Genomische Komplementation der Mutante ∆LmxMPK7

∆LmxMPK7

0 5 10 15 20 25

0 1 2 3 4 5 6 7

Amastigoten / Makrophage

Tage post infectionem

Wt

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0 1 2 3 4 5 6 7

Anteil der Makrophagen mit unterschiedlicher Parasitenlast [%]

Tage post infectionem

L.mexicanaWildtyp

Anzahl der Leishmanien pro Makrophage:

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0 1 2 3 4 5 6 7

Anteil der Makrophagen mit unterschiedlicher Parasitenlast [%]

Tage post infectionem

∆LmxMPK7

0 1-10 11-20 21-30 >30

0 d 0 d

5 d 5 d

* *

*

*

* *

Amastigoten aus Makrophagen mit hoher Parasitendichte zur Neuinfektion naiver Zellen zurückzuführen.

A.

B. C.

Abb. 31: Wachstumsverhalten von ∆LmxMPK7 und L. mexicana Wildtyp (Wt´99) in murinen Peritonealmakrophagen. A: Das Diagramm zeigt den prozentualen Anteil der jeweiligen Gruppe (0, 1-10, 11-20, 21-30 und >30 Leishmanien pro Makrophage) an der Gesamtpopulation. B: Durchschnitt-liche Parasitenlast. Für ∆LmxMPK7 wurde aus der Auszählung der Klone B10D4, D3E6 und H8A12 der Mittelwert gebildet (A und B). Die Fehlerindikatoren geben die Standardabweichung wieder. C:

Durchlicht- (links) und DAPI-Fluoreszenzaufnahme (rechts): fixierte Probe nach Infektion von Makrophagen mit Promastigoten von Klon D3E6 und Waschschritt zur Entfernung freier Zellen (0 d) und Probe nach 5 Tagen (5 d). Stern: Makrophagenzellkern; Pfeil: exemplarisch eine Leishmania-Zelle mit gefärbtem Zellkern und Kinetoplast. Der Balken entspricht 5 µm.

Um-setzung von Letzterem ist nicht mehr erfolgt). Hiermit sollte geklärt werden, ob der Phänotyp der Deletionsmutante auf das Fehlen der Kinase zurückzuführen ist. Ist das der Fall, sollte die Re-Expression von LmxMPK7 zu einem Phänotyp ähnlich dem des Wildtyps führen.

Außerdem wurde eine inhibitorsensitive-(IS)-Mutante von LmxMPK7 durch Mutation von Threonin-210 zu Alanin hergestellt und erfolgreich beide Allele von LmxMPK7 im Wildtyp mit LmxMPK7-IS ersetzt (nicht gezeigt).

3.1.2.7.1 Herstellung des Konstrukts zur genomischen Reintegragtion von LmxMPK7

Das Plasmid pX14polNcoIPAC (hergestellt von M. Erdmann), welches unmittelbar stromauf des Puromycinresistenzgens eine zusätzliche NcoI-Schnittstelle besitzt, wurde mit den Restriktionsendonukleasen XhoI und SacI geschnitten. Das resultierende Fragment wurde aus dem Gel isoliert und in das mit den gleichen Enzymen gespaltene Plasmid pX6MPK7TYC-ds eingebracht. Das resultierende Plasmid pX6MPK7TYC+NcoI unterschied sich von seinem Vorgänger nun durch das Vorliegen der zusätzlichen NcoI-Schnittstelle vor dem Resistenzgen. Aus der sich anschließenden Klonierung, ging als Vorläufer zum „add-back“-Konstrukt, das Konstrukt zur Generierung einer inhibitorsensitiven-Mutante LmxMPK7-IS hervor. Hierzu wurde ein, die LmxMPK7-IS-Mutation tragendes Acc65I/XbaI-Fragment über gleichnamige Schnittstellen in das Plasmid pX6MPK7TYC+NcoI einligiert. Es resultierte das Plasmid pXMPK7ISTYC+NcoI. Um die Angliederung der flankierenden Bereiche von LmxMPK7 zu ermöglichen, wurde mittels den Oligonukleotiden LmxMPK7NheI.rev und LmxMPK7NcoI.for und dem Plasmid pX6MPK7TYC-ds als Vorlage in einer PCR-Reaktion, unmittelbar stromab der Sequenz des C-terminalen TY-Tags eine zusätzliche NheI-Schnittstelle und innerhalb des ORF von LmxMPK7 eine NcoI-Schnittstelle geschaffen.

Diese nicht permanente NcoI-Schnittstelle wurde eingeführt, um die Länge der amplifizierten Sequenz und damit die Wahrscheinlichkeit eines Fehlers beim Nukleotideinbau möglichst klein zu halten. Das PCR-Produkt wurde mittels TOPO-Klonierung in das Plasmid pCR2.1 überführt und durch Sequenzierung überprüft. Das Plasmid pB7XNLmxMPK7Nterm trägt 897 bp der stromauf- und 1540 bp der stromab-Region von LmxMPK7 und existierte bereits zu Beginn dieser Arbeit. Die stromauf- und stromab-Region sind durch eine NcoI- und NheI-Schnittstelle voneinander getrennt. Das mit NcoI- und NheI-Schnittstelle versehene MPK7TY-PCR-Produkt in pCR2.1 wurde mittels Spaltung mit gleichnamigen Enzymen und anschließender Aufreinigung aus dem Gel gewonnen und zwischen die flankierenden Bereiche des mit NcoI und NheI geöffneten Plasmids pB7XNLmxMPK7Nterm eingebracht.

Es resultierte pBusdsMPK7NcoI/NheI.

An Basenpaarposition 89 und 1541 von LmxMPK7 befindet sich je eine ClaI-Schnittstelle.

Die ClaI-Schnittstelle an Position 89 ist dam^--Methylase sensitiv, d. h. das zugehörige Enzym vermag das Plasmid, welches im E. coli Stamm XL1 kloniert wurde, an dieser Stelle nicht zu

NruI NcoI

MunI NcoI ClaI

Acc65I NruI

XbaI ClaI

NheI

us PAC LmxMPK7 TY ds

ScaI XhoI

IR

schneiden. Somit wird nur die Schnittstelle an Position 1541 benutzt. Das Plasmid pXMPK7ISTYC+NcoI wurde mit NcoI und ClaI verdaut. Zwei der resultierenden Fragmente wurden aus dem Gel isoliert, zum einen das die ersten 1541 bp des LmxMPK7-Gens (inkl.

IS-Mutation) tragende NcoI/ClaI-Fragment und zum anderen das das Puromycinresistenzgen und die intergene Region der DHFR-TS umfassende NcoI/NcoI-Fragment.

pBusdsMPK7NcoI/NheI wurde mit NcoI und ClaI gespalten und in der anschließenden Gel-aufreinigung das 5911 bp große Fragment des Plasmids isoliert. Zuerst wurde das NcoI/ClaI-Fragment einligiert und dadurch das LmxMPK7-Gen komplementiert. Dann wurde das resultierende Plasmid mittels NcoI-Spaltung geöffnet und das NcoI/NcoI-Fragment eingebracht. Die Orientierung wurde durch Spaltung mit geeigneten Restriktionsenzymen überprüft. Das generierte Plasmid hieß pBusdsMPK7ISTYCPAC und stellte das End-konstrukt der Klonierung der LmxMPK7-IS-Mutante dar. Die zugehörige Plasmidkarte findet sich im Anhang. Das Konstrukt wurde durch Sequenzierung überprüft. Durch Spaltung von pBusdsMPK7ISTYCPAC und pX6MPK7TYC-ds mit jeweils MunI und ClaI und anschließen-dem Austausch des die IS-Mutation tragenden Bereichs gegen den gleichen Abschnitt des LmxMPK7-Wildtyp-Gens wurde das Endkonstrukt pBusdsMPK7abTYCPAC der „add-back“(ab)-Klonierung erzeugt.

Abb. 32: Schematische Darstellung des LmxMPK7-“add-back“-Konstrukts. Neben LmxMPK7 mit C-terminalem TY-Tag umfasst es: us = stromauf-, ds = stromab-Region; PAC = Gen der Puromycin-N-Acetyltransferase; IR = intergene Region der Dihydrofolatreduktase Thymidylatsynthase (DHFR-TS).

3.1.2.7.2 Herstellung der ∆LmxMPK7(+/-)-„add-back“-Mutante

Durch homologe Rekombination über die flankierenden Regionen, sollte LmxMPK7 an seinen ursprünglichen genomischen Lokus reintegriert und dadurch die Expression und Synthese von LmxMPK7 in der Nullmutante wiederhergestellt werden. Zum erleichterten Nachweis war das Protein mit einem C-terminalen TY-Tag versehen. Die Selektion positiver Klone sollte durch das Vorhandensein der Puromycin-Resistenz gewährleistet werden.

Das Konstrukt pBusdsMPK7abTYCPAC wurde mit XhoI und ScaI geschnitten (beachte Schema Abb. 32). Das gewünschte lineare Fragment wurde in Promastigoten der Klone B10D4, D3E6 und H8A12 von ∆LmxMPK7 transfiziert und lieferte in allen Fällen rekom-binante Klone. Deren genomische DNA wurde präpariert, mit NruI und XhoI geschnitten und einer Southern Blot-Analyse unterzogen (Abb. 33). Als Kontrollen dienten mit denselben Restriktionsenzymen gespaltene gDNA von L. mexicana Wildtyp und dem Klon B10D4 der Nullmutante.

10 5 68

4 2.53 2 1.5 1 [kb]

0.5

2 3

1 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

Abb. 33: Southern Blot-Untersuchung zum Nachweis der genomischen Reintegration von LmxMPK7 in ∆LmxMPK7. 1: LmxWt; 2: ∆LmxMPK7 Klon B10D4; 3-8: potentielle LmxMPK7-„add-back“-Mutanten: Klon B10G4, B10G5 (Abkömmlinge von B10D4), D3F5 (Abkömmling von D3E6), H8H2, H8H3 und H8H5 (Abkömmlinge von H8A12). Mitte: Detektion mit der LmxMPK7-ds-Sonde, Film nach 1 h 30 min Exposition. Rechts: Nach strippen des Blots Detektion mit der LmxMPK7-Gen-Sonde, Film nach 14 h Exposition. Links: Korrespondierendes 0,7 %-iges Agarose-Gel. Die schwarze Pfeilspitze verweist auf Fragmente, welche Abschnitte des LmxMPK7-Gens tragen. Die graue Pfeilspitze zeigt Banden der Resistenzgene hyg und phleo an.

Mit der stromab-(ds)-Sonde (Abb. 33, Mitte) wird für den Wildtyp, korrespondierend zum LmxMPK7-Fragment, eine Bande auf Höhe von 2538 bp nachgewiesen (Spur 1). Für den Doppeldeletionsklon werden Banden auf Höhe von 2963 bp und 2309 bp nachgewiesen (Spur 2). Diese Banden sind dem Fragment zuzuordnen, welches das Hygromycin-Resistenzgen (hyg) bzw. Phleomycin-Hygromycin-Resistenzgen (phleo) trägt. Die ds-Sonde liefert für alle potentiellen LmxMPK7-„add-back“-Klone eine Bande auf Höhe von 2584 bp, korrespon-dierend zum Fragment des LmxMPK7-TY tragenden „add-back“ Konstrukts (Spur 3-8).

Außerdem wird für alle Klone eine Bande auf Höhe von 2309 bp nachgewiesen. Dies spricht für den Erhalt der Phleomycin-Resistenz. Vier der sechs potentiellen „add-back“-Klone besitzen keine Bande auf Höhe von 2963 bp. Offensichtlich haben mit Ausnahme der Klone H8H2 und H8H5 alle „add-back“-Klone das LmxMPK7-TY-Konstrukt anstelle des Hygro-mycin-Resistenzgens genomisch integriert. Möglicherweise haben die Klone H8H2 und H8H5 nach Chromosomverdopplung das LmxMPK7-„add-back“-Konstrukt unter Beibehal-tung der Hygromycin- und Phleomycin-Resistenz genomisch integriert. Die Detektion mit der LmxMPK7-Gen-Sonde (Abb. 33, rechts) liefert für die Wildtyp-Situation eine Bande auf Höhe von 1129 bp (Spur 1). Wie nicht anders zu erwarten, fehlt diese Bande in der Spur der LmxMPK7-Nullmutante (Spur 2). Für alle „add-back“-Klone wird eine Bande auf Höhe von 3172 bp detektiert (Spur 3-8). Diese entspricht dem NruI-Fragment, welches pac, die Intergene Region und Teile der stromauf-Region und des ORF von LmxMPK7 umfasst. Die Klone H8H3, B10G4, B10G5 und D3F5 haben das LmxMPK7-Gen unter Verlust des Hygromycin-Resistenzgens in den ursprünglichen Genlokus reintegriert − bei ihnen handelt es sich um „add-back“-(+/-)-Mutanten von LmxMPK7. Diese Klone wurden weiter verwendet.

[kDa]

175 80 58 46 30 25 17

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Promastigoten Amastigoten 3d

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Promastigoten Amastigoten 3d

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Promastigoten Amastigoten 3d

Im Dokument Charakterisierung der MAP-Kinase LmxMPK7 und der Glykogensynthase-Kinasen GSK3α und GSK3β des humanpathogenen Parasiten Leishmania mexicana (Seite 131-135)