4.9 A NHANG
4.9.1 G ERÄTE FÜR DIE EEG- UND V IDEOÜBERWACHUNG
Geräte Typ-Bezeichnung Bezugsquelle
Stabilisierte Netzgeräte 2224.0 Straton Gerätetechnik GmbH
Verstärker CyberAmp 380
Bioamplifier
Axon Instruments, Inc. Foster City, CA Digitalwandler PowerLab/800s
Programm: Chart4 for Windows
ADInstruments Ltd, Hastings, East Sussex, UK
Multiplexer Monacor TVMP-400 B/W Elektronik Menzel, Hannover
Personal Computer
Intel Pentium-IV Prozessor mit 1000 MHz 256 MB Arbeitsspeicher
Langzeitvideorecorder Sanyo RS232C/RS485 Control Elektronik Menzel, Hannover
Fernseher (Auswertung)
Mitsubishi EUM-1491A
Videokassetten Kodak HS E-240 Aldi
EEG-Kabel Kabelentzwirler einschließlich:
Anschlußkabel / Westernbuchse
MATERIAL UND METHODEN 4.9.2 Protokolle für die histologischen Methoden
TESPA-Beschichtung der Objektträger (unter dem Abzug)
• Methanol/ Azeton ( 1+1 ) 15-30 min.
• trocknen lassen
• TESPA(3-aminopropyl-triethoxysilane) 2%ig in Azeton 15-20 s
• Azeton 2x waschen
• DEPC-H2O 2x waschen
• bei 37°C trocknen
• staubfrei lagern
Thionin-Färbung:
• 3 min in 100 % Alkohol
• 3 min in 95 %.Alkohol
• 3 min in 70 % Alkohol
• 3 min in 50 % Alkohol
• 3 min in aqua dest.
• 75 s –90 s in Thionin
• 3 min in 50 % Alkohol
• 3 min in 70 % Alkohol
• 3 min in 95 % Alkohol
• 3 min in 100 % Alkohol
• 3 min in Terpinol/Xylol-Ersatzmedium 1:1
• 3 min in Xylol-Ersatzmedium
• 3 min in frisches Xylol-Ersatzmedium
• mit Entellan eindecken
Immunhistochemischer Nachweis mit dem Kaninchen-System (Standard) Färbeküvette:
• Schnitte bei -20° C kurz lagern
• 10 min bei –20° C in Azeton fixieren
• 3 x in Tris-gepufferter 0,9% NaCl Lsg. (TBS, pH 7,6) waschen, je Waschgang 5 min
• 30 min in 0,5 % H O (verdünnt in TBS) inkubieren
MATERIAL UND METHODEN
• Einspannen in Immunhisto-Apparatur Immunhisto-Apparatur:
• 60 min in „block solution“ bei Raumtemperatur inkubieren
• über Nacht h in prim. Antikörper ( verdünnt in „carrier solution“) inkubieren bei 4°C
• 3 x in TBS waschen, je Waschgang 5 min.
• 90 min in 1:500 sek. Antikörper (biotinilierter Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper / verdünnt in „carrier solution“) bei Raumtemperatur inkubieren
• 2x in TBS waschen, je Waschgang 5 min.
• 90 min in Streptavidin, HRP konjugiert ([Str] 1:375 -> 2,67 µl auf 1 ml TBS) auf dem Rüttler bei Raumtemperatur inkubieren
• 3 x mit TBS waschen Färbeküvette:
• 1 x in TBS waschen, je Waschgang 5 min.
• 15 min mit 3,3’-Diaminobenzidin – Lösung (DAB) vorinkubieren
• 0,25 µl H2O2 pro 1 ml DAB-Lösung (Endkonz.: 0,01 % H2O2 ) zugeben und 15 min reagieren; auf dem Schüttler
• 3 x in TBS waschen, je Waschgang 5 min.
Immunhistochemischer Nachweis mit dem Schweine-System (Standard) Färbeküvette:
• Schnitte bei -20° C kurz lagern
• 10 min bei –20° C in Azeton fixieren
• 3 x in TBS waschen, je Waschgang 5 min
• 30 min in 0,5 % H2O2 (verdünnt in TBS) inkubieren
• 3 x in TBS waschen, je Waschgang 5 min (Spülen bis keine Luftblasen mehr vorhanden sind).
• Einspannen in Immunhisto-Apparatur Immunhisto-Apparatur:
• 60 min in „block solution“ bei RT inkubieren
• über Nacht h prim. Antikörper ( verdünnt in „carrier solution“) inkubieren bei 4°C
• 3 x in TBS waschen, je Waschgang 5 min.
• 90 min in 1:500 sek. Antikörper (biotinilierter Schwein-Anti-Kaninchen-Antikörper / verdünnt in „carrier solution“) bei RT inkubieren
• 2 x in TBS waschen, je Waschgang 5 min.
• 90 min in Streptavidin, Meerretichperoxidase (HRP [Str] konjugiert 1:375 in TBS) auf dem Rüttler bei Raumtemperatur inkubieren
• 3 x mit TBS waschen
MATERIAL UND METHODEN Färbeküvette:
• 1 x in TBS waschen, je Waschgang 5 min.
• 15 min mit 3,3’-Diaminobenzidin – Lösung (DAB) vorinkubieren
• 0,25 µl H2O2 pro 1 ml DAB-Lösung (Endkonz.: 0,01 % H2O2 ) zugeben und 15 min reagieren; auf dem Schüttler
• 3 x in TBS waschen, je Waschgang 5 min.
Lösungen:
Carrier solution
• 100 ml Tris. gepufferte 0,9 % NaCl-Lösung (pH 7,6)[TBS]
• 1 ml Kaninchen- oder Schweine-Serum
• 1 g Rinderserumalbumin (BSA)
• 1,5 ml 20 % Triton X-100 Blocking solution
• 4,5 ml carrier solution
• 0,5 ml Kaninchen- oder Schweine-Serum
• 100 mg BSA TBS
• 9g NaCl in 1l 50 mM Tris-Lsg. (pH 7,6)
DAB-Lsg.
• 30 µl Ansatz (entspricht 3,3 mg 3,3’-DAB)
• 4 ml TBS/Ni-Lösung
• 40 µl Imidazol-Lsg Tris/Ni – Lsg.
• 0,3 g Nickelammoniumsulfat
• 50 ml TBS
Verwendete Puffer- und sonstige Lösungen 0,4 M Phosphatpuffer (Stammlösung)
• in Aqua dest.
• 5,7 % Na2HPO4
• 1,2 % NaH2PO4
• mit 1 M NaOH auf pH 7,4 einstellen
MATERIAL UND METHODEN
• 0,9 % NaCl
• 0,01 M Phosphatpuffer
• mit HCl auf pH 7,6 einstellen
4 % Paraformaldehyd
• 8 % Paraformaldehyd
• in Aqua dest.
• auf 60 – 70 °C erhitzen
• abkühlen lassen
• mit 1 M NaOH Lösung klären
• filtrieren
• mit 0,2 M Phosphatpuffer auf 4 %ige Lösung verdünnen
4% Paraformaldehyd mit Pikrinsäure und Glutardialdehyd
• 500 ml Phosphatpuffer (0,2 M, pH = 7,4) auf 60 °C erhitzen
• 40 g Paraformaldehyd hinzugeben und durch Zugabe von etwa 150 µl 10 N NAOH Flüssigkeit aufklaren; !!pH-Wert!!!!
• Abkühlen auf Raumtemperatur
• Zugabe von 2 ml Glutardialdehyd (25 %)
• 166,5 ml gesättigten Pikrinsäure (1,2 %) zugeben
• Fixans filtern und auf 1 l mit Aqua bidest. auffüllen
• pH-Wert auf 7,4 einstellen!!!!
0,05 M Tris gepufferte Saline (TBS)
• 0,9% NaCl
• 0,05 M Tris[hydroxymethyl]-aminomethan
• mit HCl auf pH 7,6 einstellen
MATERIAL UND METHODEN 4.9.2.1 Substanzen
Substanz Bezugsquelle
Ammonium Nickel Sulfat Hexahydrat Fluka Chemie AG, Buchs
Azeton Roth, Karlsruhe
Bovines Serum-Albumin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Chloralhydrat E. Merck AG, Darmstadt
Chloramphenicol Succinate Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Chrom III-Kaliumsulfat Dodecahydrat E. Merck AG, Darmstadt
DEPC Roth, Karlsruhe
3,3 Diaminobenzidin (DAB) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Diazepam (Diazepam-Ratiopharm) Ratiopharm, Ulm
EDTA (Ethylendiaminetetraacetic-Acid) E. Merck AG, Darmstadt Entellan-Eindeckmittel E. Merck AG, Darmstadt Essigsäure 99,8% Riedel de Häen Ethacridinlactat (Rivanol) Chinosol, Hannover Ethanol 99,8% Riedel de Häen Ethanol vergällt Euro Alkohol, Hannover
Formaldehyd Roth, Karlsruhe
Gelatine, gepulvert E. Merck AG, Darmstadt Gentamicin (Friseo-Gent) Essex Tierarznei, München
Glutardialdehyd Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Kainat Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Kaninchen-Antikörper GFAP DAKO, Hamburg Kaninchen-Antikörper GLUT-1 Chemicon, Hofheim Kaninchen-Antikörper H17 Santa Cruz, USA Kaninchen-Antikörper H241 Santa Cruz, USA
Kaninchen-Antikörper MDR1ab Oncogene Research Products, USA Kaninchen-Anti-Maus Antikörper,
biotinyliert DAKO, Hamburg
Kunststoff, Kaltpolymerisat (Paladur) Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim Levetiracetam UCB Pharma, Braine-l’Alleud, Belgien
MATERIAL UND METHODEN
Substanz Bezugsquelle
Maus-Antikörper C219 Calbiochem, Bad Soden
Maus-Antikörper M2III-6 Alexis-Corporation
Maus-Antikörper NeuN Chemicon, Hofheim
Mdr-Peptid (MDR1) Oncogene Research Products, USA Methylscopolaminbromid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Natrium-Cacodylat E. Merck AG, Darmstadt
Natrium-Chlorid-Lösung (isoton) Delta-Pharma, Pfullingen
Paraformaldehyd Riedel de Häen, Hannover
Pikrinsäure Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Pilocarpinhydrochlorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Pheyntoin (Diphenylhydantoin) Aldrich-Chemie, Steinheim
Phenobarbital Serva, Heidelberg
Rinderserumalbumin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Schwein-Anti-Kaninchen Antikörper,
biotinyliert DAKO, Hamburg
Serum (Ziege, Schwein, Kaninchen) DAKO, Hamburg
Streptavidin-CY3 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Streptavidin-Meerettichperoxidase
Thionin
Dianova GmbH, Hamburg
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Terpineol Roth, Karlsruhe
TESPA(3-aminopropyl-triethoxysilane) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Tissue Freezing Medium Jung, Nussloch
Toluol E. Merck AG, Darmstadt
Tris[hydroxymethyl]-aminomethan Biomol Feinchemikalien, Hamburg Triton X – 100 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Wasserstoffperoxid Riedel de Häen, Hannover
Xylol-Ersatz-Medium (Rotihistol) Roth, Karlsruhe Ziege-Anti-Kaninchen Antikörper, CY2
markiert
Jackson Immunoresearch Lab., USA Ziege-Anti-Maus Antikörper, biotinyliert DAKO, Hamburg
ERGEBNISSE
5 E RGEBNISSE
5.1 TIERMODELLE
5.1.1 Elektrische Epilepsiemodelle 5.1.1.1 Amygdala-Kindling Modell
Im Kindling-Modell wurden zehn generalisierte Anfälle des Stadiums V (Kap. 4.1.4) ausgelöst. Acht Stunden nach dem zehnten gekindelten generalisierten Anfall wurden die Tiere getötet, um zum einen die PGP-Expression in Endothelzellen der Gefäße (Kap. 5.3.4.1) und zum anderen die PGP-Expression in Astrozyten (Kap.
5.3.3) zu bestimmen.
Für die Untersuchung der PGP-Expression in Endothelzellen der Gefäße wurden acht Ratten gekindelt und sieben Ratten dienten als elektrodenimplantierte nicht-gekindelte Kontrollen, sog. Sham-Ratten.
Es waren durchschnittlich 6,38 ± 0,18 Stimulationen erforderlich, bis sie einen generalisierten Anfall des Stadiums V, und 16,38 ± 0,18 Stimulationen, bis sie zehn aufeinander folgende generalisierte Anfälle des Stadiums V hatten.
Acht Stunden nach dem letzten gekindelten generalisierten Anfall wurden die Sham-Ratten zusammen mit den gekindelten Tieren dekapitiert und für die Bestimmung der PGP-Expression in Gefäßen immunhistologisch aufgearbeitet (Kap. 4.5). Die Ergebnisse dieser Expressionsstudie sind im Kap. 5.3.3.1 und im Kap. 5.3.4.1 beschrieben.
Zur Untersuchung der PGP-Expression in Astrozyten acht Stunden nach einem generalisierten Anfall diente eine weitere Gruppe von gekindelten Ratten (n = 10) und von Sham-Ratten (n = 7). Die gekindelten Tiere wurden im Durchschnitt 5,80 ± 1,07 mal elektrisch stimuliert bis sie einen generalisierten Anfall des Stadiums V hatten. Zehn aufeinanderfolgende generalisierte Anfälle des Stadiums V erreichten sie nach 16.90 ± 1,03 Stimulationen.
ERGEBNISSE
für die PGP-Expressionsuntersuchung (s. Kap. 4.5) aufgearbeitet. Die Ergebnisse für diese Untersuchung werden im Kap. 5.3.2.3 und im Kap. 5.3.3 dargestellt.
5.1.1.2 SE-BLA-Modell
Für das Auslösen eines selbsterhaltenden Status epilepticus (SSSE) durch elektrische Stimulation des ventralen endopiriformen Nucleus (VEn) wurden weibliche Sprague-Dawley Ratten (n=14) verwendet. Grundsätzlich sind drei Formen eines SSSE zu unterscheiden (Brandt et al. 2003). Diese drei sind ein rein fokaler SE, ein fokaler SE mit einzelnen generalisierten Anfällen oder ein rein generalisierter SE (Kap. 4.1.5).
Im Rahmen dieser Arbeit wurden keine rein fokale SSSE beobachtet. Vierzehn Prozent der Tiere zeigten einen fokalen SE mit generalisierten Anfällen und 86%
einen generalisierten SE. Es konnte keine Mortalität verzeichnet werden (Tabelle 10).
Die Tiere wurden ca. vier Wochen später auf spontane Krampfaktivität überwacht (Post-SE-BLA-Modell, Kap. 4.4).
SE-BLA-Modell
♀ Sprague-Dawley Anfallstyp des SSSE Tieranzahl
fokaler SSSE n = 0
fokaler SSSE mit
generalisierten Anfällen n = 2 generalisierter SSSE n = 12
Tabelle 10: Anzahl der Ratten mit den verschiedenen Typen eines Status epilepticus (SE) im SE-BLA-Modell.
ERGEBNISSE
5.1.2 Chemische Epilepsie-Modelle
Die chemischen Epilepsie-Modelle das SE-Kainat-Modell und das SE-Pilocarpin-Modell wurden für Lokalisations- und Expressionsuntersuchungen der Multidrug-Transporter P-Glykoprotein (PGP, ABCB1) und Multidrug-resistance Protein 2 (MRP2, ABCC2) verwendet.
Ferner wurde zur Etablierung eines neuen Tiermodells für Temporallappenepilepsie (TLE) Vorversuche durchgeführt, bei denen Ratten fokal die Chemokonvulsiva Kainat oder Pilocarpin in die rechte BLA injiziert wurde.
5.1.2.1 SE-Kainat-Modell
Zur Erzeugung eines selbsterhaltenden Status epilepticus (SE) wurden 13 Ratten mit Kainsäure gemäß des beschriebenen Protokolls (Kap. 4.2.2) behandelt. Sieben Ratten dienten als Kontrolle.
Nach der Applikation von Kainsäure zeigten die Ratten zunächst sog. „wet dog shakes“ und fokale Anfälle (Stadium I - III, Kap. 4.2.3). Als „wet dog shakes“
bezeichnet man ein sich wiederholtes Schütteln des ganzen Körpers, das an das Schütteln eines nassen Hundes erinnert. Im weiteren Verlauf kam es bei allen Ratten (100%, Tabelle 11) zu einer sekundären Generalisierung der fokalen Anfälle, bis die generalisierte Krampfaktivität ununterbrochen zu beobachten war. Dies erfolgte nach im Mittel 87,77 ± 6,16 min nach der Applikation (Tabelle 11). Bei allen 13 Tieren ging nach einer mittleren Latenzzeit von 124,1 ± 5,75 min das Krampfgeschehen in einen SE über. Die Mortalität der Ratten während des SE lag bei 38 %. Die fünf Tiere, die während des SE gestorben sind, hatten durchschnittlich 3,75 ± 0,48 Anfälle bzw. eine Latenzzeit von 130,3 ± 13,22 min bis zum Beginn des SE und unterschieden sich nicht signifikant von den Beobachtungsparametern der acht nicht verendeten Tiere (3,22 ± 0,52 bzw. 123,4 ± 6,74 min, Student´s t-Test, p>0,05). Während der ersten 24 h nach Beendigung des SE traten keine weiteren Todesfälle ein.
ERGEBNISSE
Der SE wurde nach 90 min mit Diazepam unterbrochen. 24 h nach Beendigung des SE wurden die Tiere zusammen mit den Kontrolltieren perfundiert und es wurden Vibratomschnitte angefertigt. Die Vibratomschnitte dienten zur Lokalisationsuntersuchung von PGP im Gehirn (Kap. 5.3.1.3, Kap. 5.3.2.3, Kap.
5.3.3) und zur Untersuchung der PGP-Expression in Astrozyten.
SE-Kainat-Modell
Parameter Werte
Anzahl der Tiere mit Kainsäurebehandlung (n) 13 Anzahl der Tiere mit generalisierter
Krampfaktivität (n) 13
Anzahl der Tiere mit SE (n) 13
Mortalität während SE (n) 5
Beginn generalisierter Krampfaktivität nach Applikation (in min)
87,77 ± 6,16 [63-125]
Anzahl generalisierter Anfälle bis zum SE 3,39 ± 0,38 [1-6]
Beginn SE nach Applikation (in min) 124,1 ± 5,75 [91-147]
Tabelle 11: Übersicht über die Tierzahlen und Beobachtungsparameter im SE-Kainat-Modell. In der Tabelle sind die Anzahl von Tieren mit Kainsäurebehandlung, die Anzahl der Tiere mit generalisierter Krampfaktivität, die Anzahl der Tiere mit Status epilepticus (SE) und die Mortalität während des Versuchs aufgeführt. Ferner sind die Mittelwerte ± Standardfehler sowie minimale und maximale Werte der Latenzzeit zwischen Applikation und dem Auftreten generalisierter Krampfaktivität, der Anzahl generalisierter Anfälle bis zum Beginn eines SE und die Latenzzeit zwischen Applikation und Beginn des SE dargestellt.
Für die Untersuchung der PGP-Lokalisation an Gefrierschnitten (Kap. 5.3.1.2, Kap.
5.3.2.2) wurden zusätzlich zwei Tiere 24 h nach SE und zwei Kontrolltiere
ERGEBNISSE
Für die Etablierung der automatischen computer-gestützten Auswertmethode der PGP-Expression wurden ferner vorliegende Gehirnschnitte eines Kainsäure-Versuches verwendet, der von Seegers et al. (2002b) durchgeführt wurde.
5.1.2.2 SE-Pilocarpin-Modell
Für die Untersuchung des Einflusses von einem verlängerten Krampfgeschehen auf die PGP-Expression und –Lokalisation im Gehirn wurde das SE-Pilocarpin-Modell (fraktioniertes Lithium-Pilocarpin-Modell, Glien et al 2002) gewählt (Kap. 4.2.4). Im Vergleich zu dem unter Kap. 5.1.2.3 beschriebenen Versuch sollte hier untersucht werden, ob die dort gefundenen Veränderungen der PGP-Expression und – Lokalisation (Kap. 5.3.2.1) nur von transienter Natur sind.
Die fraktionierte Applikation von Pilocarpin nach einer Vorbehandlung mit Lithiumchlorid (Kap.4.2.4) führte bei drei von zehn Tieren zu einem SE (Tabelle 12).
Erst nach der zweiten Applikation von Pilocarpin zeigten die ersten Ratten einzelne fokale Anfälle. Nach der dritten Injektion von Pilocarpin begann die erste Ratte generalisierte Krampfaktivität zu entwickeln (Tabelle 12). Nach zwei einzelnen generalisierten Anfällen gingen diese über in eine kontinuierliche generalisierte Krampfaktivität. Die anderen zwei Ratten entwickelten einzelne generalisierte Anfälle und einen SE erst nach der vierten Pilocarpin-Applikation (Tabelle 12). Alle Tiere überlebten den SE.
Die drei Tiere mit SE wurden mit zwei Kontrollratten eine Woche nach SE dekapitiert und für die immunhistologische Untersuchung von PGP verwendet (Kap. 4.5).
ERGEBNISSE
SE-Pilocarpin-Modell
Parameter Pilocarpin
Anzahl der Tiere im Versuch (n) 10
Anzahl der Tiere mit generalisierter
Krampfaktivität (n) 3
Anzahl der Tiere mit SE nach 1. Applikation (n) 0 Anzahl der Tiere mit SE nach 2. Applikation (n) 0 Anzahl der Tiere mit SE nach 3. Applikation (n) 1 Anzahl der Tiere mit SE nach 4. Applikation (n) 2 Gesamtanzahl der Tiere mit SE (n) 3 Beginn generalisierter Krampfaktivität nach
Applikation (in min)
118,7 ± 5,46 [108-126]
Beginn SE nach Applikation (in min) 122,3 ± 4,26 [114-128]
Tabelle 12: Übersicht über die Tierzahlen und Beobachtungsparameter im SE-Pilocarpin-Modell. In der Tabelle sind die Anzahl von Tieren mit Pilocarpin-Behandlung, die Anzahl der Tiere mit generalisierter Krampfaktivität, die Anzahl der Tiere mit SE nach 1.-4. Applikation von Pilocarpin und die Gesamtanzahl der Tiere mit Status epilepticus (SE) aufgeführt. Ferner sind die Mittelwerte ± Standardfehler sowie minimale und maximale Werte der Latenzzeit zwischen Applikation und dem Auftreten generalisierter Krampfaktivität und die Latenzzeit zwischen Applikation und Beginn des SE abgebildet.
5.1.2.3 SE-Pilocarpin-Modell mit Phenytoin Vorbehandlung
Zur Untersuchung des Einflusses einer verlängerten Krampfaktivität und einer Kombination von Pharmakotherapie und langanhaltender Krampfaktivität auf die PGP-Expression im Gehirn wurde das SE-Pilocarpin-Modell (fraktionierte Lithium-Pilocarpin-Modell, Glien et al. 2002) kombiniert mit einer subchronischen Therapie mit dem Antiepileptikum Phenytoin gewählt (Kap. 4.2.4, Kap. 4.2.5). Phenytoin wurde als Antiepileptikum ausgesucht, da dieses die Krampfaktivität im
Lithium-Pilocarpin-ERGEBNISSE
Drei Versuchsgruppen wurden gebildet. Die erste Gruppe erhielt vor der fraktionierten Pilocarpin-Applikation eine subchronische Phenytoinbehandlung (n = 12, Pilocarpin-Phenytoin-Gruppe). Die zweite Gruppe bekam kein Phenytoin vor der SE-Induktion (n = 12, Pilocarpin-Gruppe). Und schließlich erhielt eine Gruppe von Kontrolltieren (n = 7, Kontrollgruppe) weder Phenytoin noch Pilocarpin.
Die fraktionierte Applikation von Pilocarpin nach einer Vorbehandlung mit Lithiumchlorid (Kap. 4.2.5) führte bei 75 % der Tiere der Pilocarpin-Gruppe und bei 83 % der Pilocarpin-Phenytoin-Gruppe zu einem SE (Tabelle 13). Schon kurz nach der ersten Applikation von Pilocarpin zeigten die ersten Ratten beider Gruppen einzelne fokale Anfälle. Im weiteren Verlauf traten isolierte generalisierte Anfälle auf, bis eine generalisierte Krampfaktivität kontinuierlich zu beobachten war. Ratten, die keinen generalisierten SE entwickelten, zeigten in der Regel entweder gar keine Krampfaktivität oder nur fokale Anfälle, die aber nicht sekundär generalisierten. In der Pilocarpin-Gruppe begann der SE bei 11 % der Tiere nach der ersten, bei 33 % jeweils nach der zweiten und dritten und bei 22 % nach der vierten Applikation (Tabelle 13). In der Pilocarpin-Phenytoin-Gruppe verhielt es sich ähnlich: 10 % der Tiere bekamen einen SE nach der ersten Applikation, 30 % nach der zweiten, 40 % nach der dritten und 20 % nach der vierten Injektion (Tabelle 13). Die Mortalität innerhalb der ersten 24 h nach dem pilocarpin-induzierten SE betrug in der Pilocarpin-Gruppe 11 % und in der Pilocarpin-Phenytoin-Gruppe 10 % (Tabelle 13).
ERGEBNISSE
SE-Pilocarpin-Modell mit Phenytoin Vorbehandlung
Parameter Pilocarpin Pilocarpin +
Phenytoin
Anzahl der Tiere im Versuch (n) 12 12
Anzahl der Tiere mit generalisierter
Krampfaktivität (n) 9 10
Beginn generalisierter Krampfaktivität nach Applikation (min)
55,33±9,5 [15-96]
58,00±8,29 [18-93]
Beginn SE nach Applikation (min) 62,78±10,44 [20-105]
66,10±8,39 [28-110]
Mortalität während 24 h nach SE 1 1
Tabelle 13: Übersicht über die Tierzahlen und Beobachtungsparameter im SE-Pilocarpin-Modell. Die Gruppe der Pilocarpin- und der Phenytoin-Pilocarpin-behandelten Tiere sind hier getrennt voneinander dargestellt. In der Tabelle sind die Anzahl von Tieren mit Pilocarpin- bzw.
mit Pilocarpin und Phenytoin-Behandlung, die Anzahl der Tiere mit generalisierter Krampfaktivität, die Anzahl der Tiere mit SE nach 1.-4. Applikation von Pilocarpin, Gesamtanzahl der Tiere mit SE und die Mortalität während des Versuchs aufgeführt. Ferner sind die Mittelwerte ± Standardfehler sowie minimale und maximale Werte der Latenzzeit zwischen Applikation und dem Auftreten generalisierter Krampfaktivität und die Latenzzeit zwischen Applikation und Beginn des SE abgebildet.
Bei allen Tieren wurde täglich in den drei Tagen vor der Induktion des SE und am Ende des SE vor Applikation von Diazepam die rektale Körpertemperatur gemessen.
Die Erfassung der Körperkerntemperatur erfolgte vor und 30 min nach jeder
ERGEBNISSE der Pilocarpin-Phenytoin-Gruppe nach der ersten Phenytoin-Applikation (75 mg/kg) von durchschnittlich 38,13 ± 0,08 °C auf 34,38 ± 0,76 °C, nach der zweiten Applikation (50 mg/kg) von 38,12 ± 0,9 °C auf 35,53 ± 0,38 °C, nach der dritten Applikation (50 mg/kg) von 38,12 ± 0,13 °C auf 35,01 ± 0,37 °C und nach der vierten Applikation (30 mg/kg) von 38,24 ± 0,07 °C auf 36,36 ± 0,12°C (Abb. 12). Alle Tiere zeigten 30 min nach jeder Phenytoin-Injektion einen Temperaturabfall. Dieser war bei der Pilocarpin-Gruppe und der Kontrollgruppe nicht vorhanden und kann daher mit hoher Wahrscheinlichkeit auf die Nebenwirkung von Phenytoin zurückgeführt werden.
Abb. 12: Veränderung der rektalen Körpertemperatur nach der Phenytoin-Dosierung.
Dargestellt ist die Körperkerntemperatur der Tiere der Pilocarpin-Phenytoin-Gruppe vor und 30 min nach jeder Phenytoin-Applikation. Der Temperaturrückgang ist eine Nebenwirkung von Phenytoin und dient hier als Kontrolle der erfolgreichen Verabreichung der Substanz. Statistik:
gepaarter Student´s t-Test, *p<0,05
Die Körperkerntemperatur vor und 30 min nach Phenytoin-Applikation fiel desweiteren signifikant ab bei ansteigender Phenytoinkonzentration. In Abb. 12 ist die Körpertemperaturdifferenz vor und 30 min nach Phenytoinkonzentration bei den drei verschiedenen Dosierungen abgebildet. Der Temperaturabfall bei der Phenytoin-Dosierung 75 mg/kg war am größten und ist signifikant unterschiedlich von den beiden anderen Dosierungen (Abb. 12, einfaktorieller ANOVA und Bonferroni’s t-Test, *p<0,05). Ferner ist die Temperaturdifferenz zwischen der Dosis 50 mg/kg gegenüber der niedrigsten Dosis (30mg/kg) signifikant erhöht.
ERGEBNISSE
Abb. 13: Veränderung der rektalen Körpertemperaturdifferenz bei unterschiedlicher Phenytoin-Dosierung. In der Abbildung ist die Differenz der Körperkerntemperatur vor und 30 min nach Phenytoin-Applikation mit unterschiedlichen Dosierungen (75mg/kg, 50 mg/kg, 30 mg/kg) an den 4 Tagen der Behandlung dargestellt. Statistik: einfaktorieller ANOVA und Bonferroni’s t-Test, *p<0,05
Dreißig Minuten vor der fraktionierten Pilocarpin-Applikation eine Blutentnahme für die Phenytoin-Plasmakonzentrationsbestimmung (Kap. 4.3.2) durchgeführt. Alle Tiere der Pilocarpin-Phenytoin-Gruppe hatten eine Phenytoin-Plasmakonzentration über dem therapeutisch wirksamen Bereich von 20 µg/ml (Abb. 14). Die Phenytoin-Plasmakonzentrationen lagen zwischen 20,17 µg/ml und 27,13 µg/ml und hatten einen Mittelwert 23,57 ± 0,72 µg/ml.
Abb. 14: Phenytoin-Plasmakonzentration bei der Pilocarpin-Phenytoin-Gruppe. Jeder Punkt enstpricht einer individuellen Messung. Die Abbildung zeigt die Plasmakonzentration von Phenytoin bei den Tieren der Pilocarpin-Phenytoin-Gruppe.
Control 0
5 10 15 20 25 30
Plasmalevel (µg/ml)
Pilocarpin-Phenytoin
ERGEBNISSE Diazepam) war signifikant erhöht bei den Tieren der Pilocarpin-Phenytoin-Gruppe im Vergleich zu der Pilocarpin-Gruppe (Abb. 15). Die Körpertemperatur erhöhte sich bei der Gruppe von 37,92 ± 0,13 °C auf 39,45 ± 0,20 und bei der Pilocarpin-Phenytoin-Gruppe von 36,36 ± 0,12°C auf 38,79 ± 0,25 °C. Die Körpertemperatur am Ende des SE war bei den beiden Gruppen nicht signifikant unterschiedlich. Die Erhöhung innerhalb der Gruppe war jedoch signifikant.
Abb. 15: Veränderung der rektalen Körpertemperatur vor und am Ende des SE bei Pilocarpin- bzw. bei Pilocarpin-Phenytoin-behandelten Tieren. Die dargestellte Temperaturdifferenz ergibt sich aus der Körperkerntemperatur am Ende des SE (vor Diazepam-Applikation) und der Körpertemperatur vor der 1. Pilocarpin-Injektion. Statistik: Student´s t-Test, *p<0,05
5.1.2.4 Fokale Applikation von Kainsäure oder Pilocarpin in die rechte BLA Zur Etablierung eines neuen Tiermodells für TLE wurden folgende Versuche durchgeführt. Zum einem wurden basierend auf Vorversuchen von U. Ebert und P.
Wlaz Ratten fokal Kainat in die BLA appliziert. Zum anderen wurde in einem Vorversuch Ratten fokal Pilocarpin in die BLA injiziert.
Eine Gruppe von Tieren (n = 6) erhielt Kainsäure (2 µg gelöst in 250 nl artifizieller Cerebrospinalflüssigkeit). Je zwei Ratten erhielten Pilocarpin entweder 10 µg oder 30 µg gelöst in 300 nl artifizieller Cerebrospinalflüssigkeit.
ERGEBNISSE
immobil. Dreißig Sekunden nach der Injektion zeigten die ersten Ratten wet dog shakes (100 %) und Circling nach links (50 %). Die Ratten entwickelten außerdem eine Piloerektion und Kyphose kurz nach der Injektion. Einige Tiere zeigten Hyperlokomotion (33 %). Andere Tiere (50 %) verharrten wiederholt für einige Sekunden. Im weiteren Verlauf hatten die Ratten fokale Krampfaktivität (Stadium I-III), die bei 83 % der Tiere nach 106,8 ± 14,94 min in generalisierte Krampfaktivität überging (Tabelle 14). Keines der Tiere entwickelte einen generalisierten SE.
Zwischen den Anfällen machten drei Tiere mehrere Rollen über die linke Seite. Die meisten Tiere (60 %) hatten noch drei Stunden nach der Applikation wiederholt auftretende generalisierte Krampfaktivität. Zwei Ratten zeigten sogar am nächsten Tag noch fokale Krampfaktivität. Alle Tiere überlebten die ersten 24 h.
Zwischen den Anfällen machten drei Tiere mehrere Rollen über die linke Seite. Die meisten Tiere (60 %) hatten noch drei Stunden nach der Applikation wiederholt auftretende generalisierte Krampfaktivität. Zwei Ratten zeigten sogar am nächsten Tag noch fokale Krampfaktivität. Alle Tiere überlebten die ersten 24 h.