Durchsuchen einer λ DASH II-Phagenbank

Neutralisierungslösung (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl pH 7,2, 1 mM EDTA pH 8,0) getränktes Whatman-Papier gelegt und schließlich in eine Wanne mit 2x SSC überführt. Die DNA wurde durch UV-Quervernetzung an die Membran fixiert (Autocrosslinking-Funktion im UV-Strata-linker) und die Membran danach in 2x SSC gelegt. Die Prähybridisierung und Hybridisierung mit der spezifischen DIG-markierten DNA-Sonde sowie der DIG-Nachweis erfolgten wie unter 2.2.6.8.2 und 2.2.6.8.3 beschrieben. Die Lochmarkierungen wurden von den Filtern auf den Film übertragen.

2.2.7.4 Vereinzelung der positiven Phagenklone

Auf einem Leuchtschirm wurden die Signale auf dem Röntgenfilm, mit Hilfe der Loch-markierungen, einzelnen Plaques auf der Platte zugeordnet. Die das gesuchte Gen tragen-den Kolonien wurtragen-den großzügig mit einer Pipettenspitze (Durchmesser: ~5 mm) ausge-stochen, in jeweils 50 µl SM-Puffer überführt und gründlich gemischt. Die Elution der Phagen aus der Agarose erfolgte bei 4 °C über Nacht. Die Phagen wurden erneut verdünnt, aus-plattiert und die gentragenden Klone identifiziert und extrahiert. Diese Vereinzelung wurde so oft wiederholt, bis sich nur noch positive Kolonien auf der Platte befanden.

2.2.7.5 Phagengewinnung und Bestimmung des Phagentiters

Die eluierten Phagenklone wurden in einer Verdünnung ausplattiert, die zu einer voll-ständigen Lyse des Bakterienrasens führt. Drei solcher Platten wurden pro Klon bei 37 °C über Nacht inkubiert. Die lysierten Platten wurden mit 3 ml SM-Puffer überschichtet, als Schutz vor Verdunstung mit Parafilm umwickelt und bei 4 °C über Nacht zum Übergang der Phagen in die Lösung geschwenkt. Die Lösung der drei Platten wurde in einem Schraub-röhrchen vereinigt und die Platten jeweils mit 1 ml SM-Puffer nachgespült. Nach Zugeben von 5 % (v/v) Chloroform wurden die Röhrchen 15 min bei RT auf dem Roller inkubiert und anschließend 10 min bei 2060 x g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde jeweils in ein neues Röhrchen überführt, mit Chloroform in einer Endkonzentration von 0,3 % versehen und bei 4 °C gelagert. Es wurden mit SM-Puffer Verdünnungen der Phagenlösung hergestellt, ausplattiert (2.2.7.2) und anhand der Anzahl der Plaques auf der Platte unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors, der Phagentiter der Lösung bestimmt.

ARBEITEN MIT RNA

Für das Arbeiten mit RNA wurde der Arbeitsplatz mit einer sauberen Unterlage versehen, es wurden häufig die Handschuhe gewechselt und ausschließlich dafür vorgesehene

Plastik-ware und Filterspitzen verwendet. Durch diese Maßnahmen und äußerst sauberes Arbeiten, sollte das Risiko von RNase-Kontamination vermindert werden.

2.2.8.1 Isolierung von Gesamt-RNA aus Leishmanien mit dem M&N NucleoSpin RNA II Kit Es wurden 5 x 10⁸ Promastigoten durch Zentrifugieren bei 5600 x g für 20 s geerntet. Die Präparation der RNA erfolgte laut Herstellerangaben. Es wurde mit 60 µl RNase-freiem Wasser eluiert (Kit). Die Konzentration der RNA-Lösung wurde photometrisch durch Mes-sung der OD260 bestimmt. Der Berechnung lag die Annahme zugrunde, dass eine OD260 = 1 einer RNA-Konzentration von 40 µg/ml entspricht.

2.2.8.2 Reverse Transkription (RT-PCR)

Die Transkription der RNA in cDNA erfolgte in 200 µl PCR-Gefäßen im Thermocycler. Für die cDNA-Erststrangsynthese wurde der SuperScript II Reverse Transkriptase Kit (Invitro-gen Life Technologies) benutzt: 2 µg Gesamt-RNA aus Promastigoten wurden mit je 5 pmol der beiden spezifischen Oligonukleotide und HPLC-H2O in einem Gesamtvolumen von 12 µl 10 min bei 70 °C erhitzt und anschließend 2 min auf Eis abgekühlt. Danach wurden 4 µl 5x First-Strand-Puffer (Kit), 2 µl 0,1 M DTT (Kit) und 0,5 µl 20 mM dNTPs zupipettiert und 2 min bei 42 °C inkubiert. Nach Zugabe von 1 µl (=200 U) SuperScript II RT wurde für 1 h bei 42 °C und 15 min bei 70 °C inkubiert.

Die cDNA-Zweitstransynthese erfolgte mit 2 µl cDNA aus der Erststrangsynthese als Vorlage und dem Expand High Fidelity PCR System von Roche wie unter 2.2.6.7 beschrieben.

ARBEITEN MIT PROTEINEN

2.2.9 Protein- und Immunochemische Methoden

2.2.9.1 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford, 1976

Beim Bradford-Test bindet der Baumwollfarbstoff Coomassie Blue an Arginin-Reste von Proteinen. Es wurden 10 µl der Proteinlösung mit 500 µl Bradford-Reagenz in einer Küvette vermischt, 2 min inkubiert und die Extinktion bei 595 nm gegen einen Leerwert photo-metrisch bestimmt. Die Zuordnung der Absorption zu einer Proteinkonzentration erfolgte anhand einer Eichgerade, die für jede neu angesetzte Bradford-Lösung mit einer BSA-Verdünnungsreihe erstellt wurde.

2.2.9.2 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Bei SDS-PAGE werden die Proteine in Gegenwart von 0,1 % (w/v) SDS während ihrer Wanderung durch zuerst das Sammel-, dann das Trenngel in Richtung Anode gemäß ihrem Molekulargewicht getrennt (Methode nach Laemmli, 1970). Das Sammelgel besaß eine Poly-acrylamid-Konzentration von 6 % (v/v), das Trenngel von 10, 12 bzw. 15 %. Der Starter der Polymerisation APS wurde zuletzt hinzugegeben. Benutzt wurde das Minigel-System von Biometra. Die Proteinproben wurden in 1x SDS-PAGE-Auftragspuffer für 10 min bei 95 °C denaturiert, abgekühlt und davon 15-30 µl in die Geltasche geladen. Es wurde auf jedes Gel ein Größenstandard (Prestained Protein Marker, NEB) geladen. Die Auftrennung der Proben bei RT erfolgte im Sammelgel bei einer Stromstärke von 15 mA und im Trenngel bei 20 mA bzw. bei 20 mA und 40 mA bei zwei Gelen in einer Kammer. Als Elektrophoresepuffer wurde 1x SDS-PAGE-Laufpuffer verwendet.

Sammelgel: Trenngel :

1x Sammelgelpuffer 1x Trenngelpuffer

6 % Acrylamid/Bisacrylamidlösung 10, 12 oder 15 % Acrylamid/Bisacrylamidlösung

0,1 % SDS 0,1 % SDS

0,001 Volumenanteil TEMED 0,0005 Volumenanteil TEMED

0,06 % APS 0,1 % APS

2.2.9.3 Färbung von SDS-PA-Gelen mit Coomassie Blue

Zur Proteinfärbung mit Coomassie Blue wurde das Gel mit Coomassie-Färbelösung für 45 min bei RT unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend wurde das Gel in Coomas-sie-Entfärberlösung geschwenkt, bis die gefärbten Proteinbanden sich deutlich sichtbar vom Hintergrund abhoben. Der Entfärber wurde hierbei i. d. R. einmal ausgetauscht. Danach wurden die Gele getrocknet bzw. in Wasser gelagert und zur Dokumentation gescannt.

2.2.9.4 Trocknen von Gelen

Die Gele wurden zunächst 30 min in Geltrocknungslösung leicht geschüttelt. Dann wurden sie luftblasenfrei zwischen zwei in Wasser eingeweichte Zellophan-Folienblätter in einen Gel-rocknungsrahmen gespannt und für mindestens 24 Stunden unter dem Abzug getrocknet.

2.2.9.5 Immunoblot

2.2.9.5.1 Elektrophoretischer Transfer von Proteinen im Semi-Dry-Verfahren

Im Anschluss an die SDS-PA-Gelelektrophorese wurden die getrennten Proteine nach dem Semi-Dry-Verfahren auf eine Immobilon-P PVDF-Membran transferiert. Das Sammelgel wurde entfernt. Die auf die Größe des Trenngels zugeschnittenen Whatman-Papiere wurden

Anode

+

Kathode

-3 Lagen Whatman-Papier

3 Lagen Whatman-Papier SDS-Polyacrylamidgel PVDF-Membran

in Immunoblot-Transferpuffer getränkt und die PVDF-Membran 1 min in Methanol und 10 min in Puffer benetzt. Die Blotapparatur (Fastblot-Kammer) wurde nach dem Schema in Abb. 12 luftblasenfrei zusammengesetzt und beschwert. Der Blotvorgang erfolgte bei 4 mA pro cm² Membran für 30 min (45 min bei zwei Gelen in der Blotkammer) bei RT.

Abb. 12: Schematische Darstellung des Aufbaus eines Protein-Blots.

2.2.9.5.2 Nachweis mittels Antikörperreaktion

Das SDS-PA-Gel wurde nach dem Blotvorgang mit Coomassie gefärbt. Zu Beginn der Nachweisreaktion wurde die Blotmembran zur Absättigung von unspezifischen Bindungsstel-len für 1 h bei 37 °C in Blockierungslösung (5 % MP/PBST oder 3 % BSA/TBST) geschwenkt. Für die Verdünnung der beiden Antikörper wurde nachfolgend die gleiche Art von Blockierungslösung benutzt. Im Anschluss erfolgte die Inkubation mit dem gegen das zu detektierende Protein gerichteten Antikörper in Blockierungslösung bei 4 °C über Nacht unter Schwenken. Überschüssiger Primärantikörper wurde durch viermal Waschen mit PBST bzw.

TBST für jeweils 10 min entfernt und der Blot mit dem spezifischen Sekundärantikörper in Blockierungslösung für 2 h bei RT geschwenkt. Überschüssiger Sekundärantikörper wurde durch einmal Waschen mit PBST bzw. TBST und dreimal Waschen mit PBS bzw. TBS, jeweils für 10 min, entfernt. Die Visualisierung des mit Meerrettich-Peroxidase-(HRP-) gekop-pelten Sekundärantikörpers erfolgte durch benetzen des Blots mit frisch angesetzter Ent-wicklerlösung, die zu je einem Teil aus den beiden Reagenzien des SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Kits bestand. Am Schluss wurde der feuchte Blot, in einer Plas-tikfolie verpackt, in eine Filmkassette gelegt und der Röntgenfilm für 1 s - 45 min exponiert.

2.2.9.5.3 Entfernung des gebundenen Antikörpers – Stripping des Blots

Die Membran wurde unter ständigem Schwenken zuerst 30 min bei 65 °C in Immunoblot Stripping-Lösung und dann 2 x 10 min in jeweils 250 ml PBST bei RT gewaschen. Danach wurde die Membran in Blockierungslösung überführt und begonnen mit der Blockierung, ein Nachweis mit einem anderen Primärantikörper durchgeführt.

2.2.9.6 Bestimmung von Phosphorylierungsstellen durch MALDI-TOF-MS und MS/MS

Die Proteinbande von Interesse wurde aus einem Coomassie-gefärbten SDS-PA-Gel mit einem sauberen Skalpell ausgeschnitten und in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt. Die Proben wurden für die Durchführung der MALDI-TOF-MS- und MS/MS-Analysen an Frau Heidi Rosenqvist geschickt (Protein Research Group der Süddänischen Universität in Odense, Dänemark). Die folgenden Arbeitsschritte wurden von ihr durchgeführt: Die Proben wurden einem in-Gel-Trypsin-Verdau unterzogen und nachfolgend die Phosphopeptide mittels TiO2-Chromatographie angereichert. Die massenspektrometrische Untersuchung der Peptide erfolgte am Bruker Ultraflex TOF-TOF-Gerät. Die Peptidsequenzen der Peaks von Interesse wurden nachfolgend mittels MS/MS-Analyse verifiziert. Die Datenanalyse wurde mit Hilfe der Programme FlexAnalysis, Version 2.4 und Biotools Version 3.0 durchgeführt.

Zur Datenbanksuche wurde die Mascot Suchmaschine genutzt (www.matrixscience.com).

Größere Peptide (m/z > 3000) treten schlechter vom Gel in den Verdau-Überstand über.

Daher wurde neben dem Verdau-Überstand auch ein Gemisch aus diesem und einem Peptidextrakt, hergestellt aus der jeweiligen im Gel verbliebenen Probe, in die Analyse einbezogen.