3. ERGEBNISSE UND DISKUSSION
3.9 I N VITRO S TUDIEN ZU DEN R IESKE -O XYGENASEN
3.9.1 Rekonstitution und Rückfaltung
In Zusammenarbeit mit A. PEIL wurde die denaturierende Proteingewinnung aus inclusion bodies (IB, Proteinaggregate innerhalb der Zelle) mit chemischer Rekonstitution des [FeS]-Clusters und abschließender Rückfaltung untersucht. Ein wesentlicher Vorteil von inclusion bodies ist, dass diese hauptsächlich aus überexprimierten Proteinen bestehen und somit das gewünschte Protein bereits in hohen Konzentrationen vorliegt. Für die Präparation der IBs wurden pCOLD-I jerP und pCOLD-I jerL in E. coli Tuner(DE3) exprimiert und die
IBs durch mehrere Lyse- und Waschschritte isoliert. Die Denaturierung wurde anschließend durch Zugabe von Harnstoff durchgeführt.
Abbildung 12: SDS-PAGE der isolierten IBs von His6-JerP und His6-JerL: a) IBs nach Denaturierung; b) Rekonstituierte und renaturierte Proteinlösung von His6-JerP und His6-JerL.
IB-Pellet = nach Denaturierung unlöslicher Proteinanteil, IB-Lysat = nach Denaturierung löslicher Proteinanteil, His6-JerP = 42.0 kDa, His6-JerL = 42.2 kDa.133
Die His6-Fusionsproteine ließen sich selbst mit hohen Harnstoffkonzentrationen nur schwer solubilisieren. Selbst bei Inkubation für 24 h mit 8 M Harnstoff konnte keine vollständige Solubilisierung erreicht werden. Die Bildung des [2Fe-2S]-Cluster wurde durch Zugabe von DTT, Na2S und Fe(NH4)2(SO4)2 erreicht. Hierbei wurden die Konzentrationen an Na2S und Fe(NH4)2(SO4)2 für eine optimale Bildung des [2Fe-2S]-Clusters variiert. Bei zu hohen Konzentrationen war die Bildung von Eisensulfid zu beobachten, wohingegen bei einer zu niedrigen Konzentration die Bildung des [2Fe-2S]-Clusters nur in geringem Maße ablaufen könnte. Der vollständige Einbau des Clusters findet während der Renaturierung statt, wobei DTT die Cysteinylliganden reduziert und eine Koordination der Eisenatome ermöglicht.
Charakteristisch für die [FeS]-Proteinen mit aktivem [FeS]-Cluster und Indiz für die erfolgreiche Rekonstitution war eine tief rot-braune Färbung der Proteinlösung. Die Entfernung des Denaturierungsreagenzes zur Renaturierung der Proteine erfolgte über Dialyse. Die Rückfaltung zur nativen, aktiven Faltung des Proteins kann als Konkurrenzreaktion zwischen der Faltungsreaktion und Aggregatbildung angesehen werden.
Eine niedrige Proteinkonzentration begünstigt die Faltungsreaktion gegenüber der Proteinaggregation, zudem kann die Faltung durch physikochemische Parameter beeinflusst werden. Für die Dialyse wurden daher unterschiedliche Kombinationen von Rekonstitutionspuffern, Dialysepuffern und Proteinkonzentrationen getestet.133
Die optimalen Bedingungen für die Rekonstitution und Renaturierung von His6-JerP mit nur geringer Proteinaggregation sind in Tabelle 11 dargestellt.
Tabelle 11: Optimale Parameter für die Rekonstitution und Renaturierung von His6-JerP.
Protein
Proteinkonz.a
[mg/mL] Na2S [mM]
Fe(NH4)2(SO4)2
[mM]
Rekonstitutions-/
Dialysepufferb
His6-JerP 0.075-0.150 0.38 0.22 50 mM Tris/HCl,
pH 8.5
a Gesamtproteinkonzentration; b Im Rekonstitutionspuffer zusätzlich 2 mM DTT.
Die Rekonstitution und anschließende Renaturierung von His6-JerP wurde ebenfalls mit per Affinitätschromatographie gereinigten Fusionsproteinen untersucht. Selbst bei sehr niedrigen Proteinkonzentrationen (0.025 mg/mL) wurde eine vollständige Proteinaggregation beobachtet. Eine mögliche Ursache ist die vermehrte Ausbildung von Faltungsintermediaten für gereinigte His6-Fusionsproteine, die zu einer verstärkten Proteinaggregation führen. Bei Verwendung eines GST-Tags konnten die entsprechenden Fusionsproteine zwar erfolgreich renaturiert werden, allerdings konnte keine erfolgreiche Rekonstitution durchgeführt werden.
Ebenso war die für die Bildung des aktiven Komplexes der RIESKE-Oxygenasen notwendige Abspaltung des GST-Tags nicht erfolgreich. Das Rekonstitution- und Renaturierungs-protokoll wurde daher nur mit der denaturierten Proteinlösung der His6-Fusionsproteine durchgeführt.
Für die Renaturierung von His6-JerL war unter allen getesteten Bedingungen im Vergleich zu His6-JerP eine starke Proteinaggregation zu beobachten, zudem deutete eine Graufärbung der Proteinlösung auf den fehlerhaften Einbau des [2Fe-2S]-Clusters hin. Die weiteren in vitro Untersuchungen wurden daher nur mit His6-JerP durchgeführt.
Abbildung 13: UV/Vis-Absorptionsspektrum von rekonstituiertem und renaturiertem His6-JerP.
Durchgezogene Linie = His6-JerP (1 mg/mL), gestrichelte Linie = GST-JerO (0.6 mg/mL, Referenzprotein).133
Neben der typischen Färbung ist ein charakteristisches UV/Vis-Absorptionsspektrum mit Absorptionsmaxima bei ~340 nm, ~450 nm und ~570 nm ein Indiz für die erfolgreiche Rekonstitution. Im Absorptionsspektrum ist eine Schulter bei ~320 nm zu erkennen, was auf einen aktiven [2Fe-2S]-Cluster hindeutet. Die Maxima bei ~450 nm und ~570 nm sind nicht zu beobachten, dies kann ebenso wie die niedrige Intensität der Schulter bei ~320 nm daran liegen, dass nur geringe Mengen an aktivem Enzym gewonnen werden konnten.
Die Monooxygenase JerO wurde analog zum Renaturierungsprotokoll für die RIESKE-Enzyme aus IBs isoliert und renaturiert. Für die Präparation der IBs wurde pGEX-6P-I jerO in E. coli Tuner(DE3) exprimiert und die IBs durch mehrere Lyse- und Waschschritte isoliert. Die Denaturierung wurde anschließend durch Zugabe von 8 M Harnstoff mit 2 mM DTT durchgeführt. Für die anschließende Renaturierung über Dialyse wurden ebenfalls unterschiedliche Proteinkonzentrationen und Puffersysteme getestet. Ebenso wurde der Einfluss der prosthetischen Gruppe FAD auf die native Faltung untersucht. Hierbei konnte jedoch kein positiver Einfluss festgestellt werden.133 Bei steigender Proteinkonzentration war eine vermehrte Proteinaggregation zu beobachten, welche jedoch durch eine graduelle Dialyse über zwei Tage gemindert werden konnte. Hierzu wurde die Konzentration an Harnstoff im Dialysepuffer (50 mM Tris/HCl, pH 8.5) beginnend bei 8 M durch Verdünnung auf 1 M über einen Zeitraum 26 h gesenkt und anschließend eine Dialyse in Dialysepuffer ohne Harnstoff für 6 h durchgeführt.
200 250 300 350 400 450 500 550 600
Absorption
Wellenlänge [nm]
Schulter bei ~320 nm
Abbildung 14: a) SDS-PAGE der isolierten IBs von GST-JerO nach Denaturierung und renaturierte Proteinlösung von GST-JerO; b) SDS-PAGE der isolierten IBs von His6-JerO nach Denaturierung und renaturierte Proteinlösung von His6-JerO. GST-JerO = 69.6 kDa, His6-JerO = 43.6 kDa. 133
Die Renaturierung wurde ebenfalls mit His6-Fusionsproteinen untersucht. Diese ließen sich zwar nahezu vollständig während der Denaturierung solubilisieren, allerdings war bei der Renaturierung eine sehr starke Präzipitation der Proteine zu beobachten, weswegen GST-JerO für die in vitro Untersuchungen verwendet wurde. Eine weitere Reinigung der GST-Fusionsproteine über eine Glutathionmatrix war nicht möglich, da keinerlei Bindung an das Säulenmaterial stattfand. Möglicherweise kommt es während der Renaturierung zur Fehlfaltung des GST-Tags, wodurch eine Glutathionbindung nicht mehr möglich ist.
Die optimalen Bedingungen für die Renaturierung von GST-JerO mit nur geringer Proteinaggregation sind in Tabelle 12 dargestellt.
Tabelle 12: Optimale Parameter für die Renaturierung von GST-JerO.
Protein Proteinkonz.a [mg/mL] Dialysepuffer
GST-JerO 0.4-0.8 50 mM Tris/HCl, pH 8.5
a Gesamtproteinkonzentration.