solo-mutante Oozyten können keinen stabilen Metaphase-I-Arrest aufrechterhalten . 54

solo-mutante Oozyten sind durch einen massiven Kohäsionsverlust (siehe 2.2.3) und eine reduzierte Rekombinationsrate gekennzeichnet (Yan und McKee, 2013). Daran anknüpfend wurde im nächsten Schritt getestet, inwiefern diese Oozyten noch in der Lage sind einen MeiosenI-Arrest aufrechtzuerhalten. In Weibchen, bei denen es zu einer Beeinträchtigung der meiotischen Rekombination kommt, steigt auch immer der Anteil an Oozyten in denen keine crossover ausgebildet werden. Diese Oozyten sind dann nicht mehr in der Lage einen stabilen Metaphase I-Arrest aufrechtzuerhalten (McKim et al., 1993). In ord-mutanten Oozyten ist die crossover-Anzahl etwa um das 6-fache reduziert (Mason,1976), jedoch konnte in keiner der untersuchten ord-mutanten Oozyten eine normale Metaphase I-Spindel nachgewiesen werden, obwohl in etwa 16,7% der Oozyten crossover ausgebildet werden (Bickel et al., 2002). Demnach wird ORD für die Aufrechterhaltung und Stabilisierung der Chiasmata benötigt, was wiederum essentiell für die Etablierung eines stabilen Metaphase

I-Arrests ist (Bickel et al., 2002). solo-mutante Oozyten sind ebenfalls durch eine reduzierte Rekombinationsrate gekennzeichnet (Yan und McKee, 2013). Die Reduktion der crossover-Anzahl liegt dabei in einer vergleichbaren Größenordnung wie die der ord-mutanten Oozyten (10-fache für SOLO bzw. 6-fache Reduktion für ORD; Yan und McKee, 2013, Mason, 1976).

Um zu überprüfen, ob SOLO ebenfalls eine Funktion bei der Aufrechterhaltung des Metaphase I-Arrests erfüllt, wurden Oozyten isoliert, mit Ultraschallimpulsen aufgeschlossen und zur Visualisierung der der Meiose-Spindel mit Tubulin-spezifischen Antikörpern gefärbt.

Ein Großteil der solo-mutanten Oozyten wies deutlich fragmentierte DNA-Massen auf (Abb.

25A). In einigen Fällen zeigten sich sogar zwei Spindeln mit insgesamt vier DNA-Massen, welche typisch für Meiose II-Figuren sind (Abb. 25 A, untere Reihe, links).

Abbildung 25: solo-mutante Oozyten können keinen stabilen Metaphase I-Arrest aufrechterhalten. Repräsentative Darstellung von überlagerten Z-Stapeln einzelner Oozyten. Die DNA ist in rot gezeigt (gefärbt mit Hoechst 33258) und Tubulin in Grün. Der Genotyp der entsprechenden Weibchen ist angegeben. Der Längenmaßstab beträgt in allen Bildern 10 μm. Im Bild unten links ist eine andere Vergrößerung gewählt. Der eingetragene Maßstab entspricht jedoch ebenfalls 10^µm. (B) Tabellarische Auflistung der prozentualen Verteilung der meiotischen Figuren.

In einem Großteil der untersuchten Oozyten konnten deutliche Meiose-I-Spindeln nachgewiesen werden. Jedoch lagen die Chromosomen nicht als eine bzw. zwei eng beieinanderliegende DNA-Massen zentral in der Spindel positioniert, wie es charakteristisch für Metaphase-arretierte Oozyten ist (Abb. 25, obere Reihe rechts), sondern waren deutlich weiter voneinander getrennt. Dieser Phänotyp ist charakteristisch für die Segregation der Chromosomen während der Anaphase. Geht man nun von einer Reduktion der

Rekombinationsfrequenz auf etwa 10% aus (entspricht einer reduzierten Rekom-binationsrate um das 10-fache), sollte man auch einen solchen Anteil an MetaphasenI-arretierte Oozyten nachweisen können. Von den untersuchten 72 Oozyten zeigte sich jedoch nur einmal ein stabiler MetaphasenI-Arrest (Abb. 25B), bei dem das einzige Chromatinsignal innerhalb der Metaphaseplatte angeordnet war. Da die Anzahl der beobachteten Meta-phase°I-Arreste deutlich unterhalb des erwarteten Wertes liegt, scheint SOLO, genau wie ORD, eine Funktion bei der Aufrechterhaltung der Chiasmata bzw. auf deren Stabilität zu haben. Bei den heterozygot-mutanten Oozyten waren bei 17% der untersuchten Fälle meiotische Figuren zu finden, die keinen stabilen Metaphasearrest aufrechterhalten konnten.

Somit ist auch bei diesen Individuen die Rekombination vermutlich deutlich eingeschränkt, was sich auch darin äußert, dass sich bei einer Vielzahl der Metaphase I-Figuren einzelne Chromosomen außerhalb der kompaktierten DNA-Masse befinden (Abb. 25A, obere Reihe Mitte). Im Normalfall liegen nur die 4. Chromosomen außerhalb der Metaphaseplatte, da diese Chromosomen keine Chiasmata ausbilden (Übersichtsartikel: Hochman, 1976).

Das Fehlen von SOLO und ORD hat demnach ähnliche Auswirkungen auf die Aufrechterhaltung des Metaphase I-Arrests. Beide Proteine wirken somit nicht nur im selben pathway auf die meiotische Rekombination (Yan und McKee, 2013, Mason, 1976) und den Homolog Bias (Reparatur der DSBs mit Hilfe der homologen Chromosomen, Yan und McKee, 2013, Webber et al., 2004), sondern fungieren eventuell auch bei der Stabilisierung der Chiasmata zusammen in einem Komplex.

2.2.5 Die RGG-repeats haben keine Funktion auf die Lokalisation von SOLO und die Kohäsion

Im N-terminalen Bereich von SOLO (AS: 1-137) liegen RGG-repeats, die typischerweise in RNA-bindenden Proteinen zu finden sind (Alex und Lee, 2005). Um zu untersuchen, ob dieses Motiv eine essentielle Funktion bei der Cohesinassoziation, der SC-Assemblierung oder der Aufrechterhaltung der meiotischen Kohäsion hat, wurden Fliegen generiert, die eine verkürzte SOLO-Version exprimieren, bei der die ersten 137 Aminosäuren deletiert sind (Abb. 26A). Die Expression erfolgte mit nos-Gal4. Das Proteinlevel wies lediglich eine geringe Reduktion gegenüber dem entsprechenden EGFP-fusioniertem SOLO-Konstrukt voller Länge auf (Abb. 26B). Darüber hinaus konnte mit Hilfe der durchgeführten Chromosomenspreads keine signifikante Änderung im Lokalisationsverhalten des verkürzten Proteins festgestellt werden (Abb. 26C). Somit wird das RNA-Bindemotiv von SOLO für eine SC- bzw. Chromatin-assoziierte Lokalisation nicht benötigt.

Abbildung 26: Die RGG-repeats haben keine Funktion auf die Lokalisation von SOLO und die Kohäsion. (A) Schematische Darstellung von SOLO. Die Zahlen unterhalb der Grafik geben die entsprechenden AS-Positionen innerhalb des Proteins an. Markiert sind die RGG-repeats (grau) und EGFP in grün. (B). Immunblot zur Abschätzung der Proteinlevel nach nos-GAL4 getriebener Expression von EGFP-SOLO^FL und EGFP-SOLO^ΔRGG. Der Nachweis der fluoreszenzmarkierten Konstrukte erfolgte mittels EGFP-spezifischen Antikörpern. Als Ladekontrolle wurde anti-Tubulin sondiert. Geladen wurden jeweils zwei Ovarienäquivalente. (C) Immunfluoreszenzanalysen an Chromosomenspreads. Gefärbt ist die DNA in rot (gefärbt mit Hoechst 33258), C(3)G in blau und EGFP-SOLO^FL/ΔRGG (anti-EGFP) in grün. (D) Repräsentative Darstellungen von Oozytenkernen von Eikammern des 6. Stadiums. Die DNA ist in rot gezeigt (gefärbt mit Hoechst 33258) und CID in grün.

Der Genotyp der entsprechenden Fliegen lautet: solo¹/solo²;nos-GAL4/UASp-EGFP-SOLO^FL/ΔRGG. Der Längenmaßstab beträgt 5 μm. (E) Durchschnittliche Anzahl der CID-Signale in den Oozytenkernen von Eikammern des Stadiums 5-7. Genotypen der verwendeten Fliegen: solo¹/solo² ;nos-GAL4/UASp-EGFP-SOLO^FL/ΔRGG (Rescue EGFP-SOLO^FL/ΔRGG), solo¹/solo² (SOLO Mutante), w¹ (Kontrolle).

Ausgezählt wurden jeweils 20 Eikammern.

Um Rückschlüsse auf die Funktionalität dieses verkürzten Konstrukts zu ziehen, erfolgte eine Expression im solo-mutanten Hintergrund. Mit Hilfe von CID-Färbungen wurde untersucht, inwiefern es zu einer möglichen Beeinträchtigung der Kohäsion in der weiblichen Meiose kommt. Im wildtypischen Hintergrund findet man an den Oozytenkernen von Eikammern des Stadiums 5 bis 7 im Durchschnitt 2,07±0,74 CID-Signale. Diese Zahl ist bei Expression von EGFP-SOLO^FL im solo-mutanten Hintergrund nur unwesentlich erhöht

(2,45±0,76) und auch die Expression von EGFP-SOLO^ΔRGG hatte kaum einen Einfluss auf die Kohäsion der Schwesterzentromere (2,27±0,78; Abb. 26D,E). Weiterhin wurde mit Hilfe von 2-Hybridanalysen untersucht, inwiefern das N-terminal-verkürzte SOLO-Konstrukt noch in der Lage ist mit SMC1 zu interagieren. Hierbei konnten keine Unterschiede zur nicht-trunkierten SOLO-Version festgestellt werden (Daten nicht gezeigt). Demnach haben die RGG-repeats keine Funktion für die Rekrutierung von SOLO ans meiotische Chromatin und auch nicht für die Aufrechterhaltung der meiotischen Kohäsion.

2.2.6 SOLO ist kein integraler Bestandteil eines meiotischen