Fokale Applikation von Kainsäure oder Pilocarpin in die rechte BLA

durchgeführt. Zum einem wurden basierend auf Vorversuchen von U. Ebert und P.

Wlaz Ratten fokal Kainat in die BLA appliziert. Zum anderen wurde in einem Vorversuch Ratten fokal Pilocarpin in die BLA injiziert.

Eine Gruppe von Tieren (n = 6) erhielt Kainsäure (2 µg gelöst in 250 nl artifizieller Cerebrospinalflüssigkeit). Je zwei Ratten erhielten Pilocarpin entweder 10 µg oder 30 µg gelöst in 300 nl artifizieller Cerebrospinalflüssigkeit.

ERGEBNISSE

immobil. Dreißig Sekunden nach der Injektion zeigten die ersten Ratten wet dog shakes (100 %) und Circling nach links (50 %). Die Ratten entwickelten außerdem eine Piloerektion und Kyphose kurz nach der Injektion. Einige Tiere zeigten Hyperlokomotion (33 %). Andere Tiere (50 %) verharrten wiederholt für einige Sekunden. Im weiteren Verlauf hatten die Ratten fokale Krampfaktivität (Stadium I-III), die bei 83 % der Tiere nach 106,8 ± 14,94 min in generalisierte Krampfaktivität überging (Tabelle 14). Keines der Tiere entwickelte einen generalisierten SE.

Zwischen den Anfällen machten drei Tiere mehrere Rollen über die linke Seite. Die meisten Tiere (60 %) hatten noch drei Stunden nach der Applikation wiederholt auftretende generalisierte Krampfaktivität. Zwei Ratten zeigten sogar am nächsten Tag noch fokale Krampfaktivität. Alle Tiere überlebten die ersten 24 h.

Fokales Kainat-Modell

Parameter Werte

Anzahl der Tiere mit Kainsäurebehandlung (n) 6 Anzahl der Tiere mit generalisierter

Krampfaktivität (n) 5

Anzahl der Tiere mit SE (n) 0

Beginn generalisierter Krampfaktivität nach Applikation (in min)

106,8 ± 14,94 [57-144]

Mortalität während ersten 24 h (n) 0

Tabelle 14: Übersicht über die Tierzahlen und Beobachtungsparameter im fokalen Kainat-Modell. In der Tabelle sind die Anzahl von Tieren mit Kainsäurebehandlung, die Anzahl der Tiere mit generalisierter Krampfaktivität, die Anzahl der Tiere mit generalisiertem Status epilepticus (SE) und die Mortalität während der ersten 24 h des Versuchs aufgeführt. Ferner sind die Mittelwerte ± Standardfehler sowie minimale und maximale Werte der Latenzzeit zwischen Applikation und dem Auftreten generalisierter Krampfaktivität dargestellt.

Im fokalen Pilocarpin-Modell sah es ähnlich aus. Die Tiere zeigten jedoch keine wet dog shakes und kein Circling. Die zwei unterschiedlichen Dosierungen werden getrennt voneinander besprochen.

ERGEBNISSE Beide Ratten, die 10 µg Pilocarpin bekamen, wiesen Piloerektion und eine Kyphose kurz nach der Pilocarpin-Injektion auf. Im weiteren Verlauf zeigten diese Tiere fokale Krampfaktivität (Stadium I-III). Eine Ratte entwickelte im weiteren Verlauf drei einzelne generalisierte Anfälle, die dann in eine kontinuierliche Krampfaktivität übergingen (Tabelle 15). Die Krampfaktivität bestand noch vier Stunden, hingegen war am nächsten Morgen keine Krampfaktivität mehr zu beobachten. Beide Tiere überlebten die ersten 24 h.

Fokales Pilocarpin-Modell (10 µg)

Parameter Werte

Anzahl der Tiere mit Pilocarpin-Behandlung

(n) 2

Anzahl der Tiere mit generalisierter

Krampfaktivität (n) 1

Anzahl der Tiere mit SE (n) 1

Beginn generalisierter Krampfaktivität nach

Applikation (in min) 42

Anzahl generalisierter Anfälle bis zum SE 3 Beginn SE nach Applikation (in min) 97 Mortalität während ersten 24 h (n) 0

Tabelle 15: Übersicht über die Tierzahlen und Beobachtungsparameter im fokalen Pilocarpin-Modell (10 µg). In der Tabelle sind die Anzahl von Tieren mit Pilocarpin-Behandlung, die Anzahl der Tiere mit generalisierter Krampfaktivität, die Anzahl der Tiere mit generalisiertem Status epilepticus (SE) und die Mortalität während der ersten 24 h des Versuchs aufgeführt. Ferner sind die Mittelwerte ± Standardfehler sowie minimale und maximale Werte der Latenzzeit zwischen Applikation und dem Auftreten generalisierter Krampfaktivität bzw. des SE dargestellt.

Bei 30 µg Pilocarpin pro Ratte konnte ein ähnliches Bild des Krampfgeschehens wie bei der niedrigeren fokalen 10 µg Pilocarpin-Applikation beschrieben werden. Die Tiere zeigten zuerst eine Piloerektion und eine Kyphose. Sie entwickelten dann

ERGEBNISSE

min und zwei generalisierten Anfällen eine kontinuierliche generalisierte Krampfaktivität. Die Ratte starb 210 min nach Injektion. Die beiden anderen Ratten besaßen nach 132 bzw. 199 min keine Krampfaktivität mehr. Beide Tiere überlebten die ersten 24 h.

Fokales Pilocarpin-Modell (30µg)

Parameter Werte

Anzahl der Tiere mit Pilocarpin-Behandlung

(n) 3

Anzahl der Tiere mit generalisierter

Krampfaktivität (n) 3

Anzahl der Tiere mit SE (n) 1

Beginn generalisierter Krampfaktivität nach Applikation (in min)

26,67 ± 5,58 19-36 Anzahl generalisierter Anfälle bis zum SE 2 Beginn SE nach Applikation (in min) 25 Mortalität während ersten 24h (n) 1

Tabelle 16: Übersicht über die Tierzahlen und Beobachtungsparameter im fokalen Pilocarpin-Modell (30µg). In der Tabelle sind die Anzahl der Tieren mit Pilocarpin-Behandlung, die Anzahl der Tiere mit generalisierter Krampfaktivität, die Anzahl der Tiere mit generalisiertem Status epilepticus (SE) und die Mortalität während der ersten 24 h des Versuchs aufgeführt. Ferner sind die Mittelwerte ± Standardfehler sowie minimale und maximale Werte der Latenzzeit zwischen Applikation und dem Auftreten generalisierter Krampfaktivität bzw. des SE dargestellt.

Beruhend auf der beobachteten Anfallsaktivität nach fokaler Kainat- bzw.

Pilocarpinapplikation und der Erfahrung der Arbeitsgruppe Löscher, dass eine überwiegend fokale Anfallsaktivität selten nach einer Latenzzeit zu spontaner Anfallsaktivität führt, wurde in der vorliegenden Arbeit auf eine Überwachung der Ratten auf spontane Anfälle verzichtet.

ERGEBNISSE 5.1.3 Pharmakologische Untersuchung in verschiedenen Epilepsie-Modellen 5.1.3.1 Selektion nach individueller Phenytoin-Empfindlichkeit im

Amygdala-Kindling Modell

Für die Untersuchung der PGP-Expression von gekindelten Phenytoin-empfindlichen (Responder) und -unempfindlichen Ratten (Nonresponder) wurden 47 Ratten gekindelt. Aus der Gruppe der 47 gekindelten Ratten wurde hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit gegenüber Phenytoin Responder (n = 7) und Nonresponder (n = 6) selektiert (s. Kap. 4.3.1). Die Selektion der gekindelten Ratten wurde von technischen Mitarbeitern des Instituts durchgeführt und wird daher nicht näher beschrieben.

5.1.3.2 Selektion nach individueller Levetiracetam-Empfindlichkeit im Post-SE-Pilocarpin-Modell

Spontan krampfende Ratten wurden in einem mehrwöchigen Versuch auf ihre Empfindlichkeit gegenüber dem Antiepileptikum Levetiracetam getestet (Glien et al.

2002). Ein Teil der Tiere (n=3) zeigte eine mehr als 50 %ige Reduktion der Anfallsfrequenz in der Behandlungsphase im Vergleich zu den beiden Kontrollphasen; sog. (Levetiracetam-) Responder. (Levetiracetam-) Nonresponder (n=3) zeigten dementsprechend keine mehr als 50 %ige Reduktion der Anfallsfrequenz. Die Einteilung in Responder und Nonresponder erfolgte gemäß der klinischen Einteilung, bei der pharmakoresistente Epilepsiepatienten unter Behandlung keine mehr als 50 %ige Reduktion der Anfallsfrequenz aufweisen (Regesta und Tanganelli 1999). Die Tiere Gl 27 und 32 konnten aufgrund der großen Variabilität der Anfallsfrequenz nicht in eine Subgruppe eingeordnet werden. Das Gehirngewebe aller Tiere wurde gewonnen und für immunhistologische Fragestellung verwendet (s. Kap. 4.5).

Die von Glien et al. (2002) klassifizierten Anfälle wurden nachträglich gemäß ihrer Krampfschwere unterteilt in nicht-konvulsive (Stadium 0 - Stadium II) und in konvulsive (Stadium III - Stadium VI) Anfälle (Tabelle 17). Die Ratte Gl 75 hatte in jeder der drei Behandlungsphasen nicht-konvulsive Anfälle. Ansonsten zeigte nur die Ratte Gl 91 einen nicht-konvulsiven Anfall in der Nachbehandlungskontrollphase.

ERGEBNISSE

Die Tiere wurden ca. drei Monate nach Versuchsende dekapitiert und für immunhistologische Untersuchungen (PGP-Expression, Morphologie, s. Kap. 4.5) verwendet.

Anzahl der spontanen Anfälle

Vorkontrollphase Behandlungsphase Nachkontrollphase Tier

nicht-konvulsiv konvulsiv

nicht-konvulsiv konvulsiv

nicht-konvulsiv konvulsiv Levetiracetam-Empfindlichkeit

Gl 27 6 1 1 ?

Gl 32 2 3 36 ?

Gl 75 5 67 48 44 9 41 Nonresponder

Gl 82 2 3 3 Nonresponder

Gl 83 0 3 3 Nonresponder

Gl 44 1 0 15 Responder

Gl 67 87 0 81 Responder

Gl 91 4 1 1 15 Responder

Tabelle 17: Anzahl der konvulsiven und nicht-konvulsiven Anfällen in der Vorkontrollphase, Behandlungsphase und Nachkontrollphase. (?=nicht klassifizierbar)

5.1.3.3 Selektion nach individueller Phenobarbital-Empfindlichkeit im Post-SE-BLA-Modell

Versuchsdesign und Auswahl der Tiere

In dieser Studie wurde die pharmakologische Wirkung des Antiepileptikums Phenobarbital auf spontane Anfälle nach SE untersucht. Als Grundlage für die Induktion eines SE war das SE-BLA-Modell (Kap. 5.1.1.2). Nach Induktion des SE konnte nach einer Latenzzeit von vier Wochen spontane Anfälle detektiert werden.

Die Tiere wurden zwölf Stunden täglich an vier aufeinander folgenden Tagen

ERGEBNISSE (Tabelle 18). 83 % der Tiere mit generalisiertem SSSE bei der elektrischen Stimulation zeigten während der Frequenzanalyse spontane Anfälle (Tabelle 18).

Ein Tier dieser Gruppe hatte während der vier Tage elf spontane Anfälle (2,75 Anfälle/d, Tabelle 18). Alle anderen Tiere zeigten in dieser Zeit nur einen Anfall (0,25 Anfälle / d, Tabelle 18).

Überwachung auf spontane Anfälle

Modell der elektrischen Stimulation der VEn

Spontane Anfälle Frequenz

Anfallstyp des SSSE Tieranzahl Anfälle / d

fokaler SSSE mit generalisierten Anfällen (n=2)

n=1 0,25

generalisierter SSSE

(n=12) n =10 0,5±0,25

0,25-2,75

Tabelle 18: Anzahl der Ratten mit den verschiedenen Typen eines selbsterhaltenen Status epilepticus (SSSE) im Modell der VEn-Stimulation, die Anzahl der Tiere, die spontane Anfälle entwickelten und die Frequenz der Anfälle werden in der Tabelle dargestellt. Die Tiere wurden 4 Tage lang überwacht.

Alle Ratten (n=11), die während der Überwachungszeit spontane Anfälle hatten, wurden für die pharmakologische Studie verwendet. Die Untersuchung gliederte sich in drei aufeinander folgende jeweils zweiwöchigen Phasen (Kap. 4.3.3.2). In der Vor- und Nachkontrollphase wurde die individuelle Grundfrequenz der spontanen Anfälle detektiert. In der dazwischenliegenden Behandlungsphase wurde die Anfallsfrequenz unter Phenobarbital-Behandlung gemessen.

Die Untersuchung der interindividuellen Sensitivität gegenüber einer Phenobarbital-Behandlung stand im Vordergrund. Die Tiere sollten ferner für

PGP-ERGEBNISSE

Blutplasmakonzentration von Phenobarbital

In der Vorkontrollphase, Behandlungsphase und Nachkontrollphase wurden die Tiere zur selben Tageszeit gespritzt, um Effekte auf die Krampfparameter in allen Phasen vergleichbar zu halten. In der Vor- und Nachkontrollphase erhielten die Ratten zweimal täglich im Abstand von zehn Stunden 0,9 % Kochsalzlösung. In der Behandlungsphase wurde den Ratten zweimal täglich im Abstand von zehn Stunden Phenobarbital verabreicht. Das Blut zur Bestimmung der Phenobarbital-Plasmakonzentration wurde am Anfang (15. Tag) und Ende (28. Tag) der Drug Phase unmittelbar vor der nächsten Injektion gewonnen. Die Plasmakonzentrationen lagen zwischen 14,04 und 37,28 µg/ml und durchschnittlich bei 25,10 ± 0,59 µg/ml (15. Tag) bzw. 27,67 ± 2,97 µg/ml (28. Tag, Abb. 16) und unterschieden sich nicht signifikant voneinander (t-Test für gepaarte Daten, p>0,05). Die Plasmakonzentrationen lagen immer im Bereich der Grenzen der therapeutisch sinnvollen Phenobarbital-Plasma-Konzentration des Menschens (10 - 40 µg/ml, Baulac 2002, Abb. 16). Bei einem Tier (DS 118) konnte aufgrund ausgeprägter Aggressivität keine Plasmaprobe für die Bestimmung der Phenobarbital-Plasma-Konzentration gewonnen werden. Für die Injektionen konnte jedoch das Tier ausreichend fixiert werden.

In der Behandlungsphase wurden Verhaltensänderungen beobachtet werden. Die Tiere, die gut auf Phenobarbital ansprachen und keine bzw. wenige Anfälle hatten, zeigten eine verminderte Erregbarkeit bei den Injektionen und erschienen in ihrem Käfig ruhiger. Bei den Tieren, die unter Behandlung weiterhin Anfallsaktivität zeigten, konnte keine Verhaltensänderung beobachtet werden.

ERGEBNISSE

Abb. 16: Phenobarbital-Konzentration im Blutplasma. Jeder Punkt entspricht einer individuellen Messung. Die Phenobarbital-Plasmakonzentration der ersten („1.“, 15. Tag) und zweiten („2.“, 28.Tag) Blutabnahme sind in µg/ml dargestellt. Die Plasmakonzentration lag immer über der unteren Grenze der therapeutisch sinnvollen Phenobarbital-Plasma-Konzentration des Menschens (10 µg/ml). Die Plasmakonzentrationen unterschieden sich nicht signifikant voneinander (t-Test für gepaarte Daten, p>0,05)

Anfälle während der Vorkontrollphase, Behandlungsphase und Nachkontrollphase

Die durchschnittliche Zahl der Anfälle betrug in den beiden Kontrollphasen (Vor- und Nachkontrollphase) 32,09 ± 18,10 bzw. 35,09 ± 20,76 pro zwei Wochen. Unter Phenobarbital-Behandlung stieg die durchschnittliche Anfallsfrequenz auf 79,64±55,68 / 2 Wochen (ANOVA, p>0,05), d.h. es konnte ein Anstieg der Anfallsfrequenz um 148 % verzeichnet werden (Abb. 17).

Individualisiert man die Daten der Behandlungsphase, fällt auf, dass sieben Tiere unter Behandlung eine mehr als 50 %ige Reduktion der Anfallsfrequenz im Vergleich zur Vorkontrollphase hatten, sog. (Phenobarbital-) Responder. Die verbleibenden vier Tiere zeigten weder keine Anfallsfreiheit noch eine Reduktion der Anfälle um mehr als 50 % in der Behandlungsphase im Vergleich zur Vorkontrollphase und wurden somit als (Phenobarbital-) Nonresponder klassifiziert (Abb. 20 und Abb. 21). Die Nachkontrollphase konnte nicht zum Vergleich herangezogen werden, da bekannt ist, dass das abrupte Absetzen von Phenobarbital nach einer chronischen

Phenobarbitalkonzentration

1. 2.

0 10 20 30 40

Plasmalevel (µg/ml)

Therapie- Bereich

ERGEBNISSE

Die Responder hatten in der Vor- bzw. Nachkontrollphase eine durchschnittliche Anzahl von 11,71 ± 2,12 bzw. 5,14 ± 1,91 Anfällen in zwei Wochen und unterschieden sich nicht signifikant voneinander (ANOVA, p<0,05; t-Test für gepaarte Daten, p>0,05, Abb. 17). In der Behandlungsphase sank die Zahl der Anfälle signifikant um mehr als 96 % auf durchschnittlich 0,29 ± 0,18 Anfällen in zwei Wochen ab (ANOVA und t-Test für gepaarte Daten, p<0,05, Abb. 17). Bei den Nonrespondern betrugen die Mittelwerte der Anfälle in den Kontrollphasen 67,75 ± 48,19 bzw. 87,50 ± 49,98 Anfälle in zwei Wochen und stiegen an auf 218,5 ± 135,4 Anfälle in zwei Wochen (ANOVA, p>0,05).

Die Anfallsanzahl der Vorkontrollphase der Nonresponder im Vergleich zu den Responder war deutlich erhöht, unterschied sich aber nicht signifikant voneinander (Mann Whitney U-Test, p>0,05). In der Nachkontrollphase war die Anfallsanzahl der Nonresponder im Vergleich zu den Respondern signifikant erhöht (Mann Whitney U-Test, p<0,05).

Abb. 17: Anzahl der spontanen Anfälle in der jeweiligen Kontrollphase (Pre- und Postdrug) und der dazwischenliegenden Behandlungsphase mit Phenobarbital (Drug). Die Mittelwerte und die Standardfehler der gesamten Gruppe (n=11), der Responder (n=7) und der Nonresponder (n=4) werden getrennt voneinander dargestellt. Die Zahl der Anfälle war bei den Respondern in der

ERGEBNISSE

Die Anfälle unterschieden sich in ihrer Krampfschwere. Die EEG-Veränderungen (Frequenz und Amplitude) waren bei fokalen und generalisierten Krämpfen vergleichbar, so dass die Krampfschwere nur bei der Auswertung der Videobänder klassifiziert werden konnte. Die Anfälle wurden in nicht-konvulsive und konvulsive Anfälle klassifiziert (Kap.4.3). Die Anfallshäufigkeit der konvulsiven und nicht-konvulsiven Anfälle in den jeweiligen Versuchsphasen und Subgruppen (Responder, Nonresponder) wird im folgenden näher beschrieben.

Bei den konvulsiven Anfällen betrug die durchschnittliche Anfallsanzahl in den beiden Kontrollphasen der gesamten Gruppe 30,55 ± 17,30 bzw. 26,18 ± 16,89 in zwei Wochen. Die durchschnittliche Anfallsfrequenz fiel unter Phenobarbital-Behandlung auf eine Anfallszahl von 25,09 ± 23,90 in zwei Wochen ab (ANOVA, p>0,05, Abb.

18). Die Subgruppe der Responder hatten dagegen in der Vor- bzw.

Nachkontrollphase eine Anzahl von 11,86 ± 2,07 bzw. 4,14 ± 2,06 Anfällen in zwei Wochen. Die Anfallszahlen in den beiden Phasen waren nicht signifikant unterschiedlich voneinander (ANOVA, p<0,05; t-Test für gepaarte Daten, p>0,05, Abb. 18). Die durchschnittliche Anfallsfrequenz sank in der Behandlungsphase signifikant um mehr als 96 % auf durchschnittlich 0,7 ± 0,57 Anfällen in zwei Wochen (ANOVA und t-Test für gepaarte Daten, p<0,05, Abb. 18). Die Nonresponder wiesen im Durchschnitt in den Kontrollphasen 63,25 ± 46,56 bzw. 64,75 ± 42,67 Anfälle in zwei Wochen und stiegen an auf 67,75 ± 65,44 Anfälle in zwei Wochen (ANOVA, p>0,05).

ERGEBNISSE

Abb. 18: Anzahl der spontanen konvulsiven Anfälle in der jeweiligen Kontrollphase (Pre- und Postdrug) und der dazwischenliegenden Behandlungsphase mit Phenobarbital (Drug). Die Mittelwerte und die Standardfehler der gesamten Gruppe (n=11), der Responder (n=7) und der Nonresponder (n=4) werden getrennt voneinander dargestellt. Aufgrund der großen Unterschiede der Anfallsfrequenz innerhalb der verschiedenen Gruppen wird die Ordinate in zwei unterschiedlich skalierten Segmenten dargestellt. Die Zahl der Anfälle war bei den Respondern in der Drug Phase im Vergleich zu den Kontrollphasen signifikant reduziert (ANOVA und t-Test für gepaarte Daten, *p<0,05).

Die Anzahl der nicht-konvulsiven Anfälle veränderte sich vor allem bei den Nonrespondern (Abb. 19 und Tabelle 19) und wird im weiteren nur für diese Subgruppe besprochen. Die Nonresponder zeigten in der Behandlungsphase eine Erhöhung der mittleren Anzahl der nicht-konvulsiven Anfälle von 3,75 ± 2,25 (Vorkontrollphase) bzw. 24,25 ± 22,29 Anfälle in zwei Wochen (Nachkontrollphase) um mindestens 516 % auf 149,5 ± 140,3 (Behandlungsphase, ANOVA, p>0,05). Die Erhöhung der durchschnittlichen Anzahl der nicht-konvulsiven Anfälle ist vor allem auf ein Tier (DS 107) zurückzuführen, das unter der Behandlung vermehrt und ausschließlich nicht konvulsive Anfälle zeigt (Abb. 20). Das Tier DS 118 hat auch in der Behandlungsphase vermehrt nicht-konvulsive Anfälle (178 %, Abb. 20).

ERGEBNISSE

Abb. 19: Anzahl der spontanen nicht-konvulsiven Anfälle in der jeweiligen Kontrollphase (Pre- und Postdrug) und der dazwischenliegenden Behandlungsphase mit Phenobarbital (Drug). Die Mittelwerte und die Standardfehler der Nonresponder (n=4) werden getrennt voneinander dargestellt.

Aufgrund der großen Unterschiede der Anfallsfrequenz innerhalb der verschiedenen Gruppen wird die Ordinate in zwei unterschiedlich skalierten Segmenten dargestellt. Die Zahl der nicht-konvulsiven Anfälle war bei den Nonrespondern in der Drug Phase im Vergleich zu den Kontrollphasen nicht signifikant erhöht (ANOVA, p>0,05).

Abb. 20: Anzahl der spontanen Anfälle in der jeweiligen Kontrollphase (Predrug und Postdrug) und der dazwischenliegenden Behandlungsphase mit Phenobarbital (Drug) für die elf Tiere des Versuchs in individueller Darstellung. Die gesamte Anzahl der Anfälle in zwei Wochen unterteilt in konvulsive und nicht-konvulsive Anfälle der Responder (n=7) und der Nonresponder (n=4) werden nebeneinander dargestellt.

ERGEBNISSE

Abb. 21: Anzahl der täglichen Anfälle in der jeweiligen Kontrollphase (Pre- und Postdrug) und der Phenobarbital-Behandlungsphase (Drug). Der Verlauf der konvulsiven und nicht-konvulsiven Anfälle pro Tag der Responder (n=7) und der Nonresponder (n=4) werden dargestellt. Die Skalen der Ordinate sind unterschiedlich.

Nur zwei Responder hatten einen nicht-konvulsiven Anfall, der bei der einen Ratten in der Vorkontrollphase und bei der anderen in der Nachbehandlungskontrollphase lag (Abb. 20, Abb. 21, Tabelle 19). Die konvulsiven Anfälle traten bei fünf der sieben Ratten vermehrt in der Vorkontrollphase auf. Es konnten wie schon beschrieben keine signifikanten Gruppenunterschiede zwischen Vor- und Nachkontrollphase gefunden werden (ANOVA, p<0,05; t-Test für gepaarte Daten, p>0,05, Abb. 20).

Die Abb. 21, in der die tägliche Krampfaktivität auf der Zeitachse des Versuchs dargestellt wird, zeigt ferner, dass die Tiere in der Responder-Gruppe nach Absetzen der Phenobarbital-Behandlung häufiger Anfallsaktivität zeigen als am Ende des

konvulsiv

ERGEBNISSE (3,71 ± 1,99 / 1 Woche) und zweiten Woche (1 ± 0,73/ 1 Woche) der Postdrug Phase unterscheiden sich nicht signifikant voneinander (t-Test für gepaarte Daten, p>0,05).

Während der Helligkeitsphase (Licht an 6:00; Licht aus 18:00 MEZ) zeigten die Ratten signifikant mehr Anfälle (Mittelwert des gesamten Versuchs: 91,91 ± 55,25 Anfälle in zwei Wochen) als in der Dunkelphase (Mittelwert des gesamten Versuchs:

62,36 ± 38,69 Anfälle in zwei Wochen), d.h. 68 % der Anfälle traten am Tag und 32

% in der Nacht auf (Tabelle 19, Wilcoxon-Test für gepaarte Daten, p<0,05). Bei den konvulsiven Anfällen konnte ein signifikanter Unterschied zwischen der Helligkeitsphase 49,09 ± 32,02 Anfälle in zwei Wochen und der Dunkelphase 36,91 ± 27,48 Anfälle in zwei Wochen beobachtet werden (Tabelle 19, Wilcoxon Test für gepaarte Daten, p<0,05). 67 % der konvulsiven Anfälle waren am Tag und 33 % in der Nacht. Bei den nicht-konvulsiven Anfällen konnte in der Helligkeitsphase durchschnittlich über den gesamten Versuch 42,82 ± 41,05 Anfälle in zwei Wochen (59 % der Anfälle) und in der Dunkelphase 25,45 ± 22,77 Anfälle in zwei Wochen (41

% der Anfälle) festgestellt werden (Tabelle 19, Wilcoxon-Test für gepaarte Daten, p>0,05).

Tabelle 19: Anzahl der konvulsiven und nicht-konvulsiven Anfälle in der Helligkeits- und Dunkelphase. Einzel- und Mittelwerte von elf Ratten während der jeweils zweiwöchigen Vorbehandlungskontrollphase, Drug und Postdrug Phase sowie der Helligkeits- und Dunkelphase sind dargestellt. Die Mittelwerte werden für die gesamte Gruppe, Responder und

Spontane Anfälle

Vorbehandlungskontrollphase Phase Drug Phase Post Drug

nicht konvulsiv konvulsiv nicht konvulsiv konvulsiv nicht konvulsiv konvulsiv Tier hell dunkel hell dunkel hell dunkel hell dunkel hell dunkel hell dunkel

Responder

DS 104 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 1 1

DS 108 0 0 7 8 0 0 0 0 0 0 5 11

DS 109 0 0 10 2 0 0 0 0 0 0 1 1

DS 115 0 0 16 2 0 0 0 0 0 1 0 1

DS 116 0 0 10 0 0 0 0 0 0 0 1 1

DS 117 0 0 15 2 0 0 1 0 0 0 5 0

DS 119 1 0 1 2 0 0 0 0 0 0 2 3

Mittelwert 0,14 0 9,57 2,29 0 0 0,14 0 0 0,14 2,14 2,57

Nonresponder

DS 107 2 6 30 20 364 208 0 0 87 38 49 38

DS 110 0 0 1 2 0 0 4 3 0 0 3 1

DS 113 0 0 2 0 0 1 0 0 0 0 5 1

DS 118 3 6 111 110 11 14 131 91 3 6 121 106

Mittelwert 1,3 3 36 33 93,8 55,75 33,8 23,5 23 11 44,5 36,5

Mittelwert (gesamt) 0,55 1,09 19,18 13,45 34,09 20,27 12,36 8,55 8,18 4,09 17,55 14,91

ERGEBNISSE Krampfdauer während der Vorkontrollphase, Behandlungsphase und Nachkontrollphase

Die Krampfdauer wurde bei der Video-Auswertung der Anfälle bestimmt. Die Länge der nicht-konvulsiven Anfälle konnte in der Videoaufnahme aufgrund der Auflösung des Videobildes nicht sicher bestimmt werden und wird deshalb nicht mit in die Berechnung der mittleren Krampfdauer einbezogen. Die Krampfdauer der Vor- und der Nachkontrollphase der gesamten Gruppe (67,17 ± 13,32 s und 53,93 ± 6,82 s), der Responder (75,01 ± 27,95 s und 56,35 ± 10,19 s) und der Nonresponder (59,33 ± 2,54 s und 50,31 ± 9,03 s) unterschied sich nicht signifikant voneinander (gepaarter t-Test, p>0,05). In der Behandlungsphase hatten die Tiere DS 107 und DS 113 ausschließlich nicht-konvulsive Anfälle, bei denen wie schon erwähnt die Krampfdauer im Videobild nicht sicher bestimmt werden konnte. Es lagen somit nur zwei Werte bei den Nonrespondern (DS 118 und DS 110) vor, so dass hier keine statistische Aussage getroffen werden kann. Bei den Nonrespondern nahm die Krampfdauer in der Behandlungsphase (46,12 ± 2,56 s) im Mittel um 24 % im Vergleich zu den Kontrollphasen (59,33 ± 2,54 s und 50,31 ± 9,03 s) ab.

5.2 MRP2-LOKALISATION UND EXPRESSION IM GEHIRN

Als Positivkontrolle für den immunhistologischen Nachweis von MRP2 wurde die Leber verwendet. Der Nachweis von MRP2 in der Leber erfolgte mit dem monoklonalen Antikörper M2III-6 (Abb. 22). Bild „B“ der Abb. 22 zeigt den Nachweis von MRP2 in der canaliculären Membran der Leberzellen. Als Negativkontrolle wurde die Leber von MRP2-defizienten TR^--Ratten (transporter-negative Ratte) verwendet (Abb. 22). Der TR^--Ratte fehlt aufgrund eines natürlichen Gendefektes eine funktionelle Form von MRP2 (Paulusma et al. 1996).

Das Gehirngewebe stammte von Tieren, bei denen ein SE im SE-Kainat-Modell bzw.

im SE-Pilocarpin-Modell erzeugt wurde, und von Kontrolltieren dieser Versuche. Zum Nachweis der Lokalisation von MRP2 im Gehirn wurden verschiedene Gewebegewinnungs-, Aufarbeitungsmethoden und immunhistologische Protokolle verwendet (Kap. 4.5.4.4). Der monoklonale Antikörper M2III-6 und der polyklonale

ERGEBNISSE

Antikörperkonzentrationen, Inkubationszeiten und Inkubationstemperaturen wurden an Kryostatschnitten, Gefrierschnitten und Vibratomschnitten getestet. An Kryostatschnitten wurde auch die Detektion mittels Immunfluoreszenz erprobt. Im Gehirn konnte MRP2 mit keinem der zwei verwendeten Antikörper bei den verschiedenen Fixierungs- und Schneidemethoden nachgewiesen werden.

Abb. 22: PGP-Expression in der Leber einer MRP2 defizienten Ratte und einer Ratte des Hintergrundstammes. „A” bzw. „B“ zeigt die Leber einer MRP2 defizienten Ratte bzw. einer Ratte des Hintergrundstammes. Der Antikörper M2III-6 wurde an 40 µm dicken Gefrierschnitten verwendet. Die PGP-markierten Bereiche sind durch Pfeile gekennzeichnet.

5.3 PGP-LOKALISATION UND EXPRESSION IM GEHIRN

Die vorgestellten Tiermodelle wurden für die Untersuchung der PGP-Lokalisation und –Expression verwendet. Als erstes wird die Lokalisation von PGP unter Kontrollbedingungen beschrieben (Kap. 5.3.1), um dann in den nachfolgenden Kapitel auf die Veränderung der Lokalisation (Kap. 5.3.2) und der endothelialen bzw.

astrozytären Expressionsmuster (Kap. 5.3.4 bzw. Kap. 5.3.3) nach Anfällen näher einzugehen.

5.3.1 PGP-Lokalisation im Gehirn von Kontrolltieren

In unserer Arbeitsgruppe konnte im Gegensatz zu Zhang et al. (1999), PGP bisher

In unserer Arbeitsgruppe konnte im Gegensatz zu Zhang et al. (1999), PGP bisher

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