Proteinanalytische Methoden

4.4.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Für die Analyse der Expressionslevel wurden Proteinextrakte aus Ovarien auf SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Hierfür wurden 8-17%ige SDS-Polyacrylamid-Gradienten-gele verwendet. Die Elektrophorese fand bei 140 bis 170 V in 1x Laufpuffer (2,5 mM Tris;

19,1 mM Glycin; 0,1% (w/v) SDS) statt. Als Molekulargewichtsstandard diente der PageRuler Prestained Protein Ladder (10-170 kDa) von Thermo Scientific.

4.4.2 Western Blot und immunologischer Nachweis (Immunblot)

Der Transfer der gelelektrophoretisch aufgetrennten Proteine auf eine Hybond-ECL-Nitro-zellulose Membran (GE Healthcare) erfolgte durch Elektroblotting. Das Blotting wurde 1 h lang bei 100 V in Transferpuffer (25 mM Tris; 200 mM Glycin; 20% (v/v) Methanol) durchgeführt. Nach Färbung der Proteine mit Ponceau S wurden die Proteinbindungsstellen der Membran durch einstündiges Schwenken in Milchpuffer (5% (w/v) Magermilchpulver (Sucofin) in PBS-Tw) bei Raumtemperatur blockiert. Im nächsten Schritt erfolgte die Inkubation mit dem primären Antikörper. Hierzu wurden Antikörperlösungen in Milchpuffer mit 0,02% (w/v) Natriumazid versetzt und über Nacht bei 4°C oder 1,5 h lang bei RT mit der Nitrozellulose-Membran inkubiert. Anschließend wurde die Membran dreimal kurz und dreimal 15 min unter Schütteln mit Milchpuffer gewaschen. Im Anschluss daran erfolgte eine zweistündige Inkubation der Membran mit dem sekundären Antikörper. Dieser wurde dann durch dreimaliges Spülen mit Milchpuffer und zweimaligem 30-minütigem Waschen entfernt.

Zuletzt wurden die Membranen dreimal kurz und zweimal 15 min mit PBS-Tw gespült. Eine Auflistung der verwendeten Antikörperlösungen sowie die entsprechenden Verdünnungs-stufen finden sich in Tabelle 12.

Der Nachweis der Proteine erfolgte durch das ECL-Detektionssystems (ECL Western-Blotting Detection Reagents, GE Healthcare) oder mit Hilfe der Two Bottle Substrate von p.j.k. Hierzu wurden die entsprechenden Komponenten nach Angabe des Herstellers gemischt und auf die Membran gegeben. Nach einminütiger Inkubation wurde die überschüssige Flüssigkeit entfernt und die Detektion des Signals mit dem Luminescent Image Analyzer 4000 (Fujifilm) mit der dazugehörigen Software Image Reader LAS-4000 v2.0 durchgeführt. Zur weiteren Bearbeitung wurde Multi Gauge (Fujifilm) und Adobe Photoshop CS4 verwendet.

Tabelle 12: Primäre Antikörper und sekundäre Antikörper für immunologische Nachweise. Die Verdünnung erfolgte für primäre Antikörper in Milchpuffer mit 0,02% (w/v) Azid und für sekundäre Antikörper in Milchpuffer ohne Azid.

Primäre Antikörper Verdünnung Referenz/Quelle

anti-EGFP(IS28) (rb) 1:3000 Herzog et al., 2013

anti-α-Tubulin (m) 1:20000 Sigma Aldrich

anti-Rad21 (gp) 1:10000 Heidmann et al., 2004

anti myc (9E10) (m) 1:100 Evan et al., 1985

anti-HA (12CA5) (m) 1:200 Niman et al., 1983

anti-Flag (rb) 1:2000 Sigma Aldrich

anti-Hexokinase (rb) 1:15000 B. Westermann, Pers. Mitteilung Sekundäre Antikörper

POD-Ziege-anti-Maus 1:3000 Jackson Immunoresearch

POD-Ziege-anti-Kaninchen 1:3000 Jackson Immunoresearch POD-Ziege-anti-Meerschweinchen 1:1000 Jackson Immunoresearch

Die Spezies der entsprechenden primären Antikörper sind wie folgt abgekürzt: rb: Kaninchen, gp:

Meerschweinchen, m: Maus, r: Ratte

4.4.3 In vitro Transkription und Translation (IVT) und Autoradiographie

Für die in vitro Synthese von Proteinen wurde das „TNT SP6 Coupled Reticulocyte Lysate System“ (Promega) nach Angaben des Herstellers verwendet. Grundlage diese Systems ist ein Lysat aus Kaninchen-Retikulozyten, dem SP6 RNA-Polymerase für die Synthese der mRNA zugesetzt wurde. Ein Vorteil dieses Systems ist, dass die Transkription und die Translation direkt miteinander gekoppelt werden können. Zur radioaktiven Markierung von Proteinen wurde dem Reaktionsmix 1 mM [³⁵S]-markiertes Methionin (Hartmann Analytics;

1,000nCi/mmol) zugesetzt. Sollten die synthetisierten Proteine in einer anschließenden Koimmunpräzipitation (siehe 4.4.4) eingesetzt werden, erfolgte eine Kotranskription bzw.

Kotranslation der Proteine durch Zugabe zweier Plasmidmatrizen. Hierzu wurden jeweils 500°ng von jedem Plasmid in einen 25 µl Ansatz gegeben.

Die Analyse der in vitro synthetisierten Proteine bzw. der durchgeführten Koimmun-präzipitationen erfolgte durch eine gelelektrophoretische Trennung und eine anschließende autoradiographische Auswertung. Hierzu wurden Phosphoimager-Schirme (Fuji Corp.) über Nacht auf die fixierten (30 min in 40 % (v/v) Methanol; 10 % (v/v) Essigsäure) und getrockneten Gele gelegt und mit Hilfe des FLA 7.000 Phosphoimager (Fuji Corp.) die radioaktiven Proteinbanden nachgewiesen. Die Weiterbearbeitung der Bilder erfolgte mit Adobe Photoshop CS4.

4.4.4 Kinaseassay und in vitro Separase-Spaltungsassay

Für den in vitro Nachweis einer möglichen Separase-abhängigen Spaltung von SOLO wurde dieses zunächst in Anwesenheit von [³⁵S]-Methionin synthetisiert (siehe 4.4.3) und anschließend mit humaner Plk1 (zur Verfügung gestellt von O. Stemmann) und zusätzlichem ATP inkubiert. Hierzu wurde folgender Ansatz gewählt: 3,2 µl des IVT-Ansatzes, 0,4 µl MgCl2

(100 mM), 0,4 µl ATP (100 mM) und 1,2 µl humane Plk1. Nach 30-minütiger Inkubation bei 30°C wurde der Ansatz aufgeteilt. Die eine Hälfte wurde mit 4 µl humaner Separase (zur Verfügung gestellt von O. Stemmann) versetzt und zur anderen Hälfte wurden entsprechende Mengen an Puffer hinzugegeben. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 30°C wurde die Spaltungsreaktion durch Zugabe von Gelauftragspuffer abgestoppt und die Proben anschließend durch ein fünfminütiges Aufkochen bei 95°C denaturiert. Die Auswertung möglicher Spaltprodukte erfolgte durch eine gelelektrophoretische Auftrennung und anschließender Autoradiographie (siehe 4.4.2 und 4.4.3)

4.4.5 Koimmunpräzipitationen

Zum Nachweis möglicher Proteininteraktionen wurden Koimmunpräzipitationen durchgeführt. Hierzu wurden entweder in vitro synthetisierte Proteine herangezogen oder Proteinextrakte aus Embryonen bzw. Ovarien verwendet. Bei den letztgenannten Experimenten wurden jeweils 100nµl Embryonen bzw. 250 Ovarien in 400°µl Lysepuffer (50°mM HEPES, 60 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0,2% (w/v) Triton-X-100, 0,2%

(w/v) Nonidet NP40, 10% (v/v) Glycerin pH 7,5 und den Proteaseinhibitoren Pefablock (2 mM), Benzamidin (2°mM), Aprotinin (10 μg/ml), Leupeptin (10 μg/ml), Pepstatin A (2 μg/ml)) homogenisiert und anschließend zentrifugiert (15nmin, 16,000x g), um die löslichen Bestandteile zu erhalten. Hiervon wurden 10 µl als Input-Probe entnommen und mit 90°µl Gelauftragspuffer gemischt. Der restliche Ansatz wurde dann mit einer Antikörper-gekoppelten Affinitätsmatrix 4 h lang bei 4°C unter Rotation inkubiert. Im Rahmen der Arbeit wurden Flag-, myc- bzw. HA-gekoppelte Affinitätsmatrizen verwendet. Diese stammten von Sigma Aldrich bzw. von Roche. Für jeden Ansatz wurden etwa 20 µl der entsprechenden Matrix zugegeben, die zuvor dreimal mit jeweils 1 ml Lysepuffer äquilibriert wurde. Nach der Inkubation wurde der Überstand durch Zentrifugation abgetrennt und auch davon wurde eine Probe (10 µl) entnommen und mit 90 µl Gelauftragspuffer versetzt (Probe: S; Überstand).

Wurden als Ausgangsmaterial für eine Koimmunpräzipitation in vitro synthetisierte Proteine verwendet, wurde von dem insgesamt 25 µl umfassenden Ansatz für die Input- bzw.

Überstandprobe jeweils 3 µl entnommen und mit 27°µl Gelauftragspuffer versetzt. Um unspezifische Interaktionen an die Affinitätsmatrix zu unterbinden, wurde diese 5x mit jeweils 1°ml Lysepuffer gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurde die Affinitätsmatrix in Mobicol-Säulen (Mobitec) überführt und durch Zentrifugation (Tischzentrifuge, VWR, Galax mini, 20 sek) vom Lysepuffer getrennt. Die Elution erfolgte durch Zugabe von 36 µl Gelauftragspuffer ohne β-Mercaptoethanol und einer 5-minütigen Inkubation bei 95°C. Durch einen anschließenden Zentrifugationsschritt wurde das Eluat dann von der Affinitätsmatrix getrennt und nach Zugabe von 4 μl β-Mercaptoethanol (14,4 M) erneut 10 min lang aufgekocht. Von den Proben wurden jeweils 10 µl gelelektrophoretisch analysiert.

4.4.6 Massenspektrometrische Analysen

Zur Analyse der Interaktionspartner von EGFP-SOLO wurde eine EGFP-spezifische Immunpräzipitation aus Ovarien (siehe 4.4.5) durchgeführt und die kopräzipitierten Proteine mittels Massenspektrometrie ausgewertet. Als Kontrolle erfolgte eine Immunpräzipitation von CapH2-EGFP, um unspezifische Interaktionspartner nachzuweisen und diese dann in den SOLO-Proben nicht zu berücksichtigen. Die gelelektrophoretische Auftrennung der Eluate erfolgte mit kommerziellen Gradientengelen (6-16% Precise ProteinGel (Thermo Scientific)) auf Tris-HEPES-Basis (Thermo Scientific). Nach der Färbung der SDS-Gele mit GelCode Blue Stain Reagent (Thermo Scientific) wurden die einzelnen Laufspuren mit einem sterilen Skalpell in je drei Stücke geschnitten und zur massenspektrometrischen Untersuchung an das Biochemie-Zentrum der Universität Heidelberg geschickt (Arbeitsgruppe: Johannes Lechner). Als signifikante Koimmunpräzipitation wurden diejenigen Proteine/Peptide angesehen, die einen score aufwiesen, der höher als 75 war. Alle so erhaltenen Informationen wurden anschließend mit FlyBase (Flybase, 2003) abgeglichen. Eine Liste mit den nachgewiesenen Interaktionspartnern von EGFP-SOLO findet sich im Anhang Tab.1.

4.4.7 Expression und Reinigung von His6-SMC11-133

Für die heterologe Expression erfolgte eine Transformation des Plasmids pQE80-His-SMC11-133 (zur Verfügung gestellt von B. Jaunich) in E. coli Rosetta-Zellen (Tab.7). Von diesen wurde eine 5 ml Vorkultur (LB/Amp) angesetzt und über Nacht bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Ausgehend davon wurde am nächsten Tag eine 200°ml-umfassende Expressionskultur beimpft und bis zum Erreichen einer OD₆₀₀ von 0,4 bis 0,6 bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Die Messung der Zelldichte erfolgte am Photometer OD600 DiluPhotometer von IMPLEN. Zur Induktion der Expression wurde IPTG in einer Endkon-zentration von 1 mM zugegeben und die Expression über einen Zeitraum von 4 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nach Sedimentation der Bakterien durch Zentrifugation (Heraeus; 6,000x g, 15°min, 4°C) wurde der Überstand dekantiert und das Bakterienpellet in 40 ml steril filtriertem Puffer A (50 mM NaH₂PO₄; 300 mM NaCl; pH 8,0) resuspendiert. Durch Druckluft mit dem Zellcrusher (Emulsi Flex-C5 von Avestin) wurde das Bakterienpellet aufgeschlossen.

Der Aufschluss erfolgte über einen Zeitraum von 20 min. Mit Hilfe von Löslichkeitstests konnte gezeigt werden, dass das entsprechende Fusionskonstrukt fast ausschließlich als unlösliches Protein in den inclusion bodies der Bakterien vorlag (Daten nicht gezeigt), sodass eine denaturierende Ni-NTA-Affinitätschromatographie angeschlossen wurde.

Das SMC1_1-113-enthaltene Proteinpellet wurden in 8 ml Puffer B resuspendiert (100 mM NaH₂PO₄; 10 mM Tris·Cl; 8°M Harnstoff; pH 8,0) und mit 2 ml äquilibrierter Ni-NTA-Agarose (Macherey Nagel) versetzt und über Nacht bei 4°C unter Rotation inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde die Proteinlösung in eine Poly-Prep Chromatography Säule von BioRad gegeben und der Durchlauf separat aufgefangen. Anschließend wurde zweimal mit jeweils 7°ml Puffer C (100 mM NaH₂PO₄; 10 mM Tris·Cl; 8 M Harnstoff; pH 6,3) gewaschen und das His₆-markierte Protein in 1 ml-Fraktionen durch die Zugabe von 5 ml Puffer E (100 mM NaH₂PO₄; 10nmM Tris·Cl; 8 M Harnstoff; pH 4,5) eluiert.

4.4.8 Affinitätsreinigung von SMC11-133-Antikörpern

Die Expression einer His₆-SUMO-markierten Version von SMC1_1-133 wurde von K. Seel im Rahmen ihrer Bachelorarbeit (Seel, 2010) durchführt. Dieses Fusionskonstrukt wurde anschließend unter denaturierenden Bedingungen gereinigt und als Antigen für die

Generierung polyklonaler Kaninchen-Antikörper verwendet. Zur Affinitätsreinigung der entsprechenden Immunseren erfolgten die Expression von His-SMC1_1-133 (ohne SUMO) und eine anschließende Ni-NTA-Affinitätschromatographie analog dem unter 4.4.7 beschrie-benen Protokoll. Die entsprechenden Elutionsfraktionen mit der höchsten Proteinmenge wurden gegen denaturierenden Kopplungspuffer (0,1 M NaHCO₃; 0,5 M NaCl; 6 M Harnstoff;

pH 8,3-8,5) dialysiert und an CNBr-aktivierte Sepharose gekoppelt. Hierzu wurden 0,5 g CNBr-aktivierte Sepharose (Sigma Aldrich) in 1 mM HCl 30 min lang auf Eis gequollen und anschließend in 5 ml H₂O wieder aufgenommen und in eine Chromatographiesäule überführt. Nach Äquilibrierung mit Kopplungspuffer wurden die dialysierten Proteinpools zugeben und über Nacht bei 4°C unter Rotation inkubiert. Die Proteinlösung wurde anschließend auslaufen gelassen und die Säule mit Kopplungspuffer gewaschen. Zum Blockieren der aktiven Gruppen wurde das Säulenmaterial mit 5 ml 0,3 M Glycin (pH 8,0) 2 h lang bei 4°C unter Rotation inkubiert und anschließend erneut mit Kopplungspuffer gewaschen. Anschließend erfolgten fünf Wiederholungen von Waschschritten mit jeweils 5°ml Kopplungspuffer bzw. 5 ml Acetatpuffer (0,1°M Na-Acetat; 0,5 M NaCl; pH 4,0). Nach Zugabe von 5x 5 ml PBS/0,1% Na-Azid wurden 5°ml der anti-SMC1 Immunseren IS27 bzw.

IS29 auf die Säule aufgetragen und 1 h lang bei 4°C unter Rotation inkubiert. Der Durchlauf wurde separat aufgefangen und das Säulenmaterial mit PBS und BBS-Tween (0,1 M Borsäure, 0,025 M Na-Tetraborat, 1 M NaCl, 0,1% (w/v) Tween, pH 8,3) gewaschen. Für die Elution wurden entsprechende Reaktionsgefäße mit 250 µl 1 M K2HPO4 vorbereitet und durch Zugabe von zunächst 1 ml Elutionspuffer (2 M Glycin; 10 % 1,4-Dioxan, pH 2,2) und anschließendem PBS wurde der Antikörper eluiert. Alle so aufgefangenen 15 Elutions-fraktionen wurden mit je 100 µl NGS versetzt und in initialen Immunblotanalysen charakterisiert. Die geeigneten Fraktionen wurden anschließend gegen PBS dialysiert und mit 0,1 % (w/v) Na-Azid versetzt.

Für den polykonalen SMC11-133-Antikörper zeigte sich, dass der affinitätsgereinigte Antikörper aus dem Immunserum 27 für den Immunblot besser geeignet ist, da er eine höhere Sensitivität aufweist. Nichtsdestotrotz erkennt dieser Antikörper noch zwei weitere Proteine, die jedoch ein deutlich geringeres Molekulargewicht aufweisen als SMC1. Eine 1:2000-Verdünnung erwies sich dabei als besonders geeignet. Für die Immunfluoreszenz-analysen eignen sich die Antikörper aus dem Immunserum 29 besser. Hier ist die beste Verdünnungsstufe 1:200.