Probengewinnung und -bearbeitung

3.4 Probengewinnung und -bearbeitung 3.4.1 Blutentnahme

Die Blutentnahme erfolgte aus der Vena cephalica oder der Vena saphena mit sterilen Einmal-Injektions-Kanülen (1,1x30mm) am stehenden Hund. Dabei wurden die betreffenden Gefäße nicht oder nur kurzzeitig leicht gestaut. Nach Verwerfung der ersten Blutstropfen wurde das frei nachfließende Blut in mit Antikoagulanz beschichteten Probengefäßen aufgefangen. Dies umfasste für die Untersuchung der Plättchenaggregation ein mit 1 ml 0,11 mol/l Natriumzitrat-Lösung (1 Teil) befülltes Polyethylen-Zentrifugenröhrchen, welches bis zur 10 ml Markierung mit Blut (9 Teile) gefüllt wurde. Für die Untersuchung der Verschlusszeit und des Gesamtvolumens des Plättchenfunktionsanalysengerätes wurde ebenfalls Blut in eine Zitronensäure-Natriumzitrat-Puffer (1 Teil 0,129 mol/l Zitrat für 9 Teile Blut) enthaltende 2,9 ml Monovette entnommen. Nach Verschluss der Röhrchen wurden diese vorsichtig geschwenkt, um eine vollständige Durchmischung des Blutes mit dem Antikoagulanz zu gewährleisten. Für die hämatologische Untersuchung wurden 1,3 ml Blut in Kalium-EDTA-Mikroprobengefäße (1,6 mg EDTA/ml Blut)

aufgefangen. Innerhalb der nachfolgenden Minuten schloss sich die Aufbereitung der Blutproben an.

3.4.2 Probenverarbeitung und Gewinnung von plättchenreichem und plättchenfreiem Zitratplasma

Die Gewinnung von plättchenreichem Plasma (PRP) zur Messung der Thrombozytenaggregation erfolgte aus dem im 10 ml Polyethylenzentrifugenröhrchen aufgefangenen Zitratblut durch 30-minütige Zentrifugation in der Kühlzentrifuge bei 20°C und 150 x g. Der plättchenreiche Überstand wurde in ein Polyethylenzentrifugenröhrchen abpipettiert. Um plättchenfreies Plasma (PFP) zu erhalten, wurde ein Teil des PRP nochmals 10 Minuten bei 10.000 x g zentrifugiert, der Überstand ebenfalls abpipettiert und in Kunstoffreaktionsgefäßen aufbewahrt. Das zur Aggregationsmessung verwendete plättchenreiche Plasma wurde nach der Kontrolle der Thrombozytenzahl innerhalb von 4 Stunden verwendet und währenddessen bei Raumtemperatur aufbewahrt.

Bei plättchenreichem Plasma mit einer Thrombozytenzahl von über 300.000/µl erfolgte durch Zugabe von plättchenfreien Plasma die Einstellung der Thrombozytenzahl auf 300.000/µl. Lag die Thrombozytenzahl im plättchenreichem Plasma unterhalb von 100.000/µl, so wurden die Ergebnisse der Thrombozytenaggregation nur bei der Einzelwertdarstellung im tabellarischen Anhang festgehalten (siehe Tab. A8 u. A9, tabell. Anhang). Bei dem statistischen Gruppenvergleich der maximalen Thrombozytenaggregation wurden diese Ergebnisse hingegen nicht berücksichtigt, um artifizielle methodenbedingte Veränderungen weitestgehend auszuschließen. Der statistische Vergleich der Gruppen für die Thrombozytenaggregation bezieht sich damit auf eine reduzierte Gruppengröße von n=27 (malignes Lymphom), n=5 (akute lymphatische Leukämie) und n=5 (chronische lymphatische Leukämie). Abweichend hiervon wurde bei der Untersuchung des Einflusses der Zytostatikatherapie Patient 27 mit berücksichtigt, dessen Thrombozytenzahl im plättchenreichem Plasma während der ersten Behandlungswoche um 100.000/µl schwankte, d. h.

teilweise diesen Wert leicht unterschritt.

3.5 Methoden

3.5.1 Kapilläre In-vivo-Blutungszeit

Zur Messung der kapillären In-vivo-Blutungszeit entsprechend der von NOLTE et al. (1997) beschriebenen Methode wurde der Hund in Seitenlage verbracht. Nach Rasur des Punktionsgebietes im Übergang von behaarter Haut zum Ballenhorn der seitlichen Zehe der Vordergliedmaße wurde eine Blutdruckmanschette über Radius und Ulna dieser Gliedmaße angelegt, auf das geschorene Hautareal eine hyperämisierende Salbe aufgetragen und eine Stoppuhr gestartet. Nach Ablauf von einer Minute wurde die Salbe mit einem Mulltupfer entfernt und die Blutdruckmanschette mit einem Druck von 70 mm Hg aufgeblasen. Nach Ablauf einer weiteren Minute erfolgte 1–3 cm oberhalb der Ballengrenze zweimalig im Abstand von einem halben Zentimeter eine Punktion mit einer automatischen Blutlanzette. Bei Aufrechterhaltung der Blutdruckverhältnisse wurden die frei fließenden Blutperlen alle 15 Sekunden vorsichtig mit einem Mulltupfer abgesaugt. Die Zeit von der Punktion bis zum vollständigen Versiegen der Blutung wurde als kapilläre In-vivo-Blutungszeit gemessen und aus den beiden sich ergebenden Werten der Mittelwert gebildet.

3.5.2 Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100

Die Untersuchung mit dem Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100 erfolgte in einem Zeitraum von 30–60 Minuten nach der Blutentnahme. Die Messzellen, welche bei 4°C gelagert wurden, wurden vor Beginn der Messung für 15 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahrt. Danach wurde zunächst die Kollagen/Epinephrin-Messzelle in die Position A der Kassette des Plättchenfunktionsanalysengerätes eingesetzt. Nach vorherigem vier- bis fünfmaligen, vorsichtigen Schwenken der Blutprobe wurden 1000 µl aus der gepufferten Zitratblutprobe in das Probenreservoir der in der Kassette befindlichen Messzellen pipettiert und über die integrierte Tastatur des Gerätes der Testlauf gestartet. Nach Ausgabe der Ergebnisse erfolgte die Entsorgung dieser Messzelle und der Test wurde mit der zweiten Messzelle (Kollagen/ADP- Messzelle) in analoger Weise durchgeführt.

3.5.3 Thrombozytenzahl und andere Messgrößen des Blutbildes

Die Thrombozytenzahl sowie der Hämatokrit, der Hämoglobingehalt, die Erythrozyten- und die Leukozytenzahl wurden mit dem automatischen Hämatologiesystem ADVIA® 120 gemessen. Die Messung der Thrombozyten und Erythrozyten erfolgt hiermit durchflusszytometrisch nach

isovolumetrischer Aufkugelung über ein Doppelwinkel-Laser-Streulicht-Verfahren. Dieses führt zur direkten Messung der Anzahl der Zellen und des individuellen Thrombozyten- und Erythrozytenvolumens. Die Messung und Differenzierung der Leukozytenfraktion im EDTA-Blut erfolgt durch Bestimmung der Anzahl, des Volumens und der Zellstruktur durch Ermittlung der Peroxidaseaktivität der Einzelleukozyten. Der Hämoglobingehalt im Blut wird mit dem Hämatologiesystem nach Lyse der Erythrozyten unter Freisetzung von Hämoglobin und anschließender Oxidation des im Hämoglobin enthaltenden Hämeisens von Fe²⁺ zu Fe³⁺ und der anschließenden Bindung an das im ADVIA® 120 HGB Reagenz enthaltende Cyanid photometrisch bestimmt. Qualitätskontrollen erfolgten in regelmäßigen Abständen mit kommerziellem humanen Kontrollblut.

3.5.4 Thrombozytenaggregation nach der BORN-Methode

Die Messung der Thrombozytenaggregation basierte auf der Methode von BORN (1962), modifiziert für den Einsatz beim Hund (NOLTE et al. 1997), an einem 2-Kanal-Aggregometer mit rechnergestützter Kurvenanalyse. Für die vorliegende Studie wurde als Agonist zur Induktion der Thrombozytenaggregation ADP in einer Endkonzentrationen von 0,025 mol/l verwendet. Das in Trockensubstanz vorliegende ADP (0,2 µmol) wurde zur Herstellung einer Lösung mit einer Konzentration von 0,525 mol/l ADP mit 381 µl Aqua bidest in Lösung gebracht. Die ADP-Lösung war bei Kühlschranktemperatur 5 Tage lagerbar, vor der Verwendung wurde sie zur Erwärmung 10 Minuten bei Zimmertemperatur aufbewahrt.

Zu Beginn jeder Messung erfolgte die Eichung des Aggregometers mit zwei Standards auf 100 % Aggregation (PFP) und 0 % Aggregation (PRP). Der Ansatz für die Eichung auf 100 % enthielt 200 µl PFP + 10 µl einer isotonen NaCl-Lösung. Der Ansatz für die Eichung auf 0% Aggregation setzte sich aus 200 µl PRP + 10 µl isotoner NaCl-Lösung zusammen.

Für die Messung der Thrombozytenaggregation wurden jeweils 200 µl PRP in die Küvette der beiden Messkanäle pipettiert und die Registrierung gestartet. Nach zweiminütiger Inkubationszeit bei 37°C wurde die Aggregation mit jeweils 10 µl der aggregationsauslösenden Substanz (ADP) induziert. Während der Messung über 12 Minuten erfolgte ein ständiges Rühren der Testansätze mit einem Magnetrührer bei 1000 U/min. Aggregationseintritt und -ablauf wurden bei einer Papiergeschwindigkeit von 7,5 mm/min aufgezeichnet. Die Ermittlung des Aggregationsmaximums (%) erfolgte automatisch durch das Gerät.