Reaktionen mit DNA-modifizierenden Enzymen

Restriktionsenzyme sind Endonukleasen bakteriellen Ursprungs, die beide DNA-Stränge innerhalb spezifischer, palindromischer Sequenzen von zumeist vier, sechs oder acht Basen Länge spalten. Es entstehen in Abhängigkeit vom jeweiligen Enzym glatte, bündige Enden (blunt-ends) oder bedingt durch die versetzten Schnittstellen komplementäre, einzel-strängige Enden.

2.2.6.3.1.1 Restriktionsspaltung von Plasmid-DNA, Phagen-DNA bzw. PCR-Fragmenten Es wurden 0,2-1,0 µg Plasmid-DNA aus einer analytischen Präparation bzw. Phagen-DNA in einem Ansatzvolumen von 15 µl mit 5-10 Units Restriktionsenzym (Typ II) für 1,5-2 h beim Temperaturoptimum des Enzyms, i. d. R. 37 °C, gespalten. Wurde die Plasmid-DNA nach Zhou et al. (1990) präpariert, waren im Ansatz 2 µg RNase A enthalten. Für präparative Ansätze wurden 10-20 µg Plasmid-DNA, Phagen-DNA bzw. PCR-Fragment (nach Phenol/

Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung) und 30-60 U Restriktionsenzym in einem Gesamtvolumen von 100 µl für 2 h - 2 h 45 min verdaut. Alle Ansätze enthielten 1/10 Volumen des vom Hersteller (NEB) empfohlenen 10x Puffers und falls empfohlen BSA (NEB). Schlossen sich der Restriktionsspaltung weitere Reaktionen mit DNA-modifizierenden Enzymen an, z. B. eine Behandlung mit Klenow-Fragment, wurden die Restriktionsenzyme 20 min bei 65 °C hitzeinaktiviert.

2.2.6.3.1.2 Restriktionsspaltung von genomischer DNA:

Es wurden 3 µg gDNA aus Leishmanien zusammen mit 60-80 U Restriktionsendonuklease, 40 µg RNase A, 4 µg BSA, 1/10 Volumen des empfohlenen 10x Puffers in einem Gesamt-volumen von 400 µl bei 37 °C im Heizblock über Nacht schüttelnd inkubiert. Um

un-spezifische Spaltung zu vermeiden, wurde darauf geachtet, dass Enzyme ohne „Star-Aktivität“ für die Inkubation über Nacht gewählt wurden. Im Anschluss an den Verdau wurde die DNA mit Ethanol gefällt (2.2.5.2) und in 15 µl ddH2O mehrere Stunden bei 4 °C gelöst.

2.2.6.3.2 Auffüllreaktion mit Klenow-Fragment

Mit dem Klenow-Enzym können überhängende, einzelsträngige Enden von gespaltener DNA mit Nukleotiden aufgefüllt und in glatte Enden überführt werden. Nach Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung der DNA wurde diese in 26 µl ddH2O aufgenommen (davon wurden 0,5 µl über ein Agarose-Gel aufgetrennt). Zu 25,5 µl dieser DNA-Lösung wurden 1,5 U Klenow-Fragment, 0,75 µl 20 mM dNTPs und 3 µl 10x Klenow-Puffer gegeben und 20 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 3 µl 500 mM EDTA pH 8,0 oder 20 min Hitzeinaktivierung bei 75 °C gestoppt.

2.2.6.3.3 Dephosphorylierung am 5´Ende von DNA-Fragmenten

Vektorfragmente mit kompatiblen Enden wurden mit Shrimp Alkaliner Phosphatase (SAP) behandelt, um zu verhindern, dass der Vektor mit sich selbst ligiert. Nach Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung der DNA wurde diese in 26 µl ddH2O aufgenommen (davon wurden 0,5 µl über ein Agarose-Gel aufgetrennt). Zu 25,5 µl dieser DNA-Lösung wurden 1,5 U SAP und 3 µl 10x SAP-Puffer gegeben und für 2 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde das Enzym bei 65 °C für 15 min hitzeinaktiviert.

2.2.6.3.4 Ligation von DNA-Fragmenten

Es wurden 50-200 ng linearisierte Vektor-DNA und das Dreifache an einzubringendem Frag-ment in einem Gesamtansatz von 10 µl zusammen mit 0,7 U T4 DNA-Ligase und 1 µl 10x Ligasepuffer eingesetzt. Zuvor wurden von Vektor und Fragment je 1 µl auf ein Agarose-Gel geladen, um die Menge von beiden für die Ligation abschätzen zu können. Die Ligation erfolgte bei 13 °C im Wasserbad über Nacht.

2.2.6.4 Konventionelle Agarose-Gelektrophorese

Alle Agarose-Gele wurden mit 0,5x TBE-Puffer angefertigt und enthielten 0,3 µg/ml Ethidium-bromid. Für die Auftrennung von Plasmid-DNA enthielt das Gel 0,8-0,9 % (w/v) Agarose. Die Proben wurden mit 1/10 Volumenanteil 10x Auftragspuffer versehenen und in die Taschen geladen. In eine Tasche wurde ein DNA-Marker als Längenstandard pipettiert. Der Gellauf erfolgte bei 1,4-10 V/cm in 0,5x TBE-Puffer. Die Fluoreszenz des in die DNA interkalierten Ethidiumbromids wurde auf dem UV-Schirm photographisch dokumentiert.

2.2.6.5 DNA-Extraktion aus Agarose-Gelen mit dem Kit von Qiagen und Macherey & Nagel Ein präparativer Ansatz eines Restriktionsenzymverdaus wurde über Agarose-Gelelektro-phorese aufgetrennt. Die Bande von Interesse wurde unter einem UV-Licht mit niedriger Intensität (λ=365 nm) identifiziert und mit einem Skalpell ausgeschnitten. Die DNA wurde aus dem Gelstück nach Herstellerangaben präpariert und mit 20-50 µl ddH2O eluiert.

2.2.6.6 Annealing von phosphorylierten Oligonukleotiden zum Einbringen von DNA-Sequenzen

Je 5 µl der Lösung der phosphorylierten Oligonukleotide (100 pmol/µl) und 40 µl ddH2O wurden in ein PCR-Reaktionsgefäß überführt. Das Annealing der weitgehend komplemen-tären Primer erfolgte in der PCR-Maschine durch die Temperaturabfolge: 10 min bei 95° C (Strangtrennung), 10 min bei 65° C, 30 min bei 37° C und 30 min bei Raumtemperatur (graduelle Doppelstrangbildung). Der einzelsträngige 3´- bzw. 5´-Überhang des aneinander-gelagerten Oligonukleotidpaares war zu den Überhängen des mit Restriktionsenzymen gespaltenen Vektors komplementär. 2 µl der annealten Primer wurden mit 50-100 ng linearisiertem Plasmid wie unter 2.2.6.3.4 beschrieben ligiert.

2.2.6.7 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Für die PCR-Reaktion wurden Taq-DNA-Polymerase von Promega (5 U/µl) oder das Expand High Fidelity PCR System von Roche benutzt. Letzteres enthält eine Mischung der thermo-stabilen Taq- und Tgo-DNA-Polymerase (3,5 U/µl). Die Tgo-Polymerase senkt durch ihre 3´-5´-Exonuklease-Aktivität die Fehlerrate der Taq-Polymerase beim Nukleotideinbau. Die PCR wurde in 200 µl Reaktionsgefäßen im Thermocycler durchgeführt.

Reaktionsansatz:

Plasmid- oder genomische DNA (Template) 10-200 ng

Oligonukleotid A (10 µM) 30 pmol

Oligonukleotid B (10 µM) 30 pmol

dNTPs (20 mM) 1 µl

DNA-Polymerase 0,75 µl

Polymerase-Puffer mit 15 mM MgCl2 (10x) 5 µl

HPLC-H2O ad 50 µl

Programm:

Denaturierung 94 °C 5 min

Denaturierung 94 °C 30 s

25-35 Zyklen

Annealing 41-62 °C 30 s

Elongation der DNA 72 °C (68 °C) 30 s – 3 min Finale Elongation der DNA 72 °C (68 °C) 7 min

Reaktionsende und Kühlung 4 °C ∞

Die Annealing-Temperatur orientierte sich an der Schmelztemperatur der benutzten Primer.

Die Elongationszeit hing von der Länge des Amplifikats ab (0,75 kb → 45 s; 1,5 kb → 1 min;

3 kb → 2 min). Es wurde mit einer Elongations-Temperatur von 72 °C gearbeitet, außer für den Taq-/Tgo-Polymerase-Mix bei längeren PCR-Produkten (> 3 kb), hier betrug sie 68 °C.

Zur Analyse wurden 2-3 µl des PCR-Ansatzes über ein Agarose-Gel aufgetrennt.

2.2.6.7.1 Klonierung eines PCR-Produkts mit dem TOPO TA Cloning Kit von Invitrogen Mit Taq-Polymerase amplifizierte PCR-Produkte besitzen ein einzelnes Desoxyadenosin an ihrem 3´-Ende. Damit können sie in den linearisierten pCR2.1-TOPO-Vektor, der als 3´-Überhang ein einzelnes Desoxythymidin und eine kovalent gebundene Topoisomerase I besitzt, eingebracht werden. Dazu wurden 1-4 µl frisches PCR-Produkt mit 1 µl Salzlösung, 1 µl Vektor und H2O in einem Gesamtvolumen von 6 µl für 5 min bei RT inkubiert. Danach wurden 3 µl des Ansatzes nach Herstellerangaben in E. coli TOP10F’ Zellen transformiert.

2.2.6.7.2 PCR auf kruden Leishmanienlysaten

Ein primäres Screening auf das Vorhandensein eines Gens wurde mittels PCR durchgeführt, wenn die aus Leishmanien-Transfektionen hervorgegangene Anzahl an Einzelallelmutanten den Umfang einer Southern Blot-Analyse überstieg. Die genetische Situation von finalen Doppelallelmutanten wurde aber immer mittels Southern Blot analysiert.

Zur Herstellung der Lysate wurden 20 µl Promastigoten einer logarithmisch wachsenden Kultur zusammen mit 80 µl HPLC-H2O in ein PCR-Reaktionsgefäß überführt und für zehn Minuten bei 95° C im Thermocycler aufgekocht. Je 1 µl dieses Leishmanienlysats wurde in einen 50 µl PCR-Ansatz zusammen mit 1 µl 25 mM MgCl2, je 100 pmol der beiden Primer, 2 µl 20 mM dNTPs, 0,7 µl Expand High Fidelity Polymerase-Mix, 5 µl Polymerase Puffer und HPLC-H2O eingesetzt.

2.2.6.7.3 Aufreinigung von PCR-Produkten mit dem M&N NucleoSpin Extrakt II Kit

Waren sich zwei resultierende Produkte eines PCR-Ansatzes in ihrer Größe sehr ähnlich, wurden sie über eine Säule nach Herstellerangaben aufgereinigt, mit 10 µl ddH2O eluiert und zur Unterscheidung mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten.

2.2.6.7.4 Einzelzell-PCR

Wie unter 2.2.1.13 beschrieben, wurden pro well 10 SYTO 16-gefärbte Läsionsamastigoten mit dem Durchflusszytometer in eine 96-well-PCR-Platte sortiert. Für die nachfolgende PCR wurde das AccuPrime Taq DNA Polymerase System von Invitrogen benutzt. In jede

Ver-tiefung wurden 25 µl Mastermix pipettiert. Pro Ansatz bestand dieser aus je 100 pmol der beiden Primer, 0,5 µl Polymerase, 2,5 µl Polymerase-Puffer und HPLC-H2O. 24 µl des Mastermix zusammen mit 1 µl HPLC-H2O bzw. 1 µl gDNA von L. mexicana dienten als Negativ- bzw. Positivkontrolle. Nach Zugabe des Mastermix wurden die Platte mit Klebefolie (Sarstedt) verschlossen. Nach Abschluss der PCR wurde jeder Ansatz mit Auftragspuffer versehen und die Hälfte auf ein 1,5%iges Agarose-Gel geladen.

2.2.6.7.5 Digoxigenin-Markierung zur Herstellung einer DNA-Gen-Sonde

Dazu wurde der PCR DIG Probe Synthesis Kit von Roche benutzt. Zuerst wurde durch Restriktionsspaltung von Plasmid-DNA und nachfolgender Gelextraktion oder durch PCR auf gDNA ein < 600 bp großes Fragment generiert, das den Abschnitt des Zielgens trug an den die Sonde binden sollte. Von diesem Fragment wurde eine geringe Menge als Vorlage in die PCR zur Herstellung der DIG-markierten DNA durch Einbau von Digoxigenin-markierten dUTPs eingesetzt. Die Durchführung der DIG-PCR erfolgte nach Herstellerangaben. Die DIG-markierte Sonde wurde 10 min bei 95 °C denaturiert und in Hybridisierungslösung über-führt. Die Sonde in Hybridisierungslösung wurde mehrfach benutzt (Lagerung: -20 °C). Sie wurde vor jedem Gebrauch 10 min im Wasserbad bei 95 °C erhitzt und dann abgekühlt.

2.2.6.8 Southern Blot

2.2.6.8.1 DNA-Autrennung und -Transfer auf die Membran

Die nach Restriktionsspaltung entstandenen Fragmente der gDNA (2.2.6.3.1.2) wurden nach ihrem Molekulargewicht in einem 0,7%iges Agarose-Gel mit 4,5 V/cm über 3-4 h elektro-phoretisch getrennt. Die aufgetrennte DNA und Markerbanden wurden durch Fotografieren des Gels mit seitlich angelegtem Lineal unter UV-Licht dokumentiert. Das Agarose-Gel wurde 20 min in Denaturierungslösung und anschließend 30 min in Neutralisierungslösung auf einem Kippschüttler geschwenkt. Der nachfolgende Aufbau des Southern Blots ist in Abb. 11 schematisch dargestellt. Es wurde mit Hochsalzpuffer bei 4 °C über Nacht geblottet.

Durch Kapillarwirkung wird 20x SSC-Puffer durch alle Schichten bis in das Papier gesaugt, dabei gelangt die DNA aus dem Gel auf die Biodyne A-Membran. Am nächsten Tag wurde der Blot abgebaut. Die Position der Geltaschen wurden auf der Blotmembran angezeichnet und die DNA durch Quervernetzung auf dieser fixiert (Autocrosslinking-Funktion im UV-Stratalinker).

Glas-Petrischale

Glasplatte

Glasplatte

Wanne mit 20x SSC

4 Lagen Whatman-Papier Parafilmumrandung d. Gels Umgedrehtes Agarose-Gel

Biodyne A Membran

3 Lagen Whatman-Papier Saugpapier

Gewicht

Abb. 11: Schematische Darstellung des Aufbaus eines Southern Blots 2.2.6.8.2 Hybridisierung mit der spezifischen DIG-markierten DNA-Sonde

Zunächst wurde die Membran zusammen mit 50 ml Prähybridisierungslösung eingeschweißt, für 3-4 h bei 42 °C im Wasserbad geschwenkt und dadurch unspezifische Bindungsstellen mit der enthaltenen Fish sperm-DNA abgesättigt. Danach wurde der Blot mit der DIG-markierten DNA-Sonde (2.2.6.7.5) in Hybridisierungslösung eingeschweißt und über Nacht bei 42 °C im Wasserbad bewegt. Im Anschluss wurde die Membran in einer Plastikschale mit jeweils 200 ml Waschpuffer 1 (2 x 7 min bei RT) und Waschpuffer 2 (2 x 10 min bei 68 °C) gewaschen.

2.2.6.8.3 Nachweis der Digoxigenin-Markierung

Der Nachweis erfolgte mit dem AP-gekoppelten anti-Digoxigenin Antiköper. Es wurden für drei Waschvorgänge insgesamt 500 ml DIG-Puffer 1 vorbereitet. Zuerst wurde die Membran bei RT für 5 min in Puffer 1 gewaschen. Dann wurde sie zusammen mit 50 ml DIG-Puffer 2 eingeschweißt und für 2 h bei 37 °C unter Schütteln unspezifische Bindungsstellen blockiert. Danach wurde der Blot in 40 ml DIG-Puffer 2 zusammen mit dem Antikörper eingeschweißt und für 45 min bei 37 °C geschwenkt. Der Blot wurde 2 x 15 min in DIG-Puffer 1 gewaschen und 5 min in DIG-DIG-Puffer 3 äquilibriert. Jede Seite des Blots wurde für 2 min 30 s in 5 ml DIG-Puffer 3 mit 1 : 100 CSPD gelegt. Am Schluss wurde der feuchte Blot in eine Plastikfolie gepackt und in einer vorgewärmten Filmkassette der Röntgenfilm für 30 min-3 h bei 37 °C aufgelegt. Das Substrat CSPD wird von der Alkalischen Phosphatase (AP) unter Lichtemission dephosphoryliert und erzeugt so ein Signal auf dem Film.

2.2.6.8.4 Entfernen der gebundenen Sonde – Stripping des Blots

Die Membran wurde unter ständigem Schwenken zuerst 10 min bei RT in ddH2O, dann 2 x 15 min in Southern Blot Stripping-Lösung bei 37 °C und 5 min in 2x SSC bei 37 °C