unterschiede in den Altersgruppen feststellen, obwohl die Reihenfolge der Probenbearbeitung dieselbe war. Die Gründe hierfür könnten darin liegen, dass BERTELSMANN et al. (2005) die Untersuchungen im Januar durchführten, wohingegen die Ejakulatentnahmen zu dieser Studie im Juli und August stattfanden.

Die Unterschiede zwischen den beiden Studien könnten somit möglicherweise auf saisonalen Effekten beruhen.

Werden die Mittelwerte differenziert nach den verschiedenen Fertilitätsgruppen betrachtet, gibt es nur bei den Werten für Selen in den Spermien signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen. Zur Einteilung in Fertilitätsgruppen ist die individuelle saisonale Trächtigkeitsrate verwendet worden. Hierbei bildet das untere Quartil (Trächtigkeitsrate 25,0-40,9 %) Gruppe 1, das obere Quartil (Trächtigkeitsrate 50,9-58,9 %) Gruppe 3 und die beiden mittleren Quartile zusammen (Trächtigkeitsrate 40,9-50,9 %) Gruppe 2. In den Spermien ist der Gehalt des Spurenelements Selen in Gruppe 3 - also der Gruppe der Hengste, deren Stuten hohe Trächtigkeitsraten aufweisen - am höchsten. Dieses Ergebnis stimmt auch mit dem Ergebnis von BERTELSMANN et al. 2005 überein, welche eine positive Korrelation zwischen den Selengehalten der Spermien und den Abfohlraten der Stuten, die von den entsprechenden Hengsten besamt wurden, ermitteln konnten.

Weiterhin korreliert der Selengehalt in den Spermien und im Ejakulat mit dem Prozentsatz der vorwärtsbeweglichen Spermien (s. Kapitel 5.5). Dieser Wert korreliert wiederum schwach signifikant positiv mit der Trächtigkeitsrate. Es kann vermutet werden, dass höhere Selengehalte die Motilität begünstigen, was sich außerdem günstig auf die Befruchtung auswirkt.

5.3 Hengst- und ejakulatbedingte Variationen der Spurenelement- und Vitamingehalte im Blut und Ejakulat

Die Gewinnung der drei Ejakulate und der drei Blutproben erfolgt in zweitägigem Abstand von Hengsten, die in regelmäßiger sexueller Beanspruchung standen.

Die Spermawerte für Selen, Rubidium, die Seminalplasmawerte Zink und Eisen, die Ejakulatwerte für Zink und die im Blut der Hengste gemessenen Gehalte von Vitamin E und Kupfer waren vornehmlich abhängig vom Hengst. Der Eisenwert im Ejakulat bezogen auf die Feuchtmasse wird ungefähr zu gleichen Teilen von Hengst und Ejakulat bedingt. Von dem Faktor Ejakulat bzw. Blutprobe hängen hauptsächlich die Werte für Zink in den Spermien, die Eisenwerte im Ejakulat bezogen auf die Trockenmasse und die Blutwerte von Eisen, Zink, Vitamin A, Molybdän und Mangan ab. Die Eisenwerte der Spermien und die Selenblutwerte sind zu 100 % vom Ejakulat bzw. der Blutprobe abhängig. PAGAN et al. (2007) erkannten Unterschiede in den Blutplasmawerten für Selen, abhängig vom Zeitpunkt des Trainings. So waren die Werte vor dem Training geringer als direkt danach. Unterschiede ergaben sich auch durch die Fütterung von anorganischen bzw. organischen Selenverbindungen. Die Pferde, denen die anorganischen Verbindungen gefüttert wurden, erreichten 24 Stunden nach dem Training wieder ihre Ausgangswerte im Blutspiegel. Bei jenen mit der organischen Fütterung blieben die Werte auch nach 24 Stunden noch erhöht. Die Varianz der Selenwerte im Blut aus dieser Studie könnten darauf zurückgeführt werden, dass bei der Blutentnahme nicht darauf geachtet wurde, ob sie vor oder nach der Arbeit mit den Tieren stattfand.

Da keiner der Werte ausschließlich, oder fast ausschließlich durch den Faktor Hengst bedingt wird (Varianzkomponente <86 %) sollte bei späteren Untersuchungen stets mehrere Stichproben pro Hengst verwendet werden.

5.4 Korrelationen der Spurenelementgehalte im Blut zu denen in den Ejakulatfraktionen

Die Bestimmung der Spurenelemente im Ejakulat, im Seminalplasma und in den Spermien wurde in der vorliegenden Arbeit über die Neutronenaktivierungsanalyse durchgeführt. Bei der Untersuchung von biologischen Proben auf ihren Spurenelementgehalt muss das Probenmaterial bei den meisten Untersuchungsverfahren zunächst aufgeschlossen werden, um die Spurenelemente zu bestimmen. Bei der Selenbestimmung ergibt sich das Problem, dass dabei flüchtige Selenverbindungen entstehen, die das Messergebnis verfälschen können.

Die Neutronenaktivierungsanalyse erfordert keinen vorherigen Aufschluss und somit kann diese Fehlerquelle ausgeschlossen werden. Daher ist die Methode der NAA eine Referenzmethode für die Selenbestimmung in festen Proben. Da die Bestimmung der Spurenelemente über die Neutronenaktivierungsanalyse sehr zeit- und arbeitsaufwendig ist, sollte in dieser Studie herausgefunden werden, ob eine Korrelation zwischen den Ejakulat- und den Blutwerten besteht. Auf diese Weise könnte der Aufwand über die wesentlich einfachere Blutanalyse minimiert werden.

Hengsten mit dem Verdacht auf einen geringen Spurenelementgehalt im Sperma, könnte einfach eine Blutprobe entnommen werden.

Die Korrelationsrechnungen ergaben bei keinem der Spurenelemente eine signifikante Korrelation (r= -0,23 - 0,20, p= 0,15 - 0,98). Somit ist es nicht möglich, die Spurenelementanalyse im Ejakulat, im Seminalplasma und in den Spermien durch die Blutanalyse zur ersetzen.

5.5 Korrelationen zwischen den Vitamin- und

Spurenelementgehalten zur Spermaqualität und Fruchtbarkeit

Um einen Überblick über die Zusammenhänge zwischen Spurenelementgehalten und Fruchtbarkeit zu bekommen, sind die Korrelationen zwischen den Spurenelementwerten in Ejakulat, Seminalplasma, Spermien, Blut und den Vitamingehalten im Blut mit den Parametern für Samenqualität und Fertilität errechnet worden.

Dabei ergab sich eine signifikant negative Korrelation (p<0,001) des Volumens mit den Werten für Selen und Zink im Ejakulat und im Seminalplasma, Eisen im Ejakulat bezogen auf die Feuchtmasse und Selen in den Spermien bezogen auf die Anzahl der Spermien. Zudem korreliert der Eisenwert für das Seminalplasma signifikant (p<0,01) negativ mit dem Volumen. Aus dem Zusammenhang zwischen dem Volumen und dem Spurenelementgehalt im Seminalplasma und im Ejakulat kann geschlossen werden, dass diese Elemente vorzugsweise über den Hoden und Nebenhoden in das Sperma gelangen.

Dahingegen korreliert die Dichte signifikant positiv (p<0,001) mit Selen, Zink und Eisen im Ejakulat, Selen und Zink im Seminalplasma bezogen auf die Feuchtmasse und wiederum Selen in den Spermien bezogen auf die Anzahl. Zusätzlich gab es signifikante Korrelationen (p<0,01) der Dichte zu Zink in den Spermien und Eisen im Seminalplasma. Dies belegt, dass die Elemente vorzugsweise über Hoden und Nebenhoden in das Ejakulat gelangen. Diese Beobachtungen entsprechen auch denen von PESCH (2005). Sie konnte auch eine negative Korrelation zum Volumen und eine positive Korrelation zur Dichte der Elemente Zink und Eisen im Seminalplasma feststellen. Für Zink entsprechen diese Ergebnisse auch denen von CHIA et al. (2000).

Der Prozentsatz der vorwärtsbeweglichen Spermien korreliert signifikant (p<0,01) positiv mit den Selengehalten im Ejakulat und in den Spermien. Somit könnte für höhere Gehalte dieses Spurenelements ein positiver Einfluss auf die Motilität der Spermien vermutet werden. BLEAU et al. (1984) stellten eine negative Wirkung von zu hohen bzw. zu niedrigen Selenwerten im Sperma bei Männern auf die Motilität der Spermien fest. Bei den Ergebnissen der Hengste konnte keine negative Auswirkung der höheren Werte erkannt werden, was die Vermutung nahe legt, dass schädigend hohe Bereiche bei Hengsten in vivo nicht vorkommen.

Bei den Werten, die mit Hilfe des Durchflusszytometers gewonnen wurden, hat der Prozentsatz für die Membranintaktheit nach 0 h eine positive Korrelation (p<0,001) sowohl zu dem Selengehalt im Ejakulat und in den Spermien, als auch zum Zinkgehalt im Ejakulat [nmol/g]. Hierbei spielen die Enzymsysteme eine Rolle, in welchen diese Spurenelemente zur antioxidativen Aktivität beitragen. Selen trägt

über die GPx und Zink über die SOD zur Unterbrechung der Kettenreaktion der Lipidperoxidation bei. Außerdem ist der Selengehalt in den Spermien signifikant (p<0,01) positiv mit dem Anteil der PMI-Spermien nach 24 h korreliert. Selen könnte also auch der Spermienalterung entgegen wirken. BEHNE et al. (1988) konnten in ihren Untersuchungen zum Zinkgehalt in verschiedenen Ejakulatfraktionen keine Korrelation zur Vitalität der Spermien feststellen, wohingegen CHIA et al. (2000) eine positive Korrelation zwischen dem Seminalplasmagehalt von Zink und der Vitalität erkannten.

Die Anzahl der Spermien mit positiv akrosomalem Status nach 0 h ist signifikant (p<0,001) negativ mit den Selen- und Zinkwerten im Ejakulat [nmol/g] korreliert. Nach 24 h ist der Anteil der PAS-Spermien signifikant (p<0,01) negativ mit dem Selengehalt in den Spermien korreliert. Somit kann vermutet werden, dass Selen und Zink eine frühzeitige Akrosomreaktion verhindern. Zudem besteht eine signifikante Korrelation (p<0,01) der PAS-Spermien zum Selengehalt in den Spermien und Selen- und Eisenwert im Seminalplasma. Den Hauptanteil an den Selenoenzymen in equinen Spermien macht die PHGPx aus. Über 90 % des Selengehaltes in den Keimzellen ist in diesem Enzym gebunden. PHGPx wurde von LIANG et al. (2009) als Anti-Apoptose-Faktor beschrieben. So kann die Auswirkung des Selengehaltes auf die Anzahl der PAS-Spermien erklärt werden.

Ferner besteht eine signifikante Korrelation (p<0,001) zwischen dem Alter und dem Zinkgehalt im Blut (s. auch Kapitel 5.2), d.h. der Gehalt des Elementes im Blut nimmt mit zunehmendem Alter ab. Diesen Zusammenhang konnten auch HAASE et al.

(2006) bereits für Menschen nachweisen. Der DFI korreliert in dieser Studie positiv mit dem Alter (p<0,05) und der alpha-t-Wert (Anteil der Rotfluoreszenz, also der Einzelstränge an der Gesamtpopulation beim SCSA-Assay) korreliert signifikant (p<0,01) negativ mit dem Zinkgehalt im Blut. Mit dem Alter sinkt somit nicht nur der Blutzinkgehalt, sondern auch die Chromatinschäden nehmen zu. Daraus kann indirekt auf eine Rolle von Zink bei der Verhinderung von Chromatinschäden geschlossen werden.

Zwischen den Selenwerten im Blut und der Spermaqualität konnten keine Zusammenhänge erkannt werden. Ein Grund könnte sein, dass der Hoden beim

Pferd vorzugsweise mit Selen versorgt wird, auch wenn niedrigere Blutkonzentrationen vorhanden sind. Diese Bedingungen konnten BEHNE et al.

(1982, 1986) für Ratten nachweisen. Somit würde sich eine vorübergehend geringere Selenversorgung nicht sofort auf die Spermienqualität und Fruchtbarkeit auswirken.

Entgegen vorangegangener Studien korreliert der Selengehalt im Ejakulat nur geringgradig negativ mit dem DFI. BERTELSMANN et al. (2005) konnten eine signifikant negative Korrelation zwischen dem Selengehalt im Ejakulat und in den Spermien zur gestörten Chromatinkondensation herstellen. Auch für den Anteil der morphologisch abweichenden Spermien konnte nur eine geringgradig signifikante Korrelation zu den Selengehalten bestätigt werden. BLEAU et al. (1984) beschrieben eine negative Auswirkung auf die Morphologie von zu hohen bzw. zu niedrigen Selengehalten im menschlichen Sperma.