3. Ergebnisse
3.2 Charakterisierung der Glykogensynthase-Kinase 3 (GSK3) aus
3.2.9 Deletion von LmxGSK3β in Leishmania mexicana
wurde das hypothetische Substrat in E. coli exprimiert und verschiedenen L. mexicana Kinasen im Aktivitätstest als Substrat angeboten.
Proteinexpression des hypothetischen Substrats und Einsatz im Kinase-Aktivitätstest
Das sogenannte hypothetische Substrat wurde als His-Fusionsprotein rekombinant exprimiert und aufgereinigt und in Kombination mit den rekombinant exprimierten Kinasen LmxGSK3β, dem MAP-Kinase Homolog LmxMPK3 und den MAP-Kinase Kinase Homologen LmxMKK und LmxMKK4 im Kinase-Aktivitätstest eingesetzt. Das ~20 kDa große potentielle Substratprotein weist für sich alleine mit [γ32P]-ATP inkubiert keinen Phosphateinbau auf (Abb. 63, Spur 3). Die Kinase LmxMPK3 und die konstitutiv aktive Mutante von LmxMKK (LmxMKK-D) führen zu keiner Phosphorylierung des hypothetischen Substrats. Ebenso verhält es sich für LmxGSK3β, wie es in Ermangelung des genannten Konsensusmotivs zu erwarten war. LmxMKK4 führt allerdings zu einem Einbau von Phosphat in das getestete 20 kDa-Protein. Weitere Anstrengungen zur Aufklärung, ob es sich bei dieser Phospho-rylierung durch LmxMKK4 um eine in vivo verifizierbare Interaktion handelt, wurden nicht unternommen.
Abb. 63: Kinase-Aktivitätstest mit hypothetischem Substrat von LmxGSK3β. 1: His-LmxGSK3β-Wt; 2: His-LmxGSK3β-KM; 3: hypothetisches Substrat mit His-Tag. Die Spuren 4-8 zeigen das hypo-thetische Substrat zusammen mit 4: His-LmxGSK3β-Wt; 5: His-GSK3β-KM; 6: GST-LmxMKK-D; 7:
GST-LmxMPK3-Wt; 8: GST-LmxMKK4. Links: Coomassie-gefärbtes 12 %-iges SDS-PA-Gel. Rechts:
Autoradiogramm nach 20 h Exposition. Die Reaktion erfolgte für 1 h bei 30° C und den Puffer-bedingungen pH 7,2, 5 mM Mg2+. Pfeilspitzen markieren die jeweiligen Kinasen.
Bei dem Protein LmxM.36.0430 handelt es sich um kein Substrat von LmxGSK3β in vitro.
anschließend durch Zugabe der jeweiligen Antibiotika zum Kulturmedium selektiert werden.
Genutzt wurde das Resistenzgen codierend für die Neomycin Phosphotransferase (Neo), für die Hygromycin B Phosphotransferase (Hyg) sowie das des Phleomycin-bindenden Proteins (Phleo). Der L. mexicana Wildtyp reagiert auf das Antibiotikum Neomycin, Hygromycin und Phleomycin sensibel.
3.2.9.1 Herstellung der Deletionskonstrukte
Es wurden drei DNA-Konstrukte generiert. Jedes enthielt die flankierenden Regionen von LmxGSK3β und anstelle des LmxGSK3β-Gens eines der drei Antibiotikaresistenzgene. In zwei unabhängigen PCR-Ansätzen wurde ein 557 bp langer Bereich stromauf (us) und ein 546 bp langer Abschnitt stromab (ds) des offenen Leserasters von LmxGSK3β amplifiziert.
Zu diesem Zweck wurden zwei Oligonukleotidpaare bestehend aus je einem Außen- und je einem Innenprimer generiert. Das Primerpaar GSK3bdel_usEcoRVfor / GSK3bdel_usBspLU11I_AvrII_NheIrev bzw. GSK3bdel_dsEcoRVrev / GSK3bdel_dsBspLU11I_AvrII_NheIfor kam in je einem PCR-Ansatz zum Einsatz. Als Matrix diente das Plasmid pBSKGSK3β1.2XI, welches das LmxGSK3β tragende Phageninsert enthält. Mittels der Außenprimer wurde je eine EcoRV Schnittstelle am 5´-Ende der stromauf bzw. am 3´-Ende der stromab-Region eingefügt. Die gegenläufigen Innenprimer binden am 3´-Ende der stromauf bzw. 5´-Ende der stromab-Region und besitzen einen 24 bp langen komplementären Bereich. Durch diesen überlappenden Sequenzabschnitt wurden eine zusätzliche NheI-, eine AvrII- und eine BspLU11I-Schnittstelle zwischen den flankierenden Regionen geschaffen. In einer zweiten PCR-Runde wurden die beiden Produkte aus der ersten Runde als Vorlage zusammen mit den beiden äußeren Primern eingesetzt. Das resultierende Produkt wurde mittels TOPO-Klonierung in das pCR2.1-Plasmid kloniert und das entstandene Plasmid pCR2.1usds(GSK3b) durch Restriktionsenzymspaltung und Sequenzierung überprüft. Durch Spaltung mit EcoRV wurde das stromauf-stromab-Segment aus dem Plasmid pCR2.1usds(GSK3b) geschnitten und in das Plasmid pBSK-BspLU11I über EcoRV eingebracht. Bei dem Plasmid pBSK-BspLU11I handelt es sich um das pBSKII(+)-Plasmid, dem als Modifikation die BspLU11I-Schnittstelle fehlt. Das Produkt pBusds(GSK3b) wurde mit den Restriktionsendonukleasen BspLU11I und NheI aufge-schnitten und mit einem, das jeweilige Resistenzgen tragendem Fragment ligiert. Das phleo-Fragment wurde mittels NcoI/AvrII-Spaltung aus dem Plasmid pCR2.1phleo geschnitten, das neo-Fragment bzw. hyg-Fragment wurde mittels BspHI/NheI-Spaltung und anschließender Aufreinigung aus den Plasmiden pCR2.1neo bzw. pCR2.1hyg gewonnen. Die entstandenen Deletionskonstrukte pBusds(GSK3b)phleo, pBusds(GSK3b)neo und pBusds(GSK3b)hyg wurden durch Restriktionsenzymspaltung überprüft.
3.2.9.2 Transfektion in L. mexicana und Überprüfung durch PCR bzw. Southern Blot-Analyse
Die Deletionskonstrukte wurden mit EcoRV geschnitten und über Gelextraktion jeweils das Fragment isoliert, welches Resistenzgen mit flankierenden Regionen trägt. Die linearen Fragmente us(GSK3β)ds-hyg, us(GSK3β)ds-phleo und us(GSK3β)ds-neo wurden jeweils in den Wildtyp transfiziert. Etwa nach zwei Wochen Kultur unter Selektionsdruck waren für alle drei Resistenzen Mutanten gewachsen. Durch eine PCR mit Oligonukleotiden (GSK3b_7for und GSK3b_6rev), die in der stromauf- bzw. stromab-Region von LmxGSK3β binden, wurde der erfolgreiche Austausch eines Allels von LmxGSK3β gegen das Resistenzgen nachge-wiesen. Die PCR erfolgte direkt auf Leishmanienlysaten (Programm: 5 min 94 °C, 30 x [30 s 94 °C, 30 s 41 °C, 3 min 72 °C], 7 min 72 °C, 4 °C).
Je Resistenz wurden zwei getestete, einfachresistente Klone in eine zweite Transfektions-runde eingesetzt. Durch homologe Rekombination und anschließende Selektion sollte das zweite Allel von LmxGSK3β gegen eines der beiden noch nicht vorhandenen Resistenzgene ausgetauscht werden. Aus dieser zweiten Transfektionsrunde gingen 77 zweifachresistente Klone in insgesamt 1152 plattierten Vertiefungen hervor (Siehe Tabelle 4). Von diesen wurden 17 Klone mit drei unterschiedlichen Resistenzgenkombinationen auf ihre genetische Konstellation betreffs LmxGSK3β im Southern Blot analysiert (Abb. 64).
Ausgangsklone und DNA-Konstrukte Anzahl der resultierenden Elektro-porationsklone (auf je 2 x 96 wells)
∆LmxGSK3β+/-hyg + us(GSK3β)ds-phleo 28
∆LmxGSK3β+/-hyg + us(GSK3β)ds-neo 1
∆LmxGSK3β+/-phleo + us(GSK3β)ds-hyg 8
∆LmxGSK3β+/-phleo + us(GSK3β)ds-neo 3
∆LmxGSK3β+/-neo + us(GSK3β)ds-hyg 24
∆LmxGSK3β+/-neo + us(GSK3β)ds-phleo 13
Tab. 4: Ergebnis der Herstellung von LmxGSK3β-Doppeldeletionsklonen
Hierzu wurde genomische DNA aus Wiltdyp-Leishmanien und den einzelnen Mutanten präpariert und jeweils mit der Restriktionsendonuklease HincII über Nacht gespalten. HincII schneidet stromauf und stromab von LmxGSK3β. Zusätzlich finden sich zwei Schnittstellen im LmxGSK3β-Gen, eine im Hyg- bzw. Phleo-Gen und keine im Neo-Gen. Die Lokalisation der Schnittstellen ist in Abb. 64, A schematisch dargestellt. Der Nachweis der unterschiedlich großen HincII-Fragmente erfolgte unter Zuhilfenahme einer DIG-markierten Sonde. Diese Sonde hybridisiert in der stromauf-Region von LmxGSK3β (us-Sonde) (Schema Abb. 64, A).
In einer ersten PCR auf dem Plasmid pBusds(GSK3b) wurde mit den Oligonukleotiden GSK3b_7for und GSK3b_12rev ein 268 bp großes Amplifikat erzeugt. Unter Verwendung dieses PCR-Produkts als Vorlage, der gleichen Primer und des DIG-Kits der Fa. Roche wurde dann in einer zweiten PCR die Digoxigenin markierte DNA-Sonde hergestellt.
FspI,304 BssHII,354
AatII,689 PshAI,689
ApoI,909 EcoRI,909
DraIII,949 NcoI,1018 StyI,1018 SgfI,1026 PvuI,1027 RsrII,1073
NdeI,1115 DraIII,1242
SacII,1443 NciI,1451
HincII,1500 NciI,1567 ScaI,1634
NheI,1692 MluI,1766
AccI,1886 FspI,2119
BamHI,2176 XhoII,2176
PmaCI,2194 PvuI,2237
BspLU11,2348
us-Sonde
HYG
FspI,304 BssHII,354
BalI,667 HincII,674
BssHII,702 AatII,708
SmaI,754 XmaI,754 SgrAI,779
SexAI,829 FseI,937
BglI,965 DsaI,966
DraIII,1014 MluI,1115
AccI,1235 FspI,1468
BamHI,1525 XhoII,1525
PmaCI,1543 PvuI,1586
BspLU11,1697
us-Sonde
PHLEO
FspI,304 BssHII,354
Ecl136,668
SacI,668 802
824 BbeI EheI
HaeII KasI
NarI DrdI
BalI,883 FspI,903
TthI,918 XhoII,974
BsrDI,1029 BssHII,1200 SphI,1204
XhoII,1220 DsaI,1235 NcoI,1235 StyI,1235
NaeI,1303 RsrII,1318
NheI,1470 MluI,1544
AccI,1664 FspI,1897
BamHI,1954 XhoII,1954
PmaCI,1972 PvuI,2015
BspLU11,2126
us-Sonde
NEO
FspI,304 BssHII,354
BspLU11,664 AgeI,718
EcoO109,862 GsuI,900
1022
1039 NarI
EheI KasI BbeI
BsaBI EcoNI
BclI
DraIII,1128 HincII,1140 SacI,1251 Ecl136,1251 BstEII,1263 SalI,1287 HincII,1287 AccI,1287
SacII,1346 NaeI,1362 XhoII,1448 BsrGI,1453
BglI,1512 StyI,1513 SplI,1522 ScaI,1549
Eco47-3,1583 NciI,1652
MluI,1802 AccI,1922
FspI,2155 BamHI,2212 XhoII,2212
PmaCI,2230 PvuI,2273
BspLU11,2384
us-Sonde
LmxGSK3beta
Gen-Sonde
A.
B.
Abb. 64: Untersuchung potentieller Deletionsmutanten von LmxGSK3β mittels Southern Blot-Analyse. A: Schematische Darstellung des im Genom von L. mexicana integrierten Gens von Hyg, Neo, Phleo und LmxGSK3β mit Restriktionsenzymschnittstellen; der Bindungsregion der LmxGSK3β-us-Sonde (grauer Pfeil) und der HincII-Fragmente (schwarze Balken). B: Southern Blot nach Gel-auftrennung HincII-gespaltener gDNA potentieller Deletionsklone. Die Detektion erfolgte mit der LmxGSK3β-us-Sonde. Spur 1 und 19: L. mexicana Wildtyp; Spur 2 und 3: potentielle ∆LmxGSK3β(-/-) phleo/neo-Klone; Spur 4-6: potentielle ∆LmxGSK3β(-/-)neo/hyg-Klone; Spur 7-10: potentielle
∆LmxGSK3β(-/-)neo/phleo-Klone; Spur 11-13: potentielle ∆LmxGSK3β(-/-)phleo/hyg-Klone; Spur 14-17: potentielle ∆LmxGSK3β(-/-)hyg/phleo-Klone; Spur 18: potentieller ∆LmxGSK3β(-/-)hyg/neo-Klon.
Die Expositionszeit der dargestellten Filme (Mitte und rechts) betrug 30 min Links: zum Blot in der Mitte zugehöriges 0,7%-iges Agarose-Gel.
Die unterschiedliche Größe der nachgewiesenen HincII-Fragmente lässt Rückschlüsse auf die genomische Situation der Klone zu. Für das Wildtyp-Gen LmxGSK3β wird im Southern
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4 2.53 2 1.5 1 [kb]
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 141516171819
Wt hyg neo
phleo
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4 2.53 2 1.5 1 [kb]
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 141516171819
Wt hyg neo
phleo
Blot eine ~2100 bp große Bande erwartet. Bei erfolgter Integration des Hyg-Resistenzgens sollte eine ~2500 bp große, beim Phleo-Resistenzgen eine ~1650 bp große und beim Neo-Resistenzgen eine ~4000 bp große Bande im Southern Blot erscheinen. Auf dem Film des Southern Blots kann in allen Spuren eine ~2100 bp große Bande nachgewiesen werden (Abb. 64). Somit hatte keiner der Klone das zweite Allel von LmxGSK3β verloren. Mit Ausnahme der in Spur 4-6 und 17 gezeigten Klone, können für alle anderen Klone zusätzlich zum Wildtyp-Gen die Resistenzgene aus beiden Transfektionsrunden nachgewiesen werden. Hierdurch lässt sich die zweifache Antibiotikaresistenz dieser Klone in Kultur erklären. Das Banden-Muster des potentiellen Klons ∆LmxGSK3β(-/-)-hyg/phleo in Spur 17 lässt auf das Vorliegen des Wildtyp-Gens und des Phleo-Resistenzgens schließen. Statt der zu erwartenden ~2500 bp großen hyg-Bande ist eine etwa 3 kb große Bande auf dem Film zu sehen. Die DNA wurde womöglich unvollständig mit HincII gespalten und dadurch ist der Shift zur detektierten größeren Bande zu erklären. Die potentiellen ∆LmxGSK3β(-/-)-neo/hyg-Klone in Spur 4-6 zeigen ein Bandenäquivalent zum eingebrachten Neo-Resistenz-gen und eine sehr starke, überstrahlende Bande auf Höhe des LmxGSK3β-Fragments, jedoch keine hyg-Bande. Diese Klone lassen sich allerdings in Gegenwart von Hygromycin kultivieren. Eine Erklärungsmöglichkeit für den fehlenden Nachweis des Hygromycin-Resistenzgens wäre seine Integration an einem anderen Genlokus und Entstehen einer Bande, die mit einer anderen Bande deckungsgleich ist.
Zusammenfassend ist festzustellen, dass es sich bei keinem der untersuchten Klone um einen Doppeldeletionsklon von LmxGSK3β handelt – alle Klone sind falsch positiv.