3. Diskussion
3.4 SOLO wirkt als kohäsives Protein in der weiblichen Meiose von Drosophila
Als vielversprechendster Kandidat eines funktionellen Rec8-Homologs schien SOLO, da es mit dem Zentromeren und entlang der Chromosomen cores assoziiert ist und für die Aufrechterhaltung der Kohäsion benötigt wird. Darüber hinaus ist es auch essentiell für die Ausbildung der Zentromercluster, die die Grundlage für die Initiation der Synapsis bilden (Takeo et al., 2011), für die Mono-Orientierung der Schwesterchromatiden und die Stabilität des SCs (Yan und McKee, 2013). In der männlichen Meiose von mei-S332-Mutanten gehen außerdem die zentromerischen SOLO-Signale frühzeitig in der Anaphase der Meiose I verloren, was konsistent mit einer schützenden Funktion von Mei-S332 in Bezug auf die
meiotische Kohäsion ist (Yan et al., 2010; Kitajima et al., 2004). Mit Hilfe von Koimmunpräzipitationen von SOLO und SMC1 konnte noch ein weiterer Hinweis erbracht werden, dass SOLO als funktionelles Rec8-Homolog fungieren könnte (Yan und McKee, 2013). Ausgehend von diesen Beobachtungen wurde im Rahmen dieser Arbeit die Funktion von SOLO im Verlauf der weiblichen Meiose weiter charakterisiert und Untersuchungen angestellt, die prüfen sollten, ob SOLO als integraler Bestandteil eines meiotischen Cohesinkomplexes fungiert. SOLO lokalisiert entlang der Chromosomen cores und weist eine Akkumulation an den Zentromeren auf. Beide Lokalisationen zeigen jedoch eine unterschiedliche Abhängigkeit in Bezug auf das Cohesinprotein ORD und das laterale Elementprotein C(2)M. ORD weist ebenfalls wie SOLO eine zentromerische Akkumulation auf und ist essentiell für die Aufrechterhaltung der meiotischen Kohäsion und die Stabilität des SCs (Webber et al., 2004). Generell betrachtet, besitzen beide Proteine funktionelle Ähnlichkeiten (Webber et al., 2004, Yan und McKee, 2013), sodass es auch nicht unerwartet war, dass die zentromerische Lokalisation von SOLO und ORD vom jeweils anderen Protein abhängig ist.
Die Ausbildung der Chromosomen cores hingegen ist C(2)M-abhängig (Manheim und McKim, 2003). Eine mögliche Verknüpfung dieser Komponente mit Cohesin und die damit verbundene Ausbildung komplexer Strukturen wurden bereits im Abschnitt 3.2 diskutiert.
Fakt jedoch ist, dass das Vorhandensein von C(2)M essentiell ist für die korrekte Ausbildung des SCs und damit verbunden auch für das typische Auftreten eines fadenförmigen C(3)G- und SMC1-Signals (Manheim und McKim, 2003). Fehlt C(2)M können diese beiden Proteine noch an die Zentromere und Chromosomenarme rekrutiert werden, aber keine Etablierung der Chromosomen cores mehr stattfinden (Webber et al., 2004). Gekennzeichnet ist dieses Lokalisationsverhalten durch starke zentromerische Signale und diffuse chromosomale Signale, die auch in den Nährzellkernen zu finden sind. Ähnlich zu den bereits beschriebenen Abhängigkeiten, weist SOLO im c(2)M-mutanten Hintergrund ein diffuses Signal mit einzelnen stärkeren Akkumulationen auf, die mit den stärksten C(3)G-Signalen kolokalisieren und folglich zentromerische Regionen sind (Khetani und Bickel, 2007). Somit ist die zentromerische Lokalisation von SOLO ORD abhängig und die Assemblierung an den Chromosomen cores weist eine C(2)M-Abhängigkeit auf.
SOLO wird weiterhin auch für die Aufrechterhaltung der Homologenpaarung und der Zentromerkohäsion in Prophase der Meiose I benötigt. In wildtypischen Keimbahnzellen liegen die Zentromere meist gepaart vor, sodass nur 1-3 Zentromercluster nachweisbar sind, die essentiell für die Initiation der SC-Assemblierung sind (Khetani und Bickel, 2007, Tanneti et al., 2011, Takeo et al., 2011, Dernburg et al., 1996b). Im weiteren Verlauf der Prophase bleiben die Zentromere miteinander assoziiert, was vermutlich eine Funktion bei der achiasmatischen Segregation in Drosophila hat (Dernburg et al., 1996b, Karpen et al., 1996,
Hawley et al., 1992, Hughes et al., 2009). In ord-Mutanten ist sowohl die Paarung der Zentromere gestört, als auch die Kohäsion beeinträchtigt (Khetani und Bickel, 2007). Für SOLO konnte mit Hilfe der durchgeführten CID-Färbungen ähnliches festgestellt werden, was sich auch mit den parallel dazu veröffentlichten Daten von Yan und McKee, 2013 deckt.
Im Laufe der Prophase nehmen die beobachteten Kohäsionsdefekte weiter zu, was eventuell darauf zurückzuführen ist, dass SOLO eine Funktion bei der Aufrechterhaltung der Chromosomen cores hat und zusätzlich kohäsive Funktionen hat. In solo-mutanten Ovarien werden zunächst Chromosomen cores und der SC assembliert, die dann aber im Laufe der Prophase frühzeitig wieder disassemblieren, da vermutlich wichtige Strukturen fehlen, die die Stabilität und Flexibilität des SCs erhöhen (Yan und McKee, 2013). Das Fehlen des SCs führt dann zur graduellen Dissoziation der Zentromere, sodass die Anzahl der CID-Signale im Verlauf der Prophase ansteigt. Eine weitere Erklärung könnte auch eine Rad21-Beteiligung bei der meiotischen Kohäsion sein, die zu Beginn des Pachytäns noch erhalten bleibt und dann durch das Fehlen von SOLO ebenfalls beeinträchtigt ist (siehe 3.3).
Neben der Funktion zur Aufrechterhaltung der zentromeren Kohäsion ist SOLO auch noch essentiell für die Armkohäsion in Meiose. Fehlt SOLO kann kein stabiler Metaphase I-Arrest etabliert werden und die ausgebildeten Chiasmata können nicht länger aufrechterhalten werden. Diese Beobachtung ist jedoch kein direkter Beweis für eine SOLO-abhängige Armkohäsion. Eine Möglichkeit dies abzuklären, wären jedoch FISH-Analysen mit spezifischen Sonden für Zentromer-distale Bereiche. Solche FISH-Experimente wurden initiiert, waren jedoch nicht auswertbar, da vermutlich die Kompaktierung des Oozyten-chromatins keine spezifische Sondierung ermöglichte (Daten nicht gezeigt). Der indirekte Nachweis einer kohäsiven Funktion auch entlang der Chromosomenarme, deckt sich auch mit der Lokalisation von SOLO, welches neben einer zentromeren Lokalisation auch an den Chromosomen cores zu finden ist.
Ein weiteres Charakteristikum von SOLO sind die im N-terminalen Bereich befindlichen RGG-repeats, welche in RNA-bindenden Proteinen zu finden sind (Alex und Lee, 2005). Die Expression einer verkürzten Version von SOLO, bei der die ersten 137 Aminosäuren inklusive der RGG-repeats fehlen, hat weder eine Auswirkungen auf die Lokalisation von SOLO noch auf die kohäsive Funktion dieses Proteins. Es ist demnach anzunehmen, dass SOLO keine Assoziation mit der RNA benötigt um die meiotische Kohäsion aufrechtzuerhalten. Weiterhin kann damit auch ausgeschlossen werden, dass SOLO eventuell als regulatorisches Protein die Transkription bzw. Translation beeinflusst und die beobachteten Kohäsionsdefekte in solo-mutanten Ovarien nur indirekt aufgrund einer veränderten Expressionsrate kohäsiver Proteine zustande kommen.
Da nun offensichtlich den RGG-repeats in SOLO keine essentiellen Funktionen zugeordnet werden können, kann auch nur spekuliert werden, warum in einem kohäsiven
Protein RNA-Bindemotive vorkommen. Diese ersten 137 Aminosäuren von SOLO sind ebenfalls in VASA vorhanden. VASA ist eine RNA-Helikase, die an der Keimbahnetablierung und der Achsenspezifizierung in Oozyten und Embryonen beteiligt ist (Styhler et al., 1998, Tinker et al., 1998) und daher ein RNA-bindendes Motiv für dessen Funktion benötigt. SOLO und VASA werden aus der gleichen prä-mRNA gespleißt und weisen beide eine keimbahnspezifische Lokalisation auf. Somit ist vorstellbar, dass die RGG-repeats in SOLO nur ein evolutionäres Relikt sind und für die eigentliche, kohäsive Funktion von SOLO keine Rolle spielen, außer für die Gewährleistung des VASA/Keimbahn-spezifischen Expressionsprofils. In den durchgeführten Experimenten zur Charakterisierung von EGFP-SOLOΔRGG erfolgte keine Expression unter Kontrolle der VASA-spezifischen, genomischen Regionen, sondern eine UAS-Gal4-abhängige Expression. Durch diese ektopische Expression von SOLOΔRGG ist eine hohe Syntheserate zu Beginn der Oogenese gewährleistet, die ausreichend ist für die Aufrechterhaltung der meiotischen Funktionen von SOLO.