Proteingewinnung

2.2.9.6 Bestimmung von Phosphorylierungsstellen durch MALDI-TOF-MS und MS/MS

Die Proteinbande von Interesse wurde aus einem Coomassie-gefärbten SDS-PA-Gel mit einem sauberen Skalpell ausgeschnitten und in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt. Die Proben wurden für die Durchführung der MALDI-TOF-MS- und MS/MS-Analysen an Frau Heidi Rosenqvist geschickt (Protein Research Group der Süddänischen Universität in Odense, Dänemark). Die folgenden Arbeitsschritte wurden von ihr durchgeführt: Die Proben wurden einem in-Gel-Trypsin-Verdau unterzogen und nachfolgend die Phosphopeptide mittels TiO2-Chromatographie angereichert. Die massenspektrometrische Untersuchung der Peptide erfolgte am Bruker Ultraflex TOF-TOF-Gerät. Die Peptidsequenzen der Peaks von Interesse wurden nachfolgend mittels MS/MS-Analyse verifiziert. Die Datenanalyse wurde mit Hilfe der Programme FlexAnalysis, Version 2.4 und Biotools Version 3.0 durchgeführt.

Zur Datenbanksuche wurde die Mascot Suchmaschine genutzt (www.matrixscience.com).

Größere Peptide (m/z > 3000) treten schlechter vom Gel in den Verdau-Überstand über.

Daher wurde neben dem Verdau-Überstand auch ein Gemisch aus diesem und einem Peptidextrakt, hergestellt aus der jeweiligen im Gel verbliebenen Probe, in die Analyse einbezogen.

sedimen-tiert. Der Überstand wurde nach jedem Zentrifugationsschritt vorsichtig in ein neues Reak-tionsgefäß überführt. Im Anschluss wurde das im Cytoplasmaextrakt enthaltene zelluläre ATP mit Hilfe einer HiTrap-Desalting Sephadex G-25 Säule entfernt. Dazu wurde die Säule zuerst mit 25 ml Äquilibrierungspuffer gespült, dann wurde sie mit 1-1,5 ml Lysat beladen und schließlich mit 1,5 ml Äquilibrierungspuffer eluiert. Zuletzt wurde das Säulenmaterial mit 25 ml 20 % Ethanol gespült und ebenfalls darin gelagert. Die Proteinkonzentration des Eluats wurde bestimmt, dieses aliquotiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70 °C gelagert.

2.2.10.2 Expression und Synthese von rekombinantem Protein in E. coli, Ernte, Aufschluss und Affinitätsaufreinigung

Mit frisch transformierten Zellen von Festmediumplatte wurde eine Übernachtkultur ange-impft (siehe 2.2.2.2 und 2.2.3.2). Für die Herstellung von rekombinantem Protein wurden 100-400 ml LB-Medium, versetzt mit dem jeweiligen Antibiotikum, mit 1 ml der Übernacht-kultur auf 100 ml Kultur angeimpft und bei 37 °C unter Schütteln (250 rpm) kultiviert bis eine OD600 ≈ 0,9 erreicht war. Die Bakterienkultur wurde auf 18 °C abgekühlt und durch Zugabe von IPTG die Proteinexpression bei 18 °C über Nacht unter Schütteln gestartet. Nach 15 min Zentrifugieren bei 2050 x g und 4 °C wurde das Zellpellet einmal in 1x PBS (kalt) resuspen-diert, erneut durch Zentrifugieren sedimentiert, in flüssigem Stickstoff gefroren und nach Auf-tauen auf Eis weiter lysiert. Dazu wurde der Zellniederschlag in 5 ml Puffer für die Lyse pro 100 ml Ausgangskultur aufgenommen. Der nachfolgende Aufschluss durch Ultraschall (Branson Sonifier) erfolgte ebenfalls auf Eis. Nach jedem Schallschritt von 20 s Dauer wurde 20 s pausiert. 5 ml Zellsuspension wurden in ein 15 ml-Röhrchen überführt und mit der Ø 6 mm-Metallspitze mit zunehmender Intensität 2 x bei jeweils Stufe 2, 3 und 4 geschallt.

Zellsuspensionen mit größerem Volumen (15-20 ml) wurden in ein gekürztes 50 ml-Röhr-chen überführt und mit dem Metallknopf 2 x bei Stufe 2 und jeweils 3 x bei Stufe 3 und 4 sonifiziert. Dann wurde Triton X-100 in einer Endkonzentration von 1 % zugesetzt und das Röhrchen 30-60 min bei 4 °C rotiert. Das Lysat wurde in 2 ml-Reaktionsgefäße überführt und 15 min bei 15800 x g und 4 °C zentrifugiert. Das rekombinante Protein wurde aus dem Überstand laut 2.2.10.2.2-4 aufgereinigt. Alle Arbeitsschritte erfolgten auf Eis mit gekühlten Lösungen. Das rekombinante Protein wurde schnellstmöglich verwendet und bis dahin bei 4 °C gelagert.

E. coli-Stamm Plasmid Protein-Tag Kultur- antibiotikum

Induktion der Proteinexpression

Puffer für die Lyse

BL21(DE3) [pAPlacI^Q]

pJCduet His Ampicillin/

Kanamycin

100 µM IPTG bei OD600 ≈ 0,9

1x PBS BL21(DE3) pMal-cRI MalBP Ampicillin 50(100) µM IPTG

bei OD600 ≈ 0,9

MalBP-Säulenpuffer BL21(DE3) pGEX-KG GST Ampicillin 100 µM IPTG

bei OD600 ≈ 0,9

1x PBS

2.2.10.2.1 Herstellung von Proben für SDS-PAGE von Gesamtzelllysat, Überstand und Pellet des Aufschlusses

Anhand der Verteilung des rekombinanten Proteins in Gesamtzelllysat, Überstand und Pellet konnte eine Aussage über die Proteinlöslichkeit und die synthetisierte Proteinmenge ge-troffen werden. Zur Herstellung des Gesamtzelllysats wurden aus dem Lysat nach Inkubation mit Triton X-100 50 µl entnommen. Nach dem folgenden Zentrifugationsschritt des Auf-schluss wurde eine Probe von 50 µl des Überstands gewonnen und nach Resuspension des Pellets im gleichen Volumen an ddH2O wie es der abgenommene Überstand besaß, wurden 50 µl der Suspension entnommen. Alle drei Proben wurden 1 : 5 mit ddH2O und Auftrags-puffer (1x) verdünnt, 10 min bei 95 °C gekocht und jeweils 20 µl auf ein SDS-PA-Gel geladen.

2.2.10.2.2 Aufreinigung von His-Tag-Fusionsproteinen

Je nach Volumen der Ausgangskultur wurden 100-250 µl Säulenvolumen Chelating Sepharose Fast Flow mit Cobalt beladen. Dazu wurde die Säulenmischung für 3 min bei 500 x g und 4 °C zentrifugiert und die Lagerlösung (20 % Ethanol) abgenommen. Dann wurde das Säulenmaterial nacheinander für jeweils 5 min zusammen mit 500 µl dH2O (auf 100 µl Bettvolumen), 100 µl 0,1 M CoCl2, dreimal mit 500 µl dH2O und schließlich 500 µl His-Aufreinigung Bindepuffer invertiert. Nach jedem Waschschritt wurde zentrifugiert wie oben beschrieben und die Flüssigkeit über dem Säulensediment mit der 23 G Kanüle einer Spritze vorsichtig abgenommen. Der Überstand aus 2.2.10.2 wurde mit dem gleichen Volumen an His-Aufreinigung Bindepuffer verdünnt und zusammen mit dem vorbereiteten Säulenmaterial für 1 h bei 4 °C rotiert. Nach Bindung des His-Fusionsproteins an die Säule wurden nicht ge-bundenes Protein und Verunreinigungen durch konsekutives Waschen des Säulenmaterials entfernt. Hierfür wurde jeweils 10 min bei 4 °C mit 2 x 6 ml Waschpuffer, 6 ml Bindepuffer und 6 ml Waschpuffer der Aufreinigung gewaschen. Abschließend wurde das His-Fusionsprotein zweimal eluiert. Hierzu wurde das Säulenmaterial mit je 500 µl Elutionspuffer für 10 min bei 4 °C rotiert und nach 3 min Zenrifugieren bei 500 x g und 4 °C das Eluat über dem Säulensediment abgenommen.

2.2.10.2.3 Aufreinigung von MalBP-Tag-Fusionsproteinen

Es wurden 500 bzw. 1000 µl Amylose-Resin zweimal mit MalBP-Aufreinigung Säulenpuffer gewaschen. Zum Austausch der Lösung wurde für 3 min bei 500 x g und 4 °C zentrifugiert und die Flüssigkeit über dem Säulensediment mit der 23 G Kanüle einer Spritze behutsam abgenommen. Für die Bindung des MalBP-Fusionsproteins an die Amylose-Säule wurde der aus dem Zellaufschluss stammende Überstand (2.2.10.2) für 1 h bei 4 °C mit dieser rotiert.

Im Anschluss wurde das Säulenmaterial viermal für 10 min mit je 12 ml Säulenpuffer bei 4 °C gewaschen und zuletzt zweimal für 45 min mit je 500 µl MalBP-Aufreinigung Elutionspuffer bei 4 °C eluiert. Das Säulenmaterial wurde mehrfach verwendet und daher im Anschluss an die Aufreinigung wie folgt aufbereitet: 1 ml Säulenvolumen wurden in jedem Waschschritt mit je 1 ml Lösung gewaschen, zuerst dreimal mit ddH2O, dann dreimal mit 0,1 % SDS-Lösung, einmal mit ddH2O und fünfmal mit Säulenpuffer. Anschließend wurde die Amylose-Säule in Säulenpuffer bei 4 °C gelagert.

2.2.10.2.4 Aufreinigung von GST-Tag-Fusionsproteinen

200 µl Säulenbett Glutathione-Uniflow Resin für 100-200 ml Ausgangskultur wurden zweimal mit 1x PBS gewaschen. Zum Austausch der Flüssigkeit wurde das Säulenmaterial für 3 min bei 500 x g und 4 °C zentrifugiert und der Überstand über dem Säulensediment über die 23 G Kanüle einer Spritze abgenommen. Der Lysat-Überstand (2.2.10.2) wurde 1 h bei 4 °C zusammen mit dem Säulenmaterial rotiert. Nach Bindung des GST-Fusionsproteins wurde die Glutathion-Säule viermal mit je 8 ml 1x PBS gewaschen und zweimal für 10 min mit je einem Bettvolumen GST-Aufreinigung Elutionspuffer bei 4 °C eluiert.

2.2.10.2.5 Thrombin-Spaltung zur Entfernung des GST-Tags

Der GST-Tag wurde von einigen GST-Fusionsproteinen durch Inkubation von 250 µg Protein mit 1,2 U Thrombin in einem Gesamtansatz von 125 µl über Nacht bei 20 °C abgespalten.