Die Expression einer nicht Separase-spaltbaren Version von Rad21 hat keinen

Eine weitere mögliche Erklärung für das Fehlen von Segregationsdefekten nach artifizieller Spaltung von Rad21 wäre, dass noch geringe Mengen an intaktem Cohesin vorhanden sind, und diese ausreichend sind für die Aufrechterhaltung der meiotischen Kohäsion. Da eine quantitative Spaltung kaum realisierbar ist, wurde in einem komplementären Ansatz auf eine mutmaßlich Separase-resistente Rad21-Version zurückgegriffen, von der ein dominanter Effekt zu erwarten ist, weil die Kohäsion nicht mehr Separase-abhängig aufgelöst werden kann. Als Erkennungssequenz für die Separase wurde das Aminosäuremotiv EXXR nachgewiesen, was aber allein nicht ausreichend für eine Separase-abhängige Spaltung ist (Uhlmann et al., 1999). Die Aminosäuresequenz von Rad21 weist drei potentielle Separasespaltstellen auf, wobei die erste Sequenz (EGHR 101-104) sich vermutlich in der globulären Domäne von Rad21 befindet, die ein typisches Merkmal für Kleisinproteine ist und eine Interaktionsfläche mit den SMCs darstellt (Schleiffer et al., 2003). Diese Sequenz scheint demnach nicht als Separase-Substrat erkannt zu werden. Die anderen beiden potentiellen Spaltstellen liegen an den Aminosäurepositionen 172-175 bzw. an 471-474 und damit deutlich außerhalb dieser globulären Domäne. Um eine

Resistenz von Rad21 gegen eine Separase-abhängige Spaltung zu erreichen, wurden in diesen Sequenzbereichen die entsprechenden Arginine zu Alaninen mutiert (Abb. 19A). Die Generierung eines potentiell nicht-spaltbaren Rad21 (Rad21^NC) wurde von M. Jordan im Rahmen ihres Forschungspraktikums vorgenommen (Urban et al., 2014). Die Expression einer Separase-resistenten Version von Rad21 sollte erwartungsgemäß eine hohe Toxizität in proliferierenden Geweben aufweisen, da keine korrekte Trennung der Schwester-chromatiden mehr stattfinden kann. Um eine Abschätzung der Toxizität dieses Konstrukts zu erhalten, wurde Rad21^NC mittels ey-Gal4 während der Augenentwicklung in der Augen-imaginalscheibe exprimiert. In den adulten Fliegen, bei denen es zur Expression von Rad21^NC kam, waren deutlich reduzierte Augen als Phänotyp zu verzeichnen (Abb. 19B).

Diese Beobachtung ist konsistent mit der Hypothese, dass die Mutationen der potentiellen Separasespaltstellen zu den erwarteten Segregationsdefekten in proliferierenden Geweben führen.

Abbildung 19: Expression einer nicht-spaltbaren Version von Rad21 während der Augenentwicklung führt zur Ausbildung reduzierter Augen (A) Schematische Darstellung von Rad21^NC-9myc mit den Mutationen R175A und R474A. (B) Augenphänotypen von Fliegen mit folgenden Genotypen: ey-Gal4/+ (links) und ey-Gal4/+; UAS-Rad21^NC-9myc/+. Die Anzucht der Fliegen erfolgte bei 28°C.

Um einen Einfluss der Rad21^NC-Expression auf den Verlauf der Meiose zu untersuchen, erfolgte eine MTD-Gal4-abhängige Expression der nicht-spaltbaren Rad21-Version. Diese Treiberlinie kombiniert drei verschiedene Gal4-Konstrukte miteinander (siehe Material und Methoden) und ermöglicht somit eine sehr starke Expression in der Oogenese. Nach MTD-abhängiger Expression wies die Lokalisation des nicht-spaltbaren Rad21s keine merklichen Änderungen zu den bereits beschriebenen TEV-Protease-spaltbaren Varianten auf (Abb.

20A; Vergleich Abb. 8C), jedoch führte die Expression von Rad21^NC zur nahezu kompletten Sterilität der entsprechenden Weibchen. Demnach hat die Einführung der modifizierten Separasespaltstellen keinen Einfluss auf die Assoziation der Cohesinuntereinheit mit dem meiotischen Chromatin, jedoch führt die Oogenese-spezifische Expression von Rad21^NC zur Sterilität der entsprechenden Weibchen, welche entweder durch Defekte in der Meiose oder in den anschließenden synzytialen Teilungen hervorgerufen wird.

Abbildung 20: Die Expression einer nicht Separase-spaltbaren Version von Rad21 hat keinen Einfluss auf den Verlauf der Meiose. (A) Chromosomenspreads von Germarien von Weibchen, die Rad21^NC-9myc unter Kontrolle von MTD-GAL4 exprimieren. C(3)G ist mit entsprechenden Antikörpern nachgewiesen (grün) und das myc-Signal (Rad21^NC-9myc) ist in rot gezeigt. Der Größenmaßstab beträgt 5 µm. (B) Repräsentative Darstellungen von überlagerten Z-Ebenen von Embryonen, die von Müttern gelegt wurden, die Rad21^NC-9myc unter Kontrolle von MTD-GAL4 exprimieren. X-chromosomale Sonde (359 bp) ist in rot gezeigt. Der Größenmaßstab beträgt 50 µm. In allen Abbildungen ist die DNA mit Hoechst 33258 gefärbt (blau).

Um zu untersuchen, wie die beobachtete Sterilität zustande kommt, wurden FISH-Analysen von 20 Minuten alten Embryonen durchgeführt. Von den insgesamt 230 ausgewerteten Embryonen durchliefen 13 die zweite meiotische Teilung, bei der vier DNA-Massen ausgebildet werden, die von der Peripherie ausgehend ins Innere der Oozyte reichen. Bei keiner der 13 Meiose II-Figuren konnten jedoch Fehlverteilungen des X-Chromosoms oder andere Abnormalitäten, wie zum Beispiel Chromatinbrücken oder ungleichmäßig große DNA-Massen beobachtet werden (Abb. 20B).

In Embryonen, die die Meiose bereits abgeschlossen haben, wiesen die degenerierten Polkörper ebenfalls eine normale Morphologie auf und drei X-Chromosomen-spezifische FISH-Signale, wie im wildtypischen Hintergrund. Durch die maternale Kontribution von Rad21^NC kommt es jedoch zu einer deutlichen Beeinträchtigung der ersten mitotischen Teilungen in den betroffenen Embryonen. Bereits in der ersten Mitose waren in einer Vielzahl der Embryonen deutlich ausgeprägte Chromatinbrücken in der Anaphase nachzuweisen, die dann beim Durchlaufen weiterer Teilungen zum Teil auch in großen aggregierten DNA-Massen resultierten (Abb. 20B unten). Diese mitotischen Phänotypen sind konsistent mit der Annahme, dass diese Rad21-Variante tatsächlich resistent gegenüber der Spaltung durch Separase ist. Die Tatsache, dass durch die Expression von nicht-spaltbarem Rad21 derart massive Defekte in den ersten synzytialen Mitosen aufgetreten sind, während der Verlauf von Meiose in keiner Weise eine Beeinträchtigung erfahren hat, bestätigt die Annahme, dass die Separase-abhängige Spaltung von Rad21 keinen Einfluss auf die Chromosomen-segregation in Meiose hat.

2.1.7 Die zentromerische Lokalisation von SOLO zeigt keine