Methoden im Umgang mit Saccharomyces cerevisiae

4.5.1 Herstellung transformationskompetenter Hefen

Die Herstellung transformationskompetenter Hefen wurde wie bereits bei Knop et al., 1999 beschrieben, durchgeführt. Dabei wurden 500 ml YPD-Medium (1 % Bacto Hefeextrakt (Difco) (w/v), 2 % Bacto Pepton (Difco) (w/v), 2 % Glukose (w/v)) mit einer Übernachtkultur angeimpft und bis zu einem Erreichen einer OD₆₀₀ von 0,5 bis 0,7 unter Schütteln inkubiert.

Nach dem Pelletieren (1,000x g, 5 min, Heraeus) von Aliquots zu je 50 ml wurden die Zellen anschließend mit sterilem Wasser und mit SORB-Puffer (100 mM LiOAc, 10 mM Tris/HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA/NaOH, pH 8,0, 1 M Sorbitol) gewaschen. Danach wurde das Pellet mit 40°µl einzelsträngiger Lachsspermien-DNA (2 mg/ml, Invitrogen; Denaturierung: 5 min. bei 95°C) und 360 µl SORB-Puffer versetzt und die Hefezellen resuspendiert und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C gelagert.

4.5.2 Transformation von Plasmid-DNA in S. cerevisiae

Für die Transformation wurden 105 µl PEG-Puffer (100 mM Lithium Acetat, 10 mM Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA/NaOH pH 8,0, 40 % (w/v) Polyethylen Glycol PEG-3350), 15 µl einzelsträngige Lachsspermien-DNA (2 mg/ml), 20 µl kompetente Hefen (siehe 4.5.1) und jeweils 500 ng der beiden Plasmide zugegeben und 30 min bei 30°C inkubiert. Nach 25-minütiger Hitzschockbehandlung bei 42°C wurden die Hefezellen pelletiert (1 min, 1000 g) und in 100 µl sterilen Wasser resuspendiert und auf SC-Leu-Trp-Platten (0,67 % (w/v) Yeast nitrogen base, 2 % (w/v) Glucose, 2% Agar, 0,5% Ammoniumsulfat, 0,083 % (w/v) Aminosäure-Mix, pH 5,6) ausplattiert.

4.5.3 Hefe-2-Hybrid System

Zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen wurde das Hefe-2-Hybrid-System verwendet. Grundlage hierfür ist, dass zwei Vektoren (pACT2 und pAS2-1, Clontech) kotransformiert werden, die jeweils Gensequenzen für Proteine enthalten, deren Wechsel-wirkung untersucht werden sollen. Die entsprechenden Proteine werden als Fusions-konstrukt exprimiert, die entweder mit der DNA-Bindedomäne des Transkriptionsfaktors Gal4 fusioniert sind oder mit der Aktivierungsdomäne von Gal4 verknüpft sind. Interagieren die zu untersuchenden Proteine, führt dies dazu, dass die Gal4-Fragmente in räumliche Nähe zueinander gebracht werden und so an die Promotorregion von Reportergenen binden können und deren Expression aktivieren. Als Reportergen wird hier das HIS3-Gen herangezogen, sodass anschließend untersucht werden kann, ob die Hefen in der Lage sind Histidin zu synthetisieren und auf den entsprechenden Minimalmedien (-His) zu wachsen.

Nach der Transformation der beiden Vektoren pACT2 und pAS2-1, welche die entsprechenden Genregionen der zu untersuchenden Proteine kodieren, wurden die SC-Leu-Trp-Platten mindestens 3 Tage bei 30°C inkubiert. Anschließend wurden mehrere Kolonien von der Platte abgenommen und in sterilem Wasser resuspendiert und eine OD₆₀₀ von 1 eingestellt. Ausgehend davon wurden dann Verdünnungsstufen von 1:5, 1:25, 1:125, 1:625 und 1:3125 hergestellt und jeweils 5 µl der entsprechenden Verdünnung auf SC-Leu-Trp-Platten bzw. auf SC-Leu-Trp-His-Platten aufgebracht und mindestens 3 Tage bei 30°C inkubiert. Für die durchgeführten 2-Hybridanalysen wurden zwei verschiedene Hefestämme verwendet. Der Hefestamm PJ69–7A (modifizierte Version von PJ69-4A: MATa trp1-901 leu2-3,112 ura3-52 his3-200 gal4Δ gal80Δ LYS2::GAL1-HIS3 GAL2-ADE2 met2::Gal7-lacZ (James et al., 1996)) wurde für die meisten 2-Hybridanalysen herangezogen. Der Stamm AH109 (MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ, LYS2::GAL1_UAS -GAL1_TATA-HIS3, GAL2_UAS-GAL2_TATA-ADE2, URA3::MEL1_UAS-MEL1_TATA-lacZ, Clontech) wurde nur für die in Abbildung 27A gezeigten Interaktionsstudien herangezogen.

4.5.4 Plasmide für Hefe 2-Hybrid-Analysen

Für die durchgeführten 2-Hybrid-Analysen wurden die Vektoren pACT2 und pAS2-1 (Clontech) verwendet. Deren MCS so modifiziert sind, dass sie die entsprechenden Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme FseI und AscI tragen (Orth et al., 2011).

Die kodierenden Bereiche der zu untersuchenden Interaktionspartner wurden dann unter Zuhilfenahme dieser beiden Enzyme in die Vektoren pAS2-1 und pACT2 kloniert. Dabei wurden die benötigen Gensequenzen entweder aus Ovarien-cDNA amplifiziert oder mit Hilfe kommerzieller cDNA-Klone (siehe Tab. 6) generiert. Die hierfür benötigten Oligonukleotide wurden so generiert, dass sie die Erkennungssequenz der Enzyme FseI bzw. AscI tragen und zwischen dem Startkodon und der entsprechenden Schnittstelle ein weiteres Nukleotid

vorhanden war, da nur so die N-terminale Fusion mit der Bindedomäne/Aktivierungsdomäne gewährleistet ist.

Tabelle 13: Oligonukleotide für die Klonierung von SMC1head und SMC3hdCC

Name Sequenz von 5‘-3‘ Besonderheiten

EU28 ataGGCGCGCCtcgtgtcctcgaacgttgtca SMC1_head,reverse, C-Term.

Mit AscI-Erkennungsseq.

EU143 ataaGGCGCGCCtcgattcgttgcgtgttgc SMC1_head,forward, C-Term.

Mit AscI-Erkennungsseq. Die großgeschriebenen Buchstaben stellen Erkennungssequenzen der Restriktionsenzyme dar.

Für die Klonierung von SMC1_head und SMC3hdCC wurden die in Tab. 13 aufgelisteten Oligonukleotide verwendet, die neben der Erkennungssequenz für die Restriktionsenzyme und dem entsprechendem Genbereich auch noch die kodierende Sequenz für eine Linkerregion enthalten. Für die in Abbildung 27A oben gezeigte Interaktion wurde der Vektor pBridge (Clontech) verwendet, der die Expression von zwei Genen ermöglicht. Die kodierende Sequenz von SOLO wurde zunächst mittels PCR amplifiziert (EU179/EU180, Tab.13) und anschließend mit Hilfe der Restriktionsenzyme EcoRI und BamHI in den Vektor pBridge kloniert. Zwischen der Sequenz, die für die Gal4-Bindedomäne kodiert und der SOLO-Sequenz wurde eine Linkerregion eingefügt, um die Interaktion von SOLO und SMC1 zu ermöglichen. Die hierfür benötigten Oligonukleotide EU196/EU197 sind in Tab. 13 aufgelistet. Diese komplementären Oligonukleotide wurden zuvor durch ein kurzes Erhitzen und eine anschließende Abkühlung in 2x Duplex-Puffer (200 mM Kaliumacetat, 60 mM

HEPES, pH7,5) miteinander hybridisiert. Dabei entstanden kompatible Enden, mit deren Hilfe in den EcoRI-hydrolysierten pBridge-SOLO kloniert wurde. In die zweite Multiple-Klonierungsstelle wurde unter Zuhilfenahme von NotI die kodierende Sequenz von Rad21 bzw. von EGFP gesetzt. Die hierfür benötigten Oligonukleotide finden sich in Tab.8

4.5.5 Proteinextraktion aus Saccharomyces cerevisiae

Zum Nachweis der Methionin-abhängigen Proteinsynthese wurde aus den entsprechenden Hefen die Gesamtproteinmenge mit Hilfe einer TCA-Fällung isoliert. Hierzu wurde 1 ml Hefekultur mit einer OD₆₀₀ von 1 pelletiert, dann 150 µl 1,85 M NaOH/7,5% β-Mercaptoethanol zugegeben und 15 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 150 µl 55%

TCA wurde erneut 15nmin auf Eis inkubiert. Anschließend wurde 10 min lang bei 4°C zentrifugiert (16,000x g) und das so generierte Pellet in 100 µl HU-Puffer (8 M Harnstoff, 5%

SDS, 1 mM EDTA, 100 mM DTT und 0,01% Bromphenolblau) aufgenommen und bei 95°C aufgekocht.