Rad21 als Bestandteil eines meiotischen Cohesinkomplexes?

Die Interaktion von Rad21 und C(2)M liefert einen ersten Hinweis darauf, dass Rad21 auch in der Meiose von Drosophila melanogaster eine essentielle Funktion übernehmen könnte. Um weitere Hinweise für diese Annahme zu erhalten, wurden Chromosomenspreads durchgeführt, die eine klare Kolokalisation der mitotischen Cohesinuntereinheit mit der SC-Komponente C(3)G aufzeigen. Aufgrund der Auflösungsgrenze des verwendeten Lichtmikroskops konnte jedoch keine genauere Aussage über die exakte Lokalisation von Rad21 innerhalb des SCs getroffen werden. Hierzu müssten höherauflösende Mikroskopietechniken, wie zum Beispiel Immun-Elektronenmikroskopie oder 3D-SIM-Mikroskopie (3D Structured Illumination Microscope) verwendet werden. Mit Hilfe der letztgenannten Methode konnte unter anderem Corolla als eine Komponente des zentralen Elements charakterisiert werden (Collins et al., 2014), da das Immunfluoreszenzsignal dieses Proteins als ein einzelnes Signal innerhalb der beiden Signale des C-terminal-gerichteten C(3)G-Signals sichtbar war.

In Immunfluoreszenzanalysen von intakten Ovarien konnte Rad21 nicht am meiotischen Chromatin nachgewiesen werden. Eine mögliche Ursache hierfür könnte eine Maskierung der von den Antikörpern erkannten Epitope sein, welche durch die intensiven Waschschritte mit Detergenzien bei der Durchführung der Chromosomenspreads entfernt wird und so die Antikörperzugänglichkeit deutlich erhöht.

Um die Frage eindeutig zu klären, ob Rad21 als ausschließliches kohäsives Kleisinprotein in der weiblichen Meiose von Drosophila melanogaster fungiert, wurde eine Situation geschaffen, bei der es zu einer Oogenese-spezifischen Inaktivierung der Cohesin-untereinheit kommt. Hierzu erfolgte eine TEV-Protease-abhängige Spaltung von Rad21 im Pachytän der Prophase I. Geht man von einer kohäsiven Funktion der mitotischen Cohesinuntereinheit in Meiose aus, würde man eine frühzeitige Dissoziation der homologen Chromosomen und der Schwesterchromatiden erwarten, die dann zu Fehlverteilungen in beiden meiotischen Teilungen führt. Mit Hilfe der durchgeführten FISH-Analysen und weiterer Immunfluoreszenzuntersuchungen mit zentromerischen Markerproteinen konnten jedoch keine Segregationsdefekte in Meiose nachgewiesen werden. Da dieses System bereits in mitotisch-proliferierenden Geweben dazu verwendet wurde Rad21 effizient zu inaktivieren und massive Segregationsdefekte zu induzieren (Pauli et al., 2008), wären auch Segregationsdefekte in der Meiose nach effizienter ektopischer Rad21-Hydrolyse zu erwarten gewesen, sofern dieses Protein eine signifikante kohäsive Funktion erfüllt. In der Oogenese der Fruchtfliege können jedoch Mechanismen vorliegen, die die Rad21-Zugänglichkeit der Protease deutlich beeinträchtigen. In Mausoozyten sind jedoch keine Meiose-spezifischen Abschirmungen der α-Kleisinproteine vorhanden, da die TEV-Protease vermittelte Spaltung des Rec8-Orthologs eine effiziente Inaktivierung der Cohesinunter-einheit und eine Zerstörung der meiotischen Schwesterchromatidkohäsion zur Folge hatte (Tachibana-Konwalski et al., 2010, Tachibana-Konwalski et al., 2013). Ist die Rad21-Spaltung in den Ovarien von Drosophila ebenfalls effizient genug, um potentiell die Auflösung der Schwesterchromatidkohäsion hervorzurufen, die dann zur Ausbildung massiver Segregationsdefekte führt? Diese Frage lässt sich nicht eindeutig beantworten.

Jedoch weisen Studien in der Bäckerhefe S. cerevisiae darauf hin, dass eine Reduktion des Rad21-Levels auf 13% der ursprünglichen Menge keinen Einfluss auf die Schwesterchromatidkohäsion oder die Segregation der Chromosomen hat (Heidinger-Pauli et al., 2010). Unter der Annahme, dass dieser Zusammenhang in der Meiose von Drosophila melanogaster ebenfalls gegeben ist, ist nicht auszuschließen, dass bei einer nicht-gespaltenen Restmenge von 5-10% (Nagarkar, 2010, Urban et al., 2014) noch genügend intaktes Rad21 übrig ist, welches die Aufrechterhaltung der Kohäsion in Meiose ermöglicht.

Wenn diese Restmengen an ungeschnittenem Rad21 ausreichen sollten eine ungestörte Progression durch die Meiose zu unterstützen, sollten auch die frühen mitotischen Teilungen im Zytoplasma des Embryos weitestgehend ungestört verlaufen. In der anschließenden Embryogenese kam es aber zur Ausprägung massiver mitotischer Defekte schon während der ersten Teilungen, was zur Letalität der entsprechenden Embryonen führte. Also kann daher davon ausgegangen werden, dass schon unmittelbar nach Beendigung der Meiose nicht genug intaktes Rad21 vorhanden ist um Schwesterchromatidkohäsion zu vermitteln.

Um diesen Erklärungsansatz für das Ausbleiben der meiotischen Phänotypen jedoch gänzlich auszuschließen, wurde in einem reziproken Ansatz untersucht, welche Konsequenzen das Vorhandensein einer Rad21-Version hervorruft, die nicht mehr durch Separase gespalten werden kann. Hierzu erfolgte die Oogenese-spezifische Expression einer Rad21-Variante (Rad21^NC), bei der zwei potentielle Separase-Spaltstellen dahingehend mutiert waren, dass eine gezielte Proteolyse nicht mehr erwartet wird. Da es in Drosophila bislang nicht gelungen ist einen biochemischen assay zu etablieren, der eine Separase-abhängige Spaltung der Kleisinuntereinheit Rad21 beim Übergang von Metaphase zur Anaphase in vitro nachvollzieht, konnte die Funktionalität diese Konstrukts nicht biochemisch nachgewiesen werden. Aufgrund der beobachteten Phänotypen nach Expression von Rad21^NC in mitotisch-proliferierenden Geweben ist jedoch davon auszugehen, dass die gezielte Mutagenese der Separase-Spaltstellen zur Stabilisierung der Schwesterchromatid-kohäsion führt. Die Kohäsion kann somit zum Ende der Mitose nicht mehr aufgelöst werden und deshalb kommt es zu massiven Defekten bei der Zellteilung und zur Ausbildung von Anaphasebrücken. Da diese Abnormalitäten jedoch nur bei mitotischen Zellteilungen auftreten und der Verlauf der Meiose nach Expression von Rad21^NC keinerlei Beeinträch-tigungen aufweist, konnte ein weiterer Hinweis dafür erbracht werden, dass Rad21 kein essentieller Bestandteil eines kohäsiven, meiotischen Cohesinkomplexes ist.

Da jedoch durch die gezielte Proteolyse von Rad21 eine frühzeitige Destabilisierung des SCs hervorgerufen wird, ist davon auszugehen, dass die mitotische Cohesinuntereinheit Rad21 doch eine Funktion während der Oogenese erfüllt, die sich von der Aufrechterhaltung der meiotischen Kohäsion unterscheidet. Unter Berücksichtigung aller Daten scheint es demnach keine einfache Antwort auf die Frage zu geben, ob Rad21 Bestandteil eines meiotischen Cohesinkomplexes ist. Einerseits konnten keine Kohäsionsdefekte nach Inaktivierung von Rad21 festgestellt werden, anderseits scheint es so, als ob Rad21-enthaltende Cohesinkomplexe zur Aufrechterhaltung des SCs benötigt werden. Damit konnte erstmals gezeigt werden, dass eine mitotische Kleisinuntereinheit essentiell für die Stabilität des SCs ist. In anderen Organismen übernehmen diese Funktionen die entsprechenden meiotischen Äquivalente Rad21L und Rec8 (Llano et al., 2012, Murdoch et al., 2013) und in C. elegans die drei beschriebenen Kleisine Rec8, COH-3 und COH-4 (Severson et al., 2009).

Der SC stellt ein Proteingerüst dar, welches die Paarung und anschließende Rekombination der homologen Chromosomen ermöglicht (Fawcett, 1956, Moses, 1956). Die Rad21-abhängige Destabilisierung des SCs setzt erst ab Region 3 im Germarium ein und die vollständige Disassemblierung ist erst im Stadium 3 bis 4 nachweisbar, also zu einem Zeitpunkt zu dem die meiotischen Rekombinationsereignisse bereits stattgefunden haben.

Dadurch sollte es auch zur korrekten Ausbildung der Chiasmata kommen, die wiederum zur

Aufrechterhaltung der meiotischen Kohäsion beitragen. Durch die TEV-Protease-vermittelte Inaktivierung von Rad21 wurde lediglich eine Beteiligung der mitotischen Cohesinunterein-heit in Bezug auf die Erhaltung der SCs nachgewiesen. Jedoch konnte mit keiner der verwendeten Methoden zur Inaktivierung von Rad21 ein Effekt in Bezug auf die SC-Etablierung festgestellt werden. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte sein, dass der verwendete Treiber entweder nicht rechtzeitig einsetzt, oder dass es eine gewisse Zeit dauert, bis genügend TEV-Protease exprimiert wird, um eine nahezu vollständige Spaltung der α-Kleisinuntereinheit herbeizuführen.

Der Phänotyp der frühzeitigen Disassemblierung des SCs konnte nicht nur nach TEV-Protease-vermittelter Inaktivierung von Rad21^TEV-myc im mutanten Hintergrund nachgewiesen werden, sondern auch in Anwesenheit eines wildtypischen Allels. Um zu testen, ob diese Beobachtung auf eine Reduktion der Rad21-Gendosis auf 50%

zurückzuführen ist, wurde die Kinetik des SC-Zerfalls in heterozygot-mutanten Weibchen untersucht. Hierbei wurde jedoch keine frühzeitige Destabilisierung des SCs nachgewiesen.

Weiterhin kann nahezu ausgeschlossen werden, dass die beobachtete Disassemblierung aufgrund dominant-negativer Effekte der entstandenen Spaltprodukte zustande kommt, da diese Beobachtung bei allen spaltbaren Rad21-Versionen zu verzeichnen ist und auch nach Induktion des SCF-abhängigen Abbaus von Rad21-EGFP. Eine mögliche Erklärung für dieses Phänomen könnten mehrere miteinander verknüpfte Cohesinringe sein, die benötigt werden um eine Assoziation des lateralen Elements mit den Chromosomen cores aufzubauen. Vorstellbar wäre hier eine Assoziation, ähnlich dem bereits beschriebenen handcuff-Modell oder dem bracelet-Modell (siehe Abb. 4). Würde man von einer solchen Rad21-abhängigen Verknüpfung des Cohesins mit dem SC ausgehen, könnte man auch erklären, weshalb eine frühzeitige Disassemblierung des SCs stattfindet, wenn ca. 50% der vorhandenen Rad21-Menge durch TEV-Protease-abhängige Spaltung inaktiviert werden.

Bereits 2007 lieferten Khetani und Bickel die ersten Überlegungen dahingehend, dass für die Assoziation des Cohesins mit dem axialen Element vermutlich miteinander-verknüpfte Cohesinketten benötigt werden. Da in jeder der 16 Zellen einer Zyste SMC1 und SMC3 entlang der Chromosomenarme nachweisbar waren, jedoch nur in den späteren Pro-Oozytenkernen fadenförmige Strukturen ausgebildet werden, welche sich durch Verkettungen der Cohesinmoleküle erklären lassen. Sie gingen weiterhin davon aus, dass in den Zellen, die später die Nährzellen ausbilden, das Chromatin in einem Interphase-ähnlichen Zustand vorliegt, bei dem die Cohesinkomplexe entlang der Chromosomenarme lokalisiert sind, jedoch nicht zur Assemblierung komplexerer Strukturen befähigt sind. In den Pro-Oozytenkernen hingegen kommt es zur Ausbildung der Chromosomen cores, die wiederum nur gebildet werden können, wenn eine Vielzahl an Cohesinmolekülen miteinander verbunden werden und so eine Verkürzung entlang der Längsachse eines jeden

Schwesterchromatidenpaares ermöglicht. Wie genau bestimmt wird, in welcher der 16 Zellen die Etablierung einer Pro-Oozyte vonstattengeht, ist noch nicht vollständig geklärt.

Entscheidend ist hierbei jedoch, dass die zwei Zellen gewählt werden, die über vier Ringkanäle mit den entsprechenden Nachbarzellen verbunden sind, da nur so eine bestmögliche Versorgung der heranreifenden Oozyte gewährleistet werden kann. Ein weiteres Merkmal der frühen Oogenese ist das Vorhandensein von C(2)M, welches nach dem Durchlaufen der prämeiotischen S-Phase zunächst in allen 16 Zellen der Zyste nachzuweisen ist und später nur noch in den zwei Zellen zu finden ist, die auch einen SC ausbilden (Manheim und McKim, 2003, Heidmann et al., 2004). Fehlt dieses Protein, können keine Chromosomen cores ausgebildet werden und SMC1 und SMC3 sind nur noch als diffuses Signal am Chromatin zu finden, was jedoch für die Aufrechterhaltung der meiotischen Kohäsion ausreichend ist. Geht man nun davon aus, dass Rad21 mit C(2)M assoziiert vorliegt und C(2)M für die Verkürzung entlang der Längsachsen der Schwesterchromatidenpaare benötigt wird, dann ist es denkbar, dass durch die direkte Interaktion der beiden Kleisine die Grundvoraussetzung für die Ausbildung vernetzter Cohesinkomplexes geschaffen wird. Vorstellbar wäre hierbei eine Verknüpfung der einzelnen SMC-Moleküle über eine C(2)M-Rad21-abhängige Oligomerisierung, die dann zur Ausbildung von längeren Filamenten führt Diese Filamente bewerkstelligen dann die Verknüpfung zwischen Cohesin und dem SC. Auch eine Variante des handcuff-Modells wäre denkbar, bei dem es zur C(2)M-abhängigen Dimerisierung der einzelnen Cohesinmoleküle kommt. Zusammenfassend ist jedoch festzuhalten, dass in der Oogenese von Drosophila melanogaster mindestens zwei verschiedene Cohesinkonplexe generiert werden müssen.

Der erste besitzt kaum kohäsive Eigenschaften und dient der Verknüpfung der Chromosomen mit dem SC, was einen Einfluss auf die Rekombination hat. Als Kleisine würde dieser Komplex Rad21 und C(2)M besitzen, welche eventuell für die Generierung komplexerer Strukturen benötigt werden. Als zweiten Komplex gäbe es dann noch mindestens einen kohäsiven Cohesinkomplex, der für die Etablierung und Aufrechterhaltung der meiotischen Kohäsion benötigt wird. Ob dieser Komplex in Drosophila eine Separase-schneidbare Kleisin-Untereinheit enthält, bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten.

Allerdings entspräche dies der Erwartung, da Separase während der beiden meiotischen Teilungen in Drosophila-Weibchen aktiviert wird (Heidmann et al., 2004).