PGP-Expression im Kindling-Modell mit Selektion auf Phenytoin-

Die PGP-Expression in Endothelien der Gehirnkapillaren von gekindelten Phenytoin-empfindlichen (Responder, n = 7) und -unPhenytoin-empfindlichen Ratten (Nonresponder, n = 6) wurde untersucht und verglichen. Eine Überexpression von PGP in Endothelien der Gehirnkapillaren könnte ein Grund für die Phenytoinunempfindlichkeit der Nonresponder sein. Es sollte daher untersucht werden, ob die Gruppe der Nonresponder im Vergleich zu Respondern eine erhöhte PGP-Expression in der Blut-Hirnschranke im Bereich der stimulierten Amygdala (bzw. von Gehirnregionen, die wichtig sind für die Krampfentstehung und -ausbreitung) besitzt.

In transversalen thionin-gefärbten Gehirnschnitten von Nonrespondern konnte im Vergleich zu Respondern keine qualitative Aussage zu sichtbaren histopathologischen Veränderungen gemacht werden. Die Analyse der Immunhistologie der PGP-Expression wies bei Nonresponder im Vergleich zu Respondern ein signifikanter Anstieg der PGP-Expression in mehreren Gehirnregionen auf (Tabelle 26 und Tabelle 27). Die gemessene PGP-markierte Fläche war signifikant erhöht im ipsilateralen Cortex (68 %; Tabelle 26). Im Bereich der Stimulationselektrode, in der ipsilateralen Amygdala, konnte ein signifikanter Anstieg der PGP-markierten Fläche um 132 % festgestellt werden (Tabelle 26 und Abb. 43). Um die 132 % Erhöhung der PGP-markierten Fläche in der Amygdala genauer zu betrachten, sind in der Abb. 43 die PGP-Expressionsdaten der Nonresponder und Responder für die Amygdala (Schnittebene -2,3 mm relativ zu Bregma) graphisch dargestellt. In keiner der gemessenen Regionen war eine astrozytäre PGP-Expression nachweisbar, der Anstieg der markierten Fläche konnte daher auf endotheliale PGP-Expression zurückgeführt werden (Kap. 5.3.2). Die OD der PGP-markierten Fläche war im ipsilateralen Cortex und in der Amygdala nicht erhöht (Tabelle 27). Nur im ipsilateralen Hilus des Gyrus dentatus war die OD signifikant erhöht (Tabelle 27 und Abb. 44). Die PGP-markierte Fläche war in dieser Region nicht signifikant erhöht (Tabelle 26).

Im Bereich der contralateralen Seite zur Elektrode wurde im Bereich des Hilus (134

ERGEBNISSE Gyrus dentatus war nicht signifikant erhöht, jedoch war die OD in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus signifikant erhöht (Tabelle 27 und Abb. 44). Die signifikanten Anstiege der OD der Nonresponder im Vergleich zu den Respondern lagen nur zwischen 7 % und 11 % (Abb. 44).

Abb. 43: PGP-Expression bei Respondern und Nonrespondern. Die Daten der Messung der PGP-markierten Fläche werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die abgebildeten Schnittebenen lagen bei –0,8 mm oder -2,3mm relativ zu Bregma. Abgebildete Regionen sind der Cortex und die Amygdala ipsilateral bzw. die Körnerzellschicht (GD) und der Hilus des Gyrus dentatus contralateral zur Elektrode. Statistik: Mann Whitney U-Test, *p<0,05 Nonresponder (n=6) im Vergleich zu Responder (n=7).

ERGEBNISSE

Abb. 44: PGP-Expression bei Respondern und Nonrespondern. Die Daten der Messung der optischen Dichte (OD) werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die abgebildeten Schnittebenen lagen bei –0,8 mm oder -2,3mm relativ zu Bregma. Abgebildete Regionen sind der ipsilaterale Hilus bzw. die contralaterale Körnerzellschicht (GD) des Gyrus dentatus. Statistik: Mann Whitney U-Test, *p<0,05 Nonresponder (n=6) im Vergleich zu Responder (n=7).

PGP-markierte Fläche (%)

Responder Nonresponder

Gehirnregionen Bregma Contralateral Ipsilateral Contralateral Ipsilateral Cortex -2,3 1,22 ± 0,18 1,15 ± 0,16 1,79 ± 0,22 1,93 ± 0,23*

-3,8 1,84 ± 0,36 1,55 ± 0,24 1,70 ± 0,13 1,68 ± 0,15 -5,8 1,35 ± 0,21 1,34 ± 0,22 1,41 ± 0,17 1,65 ± 0,18

Piriformer -2,3 0,96 ± 0,14 0,85 ± 0,15 2,10 ± 1,04 0,95 ± 0,14 Cortex -3,8 1,25 ± 0,22 1,09 ± 0,17 1,09 ± 0,17 1,06 ± 0,42

Hippokampus

Gyrus dentatus -2,3 0,88 ± 0,10 0,90 ± 0,12 1,44 ± 0,19* 0,99 ± 0,25 -3,8 1,44 ± 0,37 1,13 ± 0,22 1,22 ± 0,27 1,10 ± 0,19

Hilus -2,3 0,44 ± 0,09 0,58 ± 0,09 1,03 ± 0,24* 0,66 ± 0,09 -3,8 0,66 ± 0,11 0,94 ± 0,35 0,77 ± 0,11 0,74 ± 0,26

CA1 -2,3 0,64 ± 0,10 0,67 ± 0,04 0,89 ± 0,15 0,71 ± 0,16 -3,8 0,83 ± 0,07 0,94 ± 0,17 0,67 ± 0,24 0,89 ± 0,27 -5,8 0,68 ± 0,09 0,80 ± 0,12 0,83 ± 0,15 0,87 ± 0,24 CA3 -2,3 0,63 ± 0,09 0,50 ± 0,08 0,85 ± 0,21 0,70 ± 0,16 -3,8 1,05 ± 0,13 0,66 ± 0,10 0,73 ± 0,17 0,81 ± 0,21 -5,8 0,52 ± 0,06 0,63 ± 0,11 0,83 ± 0,15 0,93 ± 0,30 Amygdala -2,3 1,23 ± 0,19 0,63 ± 0,13 0,93 ± 0,12 1,46 ± 0,53*

-3,8 1,38 ± 0,43 0,76 ± 0,17 0,90 ± 0,13 1,72 ± 1,10

Substantia nigra -5,8 1,69 ± 0,21 1,39 ± 0,16 1,77 ± 0,38 1,30 ± 0,23

Tabelle 26: Messung der PGP-markierten Fläche bei Phenytoin-Respondern (n=7) und Nonrespondern (n=6). Die PGP-markierte Fläche wurde in transversalen Gehirnschnitten der in der Tabelle genannten Gehirnregionen gemessen und in Relation zu dem gesamten Messfeld gesetzt. Pro Gehirnschnitt Hemisphäre und Ratte wurden drei bis zehn Messfelder in die zu messende Gehirnregion gelegt. Der Durchschnitt der gemessenen

Messung der optischen Dichte

Responder Nonresponder

Gehirnregionen Bregma Contralateral Ipsilateral Contralateral Ipsilateral Cortex -2,3 0,46 ± 0,01 0,46 ± 0,01 0,46 ± 0,01 0,45 ± 0,01

-3,8 0,45 ± 0,01 0,47 ± 0,01 0,45 ± 0,01 0,45 ± 0,01 -5,8 0,45 ± 0,01 0,45 ± 0,01 0,45 ± 0,01 0,46 ± 0,01

Piriformer -2,3 0,47 ± 0,01 0,45 ± 0,01 0,45 ± 0,03 0,47 ± 0,01 Cortex -3,8 0,47 ± 0,01 0,46 ± 0,01 0,47 ± 0,01 0,45 ± 0,02

Hippokampus

Gyrus dentatus -2,3 0,41 ± 0,00 0,41 ± 0,01 0,44 ± 0,01* 0,44 ± 0,02 -3,8 0,43 ± 0,01 0,42 ± 0,01 0,44 ± 0,01 0,44 ± 0,01 Hilus -2,3 0,47 ± 0,01 0,46 ± 0,01 0,47 ± 0,01 0,51 ± 0,02 *

-3,8 0,49 ± 0,01 0,45 ± 0,02 0,47 ± 0,01 0,45 ± 0,00 CA1 -2,3 0,43 ± 0,01 0,44 ± 0,01 0,45 ± 0,02 0,43 ± 0,02 -3,8 0,46 ± 0,01 0,45 ± 0,01 0,44 ± 0,01 0,46 ± 0,02 -5,8 0,44 ± 0,03 0,43 ± 0,02 0,43 ± 0,01 0,43 ± 0,01 CA3 -2,3 0,42 ± 0,01 0,44 ± 0,01 0,44 ± 0,01 0,45 ± 0,01 -3,8 0,47 ± 0,01 0,45 ± 0,01 0,48 ± 0,02 0,47 ± 0,02 -5,8 0,43 ± 0,01 0,44 ± 0,01 0,44 ± 0,02 0,44 ± 0,03 Amygdala -2,3 0,45 ± 0,01 0,45 ± 0,01 0,45 ± 0,02 0,45 ± 0,02 -3,8 0,46 ± 0,01 0,47 ± 0,01 0,47 ± 0,02 0,46 ± 0,03

Substantia nigra -5,8 0,46 ± 0,02 0,46 ± 0,01 0,45 ± 0,02 0,46 ± 0,01

Tabelle 27: Messung der Färbeintensität der PGP-markierten Fläche bei Phenytoin-Respondern (n=7) und Nonrespondern (n=6). Die Färbeintensität der PGP-markierten Fläche wurde in transversalen Gehirnschnitten der in der Tabelle genannten Gehirnregionen in optische Dichte (OD) gemessen..

Pro Gehirnschnitt Hemisphäre und Ratte wurden drei bis zehn Messfelder in die zu messende Gehirnregion gelegt. Der Durchschnitt der gemessenen Werte pro Tier ging in den Gruppenwert mit ein. Werte sind angegeben als Mittelwerte ± Standardfehler. (Schnittebenen im mm relativ zu Bregma).

ERGEBNISSE 5.3.4.4 PGP-Expression bei Levetiracetam-Respondern und Levetiracetam-

Nonrespondern im Post-SE-Pilocarpin-Modell

Spontan krampfende Ratten wurden hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit gegenüber dem Antiepileptikum Levetiracetam selektiert. (Levetiracetam-) Nonresponder (n = 3) und (Levetiracetam-) Responder (n = 3) wurden auf Unterschiede in ihrer PGP-Expression in Endothelien der Gehirnkapillaren untersucht (s. Kap. 5.1.3.2) Anhand der PGP-Expressionsdaten sollte die Frage geklärt werden, ob die Nonresponder aufgrund einer erhöhten PGP-Expression schlechter bzw. nicht auf die Therapie mit Levetiracetam ansprachen.

Bei epileptischen Ratten konnten neurodegenerative Veränderungen und Gliosen in thionin-gefärbten Gehirnschnitten in mehreren Gehirnregionen beobachtet werden.

Die betroffenen Gehirnregionen waren insbesondere der piriforme Cortex, der Hilus des Gyrus dentatus, die Substantia nigra pars reticulata, die Pyramidenzellschichten der CA1 und CA3 Region des Hippokampus. Es konnten jedoch keine Unterschiede zwischen Respondern und Nonrespondern festgestellt werden.

Die immunhistologische Auswertung der PGP-Expression konnte aufgrund der geringen Tierzahl in den beiden Tiergruppen nicht statistisch abgesichert werden. Es können keine einheitlichen Tendenzen der PGP-Expression im Vergleich der Nonresponder mit den Respondern beschrieben werden. In den verschiedenen Regionen konnte sowohl eine Hochregulation der PGP-Expression bei den Nonrespondern als auch bei den Respondern gefunden werden.

Bei den Nonrespondern war im Vergleich zu den Respondern ein geringer Anstieg der PGP-markierten Fläche nur im Gyrus dentatus (2,3 mm posterior zu Bregma), in der CA1 Region (2,3 mm posterior zu Bregma) und in der CA3 Region (3,8 mm posterior zu Bregma) des Hippokampus feststellbar (Tabelle 28). Die detektierte Fläche entsprach der endothelialen PGP-Expression, da in den verschiedenen Gehirnregionen der einzelnen Tiergruppen keine PGP-markierte Astrozyten gefunden wurden (s. Kap. 5.3.2). Die Unterschiede in den OD-Werten waren sehr gering und lagen zwischen 4 und 9 %. Leichte Anstiege der Färbeintensität der

ERGEBNISSE

mm posterior zu Bregma) und CA3 Region des Hippokampus (2,3 mm und 5,8 mm posterior zu Bregma) sowie in der Substantia nigra (5,8 mm posterior zu Bregma) festgestellt werden (Tabelle 29).

In der Responder und Nonresponder-Gruppe wurde ferner untersucht, ob die Unterschiede in der PGP-Expression innerhalb der Gruppe durch eine unterschiedliche Anfallsfrequenz bedingt sind. Für diese Untersuchung wurde die Anfallsfrequenz der Vorkontrollphase benutzt, da in dieser Phase keine pharmakologische Beeinflussung vorhanden war. In der Tabelle 30 und Tabelle 31 sind die Einzeldaten der Flächenbestimmung und der Färbeintensität in Bezug auf ihre Anfallsfrequenz dargestellt. Die Tiere sind gemäß ihrer Anfallsfrequenz von links nach rechts abnehmend aufgelistet und sind unterteilt in Nonresponder und Responder. Zusätzlich zu der Frequenz der konvulsiven Anfälle der Vorkontrollphase ist die gesamte Anzahl der Anfälle aufgeführt. Ein paar Regionen konnten bei manchen Tieren nicht ausgewertet werden, da Läsionen (siehe piriformer Cortex) vorhanden waren bzw. Schnitte der Schnittebene nicht gewonnen werden konnten (siehe Gl 75). In allen Regionen konnte kein tendenzieller Zusammenhang zwischen dem Ausmaß der PGP-Expression und der Anzahl von spontanen Anfällen festgestellt werden.

Bei den Untersuchungen der Zusammenhänge zwischen spontanen Anfällen und der PGP-Expression muss beachtet werden, dass die Ratten vor der Dekapitation nicht überwacht wurden. Der Abstand zwischen der Frequenzanalyse und der Dekapitation betrug ca. 3 Monate. Es ist also möglich, dass Ratten, die viele spontane Anfälle während des pharmakologischen Versuchs hatten, vor der Dekapitation wenige Anfälle hatten und somit die PGP-Expression vermindert gewesen sein könnte.

PGP-markierte Fläche (%)

Responder Nonresponder

Gehirnregion Bregma links rechts Links rechts

Cortex -2,3 2,44 ± 0,65 2,93 ± 0,84 1,93 ± 0,42 1,87 ± 0,22 -3,8 3,58 ± 0,47 3,97 ± 0,32 2,42 ± 0,55 3,20 ± 0,30 -5,8 8,25 ± 2,49 7,33 ± 2,60 3,86 ± 0,72 4,19 ± 2,32

Piriformer -2,3 1,77 ± 0,60 2,87 ± 0,62

Cortex -3,8 2,62 ± 0,43 3,30 ± 0,36 1,20 ± 0,83 2,57 ± 1,55

Hippokampus

Gyrus dentatus -2,3 0,88 ± 0,14 1,16 ± 0,06 0,79 ± 0,31 1,21 ± 0,36

-3,8 1,32 ± 0,37 1,46 ± 0,35 0,91 ± 0,28 0,88 ± 0,33 Hilus -2,3 1,81 ± 0,69 1,67 ± 0,44 1,53 ± 0,61 1,62 ± 0,73 -3,8 1,70 ± 0,30 1,49 ± 0,28 1,27 ± 0,49 1,42 ± 0,59 CA1 -2,3 1,09 ± 0,25 1,11 ± 0,06 1,18 ± 0,21 1,36 ± 0,08 -3,8 2,02 ± 1,10 2,58 ± 1,49 0,85 ± 0,22 0,89 ± 0,37 -5,8 2,82 ± 0,09 4,32 ± 1,68 0,93 ± 0,42 1,65 ± 0,52 CA3 -2,3 1,39 ± 0,34 0,92 ± 0,22 1,02 ± 0,06 0,50 ± 0,11 -3,8 1,61 ± 0,66 1,28 ± 0,38 1,16 ± 0,21 1,36 ± 0,64 -5,8 2,03 ± 0,06 3,13 ± 0,001 1,56 ± 0,89 1,82 ± 0,39

Substantia nigra -5,8 3,65 ± 1,30 4,25 ± 0,001 4,24 ± 1,80 3,33 ± 0,75

Tabelle 28: Messung der PGP-markierten Fläche bei Levetiracetam-Responder (n=2-3) und Nonresponder (n=2-3). Die PGP-markierte Fläche wurde in transversalen Gehirnschnitten der in der Tabelle genannten Gehirnregionen gemessen und in Relation zu dem gesamten Messfeld gesetzt. Pro

Messung der optischen Dichte

Responder Nonresponder

Gehirnregion Bregma links rechts Links rechts

Cortex -2,3 0,46 ± 0,01 0,45 ± 0,01 0,48 ± 0,01 0,49 ± 0,02

-3,8 0,46 ± 0,01 0,47 ± 0,03 0,49 ± 0,01 0,46 ± 0,001 -5,8 0,44 ± 0,03 0,45 ± 0,02 0,43 ± 0,06 0,44 ± 0,04

Piriformer -2,3 0,45 ± 0,01 0,46 ± 0,001

Cortex -3,8 0,47 ± 0,02 0,45 ± 0,01 0,50 ± 0,01 0,49 ± 0,02

Hippokampus

Gyrus dentatus -2,3 0,47 ± 0,01 0,48 ± 0,01 0,49 ± 0,01 0,49 ± 0,01

-3,8 0,48 ± 0,01 0,49 ± 0,02 0,47 ± 0,001 0,49 ± 0,01 Hilus -2,3 0,49 ± 0,01 0,49 ± 0,04 0,52 ± 0,04 0,51 ± 0,01 -3,8 0,47 ± 0,001 0,48 ± 0,02 0,49 ± 0,02 0,48 ± 0,02 CA1 -2,3 0,46 ± 0,001 0,49 ± 0,01 0,47 ± 0,01 0,48 ± 0,01 -3,8 0,49 ± 0,01 0,46 ± 0,01 0,49 ± 0,01 0,50 ± 0,02 -5,8 0,41 ± 0,03 0,41 ± 0,02 0,43 ± 0,02 0,44 ± 0,02 CA3 -2,3 0,46 ± 0,03 0,46 ± 0,02 0,48 ± 0,01 0,45 ± 0,04 -3,8 0,48 ± 0,01 0,45 ± 0,04 0,46 ± 0,01 0,44 ± 0,01 -5,8 0,42 ± 0,03 0,44 ± 0,04 0,44 ± 0,01 0,40 ± 0,002

Substantia nigra -5,8 0,46 ± 0,01 0,46 ± 0,02 0,48 ± 0,03 0,43 ± 0,002

Tabelle 29: Messung der Färbeintensität der PGP-markierten bei Levetiracetam-Responder (n=2-3) und Nonresponder (n=2-3). Die Färbeintensität der PGP-markierten Fläche wurde in transversalen Gehirnschnitten der in der Tabelle genannten Gehirnregionen in optische Dichte (OD) gemessen.. Pro Gehirnschnitt Hemisphäre und Ratte wurden drei bis zehn Messfelder in die zu messende Gehirnregion gelegt. Der Durchschnitt der gemessenen

PGP-markierte Fläche (%)

Nonresponder Responder

Gl 75 Gl 82 Gl 83 Gl 67 Gl 91 Gl 44

Gehirnregion Bregma Links rechts links rechts links rechts links rechts links rechts links rechts

Cortex -2,3 2,34 2,09 1,51 1,65 2,54 3,19 1,27 1,36 3,51 4,23 -3,8 3,44 3,77 2,3 3,05 1,53 2,77 4,36 4,28 2,75 2,74 3,64 3,65 -5,8 5,3 6,5 3,19 3,1 1,87 9,92 5,76 4,73

Piriformer -2,3 1,61 2,49 0,82 2,04 2,89 4,07 Cortex -3,8 2,03 4,11 0,37 1,02 3,33 3,05 2,68 2,83 1,84 4,01

Hippokampus

Gyrus dentatus -2,3 0,48 0,85 1,09 1,57 0,82 1,12 0,67 1,08 1,15 1,29 -3,8 1,06 1,14 1,31 1,28 0,37 0,22 2 1,99 1,24 1,58 0,71 0,8 Hilus -2,3 0,92 0,89 2,14 2,34 1 1,2 1,24 1,27 3,19 2,55

-3,8 1,25 2,19 2,14 1,82 0,43 0,25 2,05 2,04 1,11 1,27 1,94 1,15 CA1 -2,3 1,38 1,28 0,97 1,44 1,08 1,1 0,67 1,02 1,52 1,21 -3,8 1,16 1,23 0,95 1,29 0,43 0,15 4,22 5,54 0,96 1,46 0,88 0,75 -5,8 0,8 2,45 0,27 0,68 1,71 1,82 2,91 2,64 2,73 6 CA3 -2,3 1,07 0,39 0,96 0,6 0,84 1,3 1,32 0,91 2,02 0,54

-3,8 1,57 2,22 1 1,74 0,91 0,12 2,92 1,58 0,96 1,73 0,95 0,52 -5,8 0,79 2,54 0,57 1,72 3,33 1,19 1,97 2,08 3,13

Substantia nigra -5,8 1,69 2,55 3,3 2,61 7,72 4,84 2,35 4,94 4,25 Anfälle (Predrug) 72 2 0 87 4 1 Anfälle (gesamt) 152 8 6 168 20 16 Tabelle 30: Einzeldaten der PGP-markierten Fläche in Bezug auf die Anfallsfrequenz der Tiere in der Vorkontrollphase. In der Tabelle sind die Einzeldaten der Flächenbestimmung dargestellt. Die Tiere sind gemäß ihrer Anfallsfrequenz von links nach rechts abnehmend aufgelistet und sind

Messung der optischen Dichte

Nonresponder Responder

Gl 75 Gl 82 Gl 83 Gl 67 Gl 91 Gl 44

Gehirnregion Bregma Links rechts links rechts links Rechts Links rechts links rechts links rechts

Cortex -2,3 0,47 0,44 0,45 0,45 0,49 0,51 0,46 0,45 0,49 0,51 -3,8 0,45 0,42 0,48 0,51 0,44 0,47 0,48 0,46 0,47 0,46 0,51 0,47 -5,8 0,43 0,46 0,39 0,49 0,43 0,37 0,40 0,49 0,47

Piriformer -2,3 0,47 0,46 0,43 0,45 0,46 0,46 Cortex -3,8 0,45 0,46 0,48 0,44 0,52 0,45 0,50 0,53 0,49 0,48

Hippokampus

Gyrus dentatus -2,3 0,46 0,49 0,48 0,47 0,50 0,50 0,50 0,49 0,47 0,48 -3,8 0,46 0,48 0,50 0,53 0,48 0,47 0,48 0,51 0,47 0,49 0,47 0,47 Hilus -2,3 0,48 0,52 0,49 0,45 0,57 0,53 0,55 0,49 0,45 0,50 -3,8 0,47 0,47 0,47 0,51 0,48 0,45 0,53 0,45 0,47 0,49 0,48 0,50 CA1 -2,3 0,46 0,48 0,46 0,50 0,48 0,48 0,45 0,46 0,47 0,50 -3,8 0,50 0,45 0,51 0,49 0,47 0,45 0,50 0,53 0,47 0,48 0,49 0,49 -5,8 0,37 0,39 0,40 0,40 0,47 0,45 0,41 0,42 0,45 0,45 CA3 -2,3 0,43 0,47 0,48 0,44 0,48 0,51 0,51 0,47 0,46 0,38 -3,8 0,46 0,45 0,51 0,51 0,48 0,38 0,46 0,43 0,45 0,42 0,47 0,46 -5,8 0,38 0,37 0,42 0,42 0,47 0,52 0,43 0,44 0,40

Substantia nigra -5,8 0,44 0,43 0,47 0,44 0,48 0,50 0,45 0,50 0,43 Anfälle (Predrug) 72 2 0 87 4 1 Anfälle (gesamt) 152 8 6 168 20 16 Tabelle 31: Einzeldaten der Färbeintensität der PGP-markierten Fläche in Bezug auf die Anfallsfrequenz der Tiere in der Vorkontrollphase. In der Tabelle sind die OD-Einzeldaten dargestellt. Die Tiere sind gemäß ihrer Anfallsfrequenz von links nach rechts abnehmend aufgelistet und sind unterteilt in Nonresponder und Responder. Die Frequenz der konvulsiven Anfälle der Vorkontrollphase und der gesamten konvulsiven Anfälle sind

ERGEBNISSE 5.3.4.5 PGP-Expression bei Respondern und

Phenobarbital-Nonrespondern im Post-SE-BLA-Modell

Die PGP-Expression in Endothelien der Gehirnkapillaren von spontan krampfenden Ratten, die Phenobarbital-Responder (n = 7) oder -Nonresponder (n = 4) waren, wurde untersucht. Eine PGP-Überexpression in Endothelien der Gehirnkapillaren könnte ein Grund für die schlechte Empfindlichkeit der Nonresponder gegenüber Phenobarbital sein. Die PGP-Expression von Nonrespondern wurde daher mit der von Respondern in Gehirnregionen verglichen, die für die Krampfentstehung und Ausbreitung bedeutsam sind.

Im Post-SE-BLA-Modell konnten bei epileptischen Ratten neurodegenerative Veränderungen und Gliosen in thionin-gefärbten Gehirnschnitten hauptsächlich im piriformen Cortex beobachtet werden. Im Hilus des Gyrus dentatus und in der Substantia nigra pars reticulata waren die neurodegenerativen Veränderungen und die Gliose nur geringgradig ausgeprägt. In den Pyramidenzellschichten der CA1 und CA3 Region des Hippokampus konnte keine qualitative Aussage zu sichtbaren histopathologischen Veränderungen gemacht werden.

In fast allen untersuchten Gehirnregionen konnte bei Nonrespondern im Vergleich zu Respondern ein deutlicher Anstieg der PGP-Expression in Endothelien der Gehirnkapillaren festgestellt werden, der in einigen Regionen signifikant war (Tabelle 32, Tabelle 33, Abb. 48). Die gemessene PGP-markierte Fläche war signifikant erhöht im ipsilateralen piriformen Cortex (335 % bei -2,3 mm und 131 % bei -3,8 mm relativ zu Bregma), in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus (73 %, -2,3 mm relativ zu Bregma) und in der CA1 Region des Hippokampus (111 % bei -2,3 mm und 171 % bei -3,8 mm relativ zu Bregma). Die markierte Fläche war ansonsten bei den Nonrespondern im Vergleich zu den Respondern in allen ipsilateralen Gehirnregionen außer in einer Schnittebene des Cortex (-2,3 mm relativ zu Bregma) erhöht. Auch bei der Färbeintensität konnte in allen gemessenen ipsilateralen Regionen (außer Cortex bei -5,8 mm relativ zu Bregma) eine Erhöhung der OD detektiert werden, die für alle drei Schnittebenen der CA3 Region des Hippokampus (27 – 30 %) signifikant wurde.

ERGEBNISSE

Auf der contralateralen Seite war eine vermehrt markierte Fläche der Nonresponder im Vergleich zu den Respondern in fast allen gemessenen Gehirnregionen darstellbar. Nur die contralaterale CA3 Region des Hippokampus (-3,8 mm relativ zu Bregma) und der Cortex (-3,8 mm relativ zu Bregma) zeichnete sich durch eine geringere PGP-markierte Fläche aus. Der Anstieg der PGP-markierten Fläche im contralateralen piriformen Cortex (199 % bei -2,3 mm und 125 % bei -3,8 mm relativ zu Bregma), in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus (137 % bei -3,8 mm relativ zu Bregma) und in der CA1 Region des Hippokampus (103 % bei -3,8 mm relativ zu Bregma) wurde im Vergleich zu den Respondern signifikant. Regionen, die einen signifikanten Anstieg der PGP-markierten Fläche aufwiesen, hatten auch eine verstärkte Färbeintensität, die für die contralaterale Körnerzellschicht des Gyrus dentatus in beiden untersuchten Schnittebenen (14 bzw. 16 %) und für die CA1 Region des Hippokampus (28 % bei -3,8 mm relativ zu Bregma) signifikant wurde.

Weiterhin konnte in beiden untersuchten Schnittebenen des contralateralen Hilus des Gyrus dentatus ein signifikanter Anstieg der OD (61 %) festgestellt werden. In Abb.

45 ist der Hilus des Gyrus dentatus eines Responders und eines Nonresponders dargestellt. Die Abbildung zeigt, dass die Färbeintensität der immunhistochemischen Markierung der PGP-Transporter bei den Nonrespondern im Vergleich zu den Respondern erhöht ist.

Abb. 45: Erhöhte PGP Expression im Hilus des Gyrus dentatus eines Nonresponders im Vergleich zu einem Responder. “A” zeigt den Hilus des Gyrus dentatus eines Responders. In

„B“ wird der Hilus eines Nonresponders dargestellt. Für die Markierung von PGP wurde der Antikörper C219 und das Chromogen 3,3’-Diaminobenzidin verwendet. PGP-markierte Endothelien sind durch „e“ gekennzeichnet. Schnittebene 3.8 mm posterior zu Bregma.

A

30 µm 30 µm

B

e

e

e

e

ERGEBNISSE In allen untersuchten Regionen konnte nur eine endotheliale PGP-Expression nachgewiesen werden (s. Kap. 5.3.4.5), d.h. eine astrozytäre oder neuronale PGP-Expression konnte im azeton-fixierten Kryostatschnitt nicht beobachtet werden. Bei fast allen Nonrespondern im Vergleich zu den Respondern wies der piriforme Cortex in allen untersuchten Schnittebenen eine Veränderung der Struktur der PGP-markierten Fläche auf (Abb. 46). Zusätzlich zu den normal geformten PGP-positiven Gefäßen konnte in der Schicht II des piriformen Cortex eine großflächigere PGP-markierte Fläche ausgemacht werden, die wie eine Verdichtung von Kapillaren aussah. Diese Veränderung trat bei drei Nonrespondern und bei einem Responder auf.

Abb. 46: Erhöhte P-Glykoprotein (PGP) Expression im piriformen Cortex eines Nonresponders im Vergleich zu einem Responder. “A” zeigt den piriformen Cortex eines Responders. In „B“

wird der piriforme Cortex eines Nonresponders dargestellt. Für die Markierung von PGP wurde der Antikörper C219 und das Chromogen 3,3’-Diaminobenzidin verwendet. PGP-markierte Endothelien sind durch „e“ gekennzeichnet. Schnittebene 3.8 mm posterior zu Bregma.

In der Nonresponder- und der Responder-Gruppe wurde weiterhin untersucht, ob die unterschiedliche PGP-Expression innerhalb der beiden Gruppen durch eine ungleiche Anfallsfrequenz der Tiere einer Gruppe bedingt sind und ob die verstärkte PGP-Expression der Nonrespondern auf einer erhöhten Anfallsaktivität beruht. Für diese Untersuchung wurde die Anfallsfrequenz der nicht pharmakologisch-beeinflussten Vorkontrollphase benutzt. Für alle Korrelationsuntersuchungen wurde der Pearson-Korrelationskoeffizient berechnet und das Bestimmtheitsmaß kalkuliert.

Innerhalb der Gruppe der Nonresponder und der Responder konnte nur in einer

A

30 µm 30 µm

B

e

e

e

e

ERGEBNISSE

Korrelation zwischen Anfallsfrequenz und Färbeintensität in der Körnerzellschicht des ipsilateralen Gyrus dentatus (R² = 0,93; -3,8 mm relativ zu Bregma) festgestellt werden (Abb. 47 und Tabelle 35). Wenn die Responder und Nonresponder als Gruppe zusammengefasst wurden, konnte keine signifikante Korrelation zwischen Anfallshäufigkeit und PGP-Expression festgestellt werden.

Für die Berechnung der Korrelationen wurden sowohl konvulsive als auch nicht-konvulsive Anfälle verwendet, da Tiere in der Vorkontrollphase nur wenige nicht konvulsive Anfälle hatten. Ferner scheint der Anfall entscheidender für die PGP-Expression zu sein, als die Unterscheidung des Anfalls in konvulsiv und konvulsiv. Das Tier DS 117 hatte während der Behandlungsphase vermehrt nicht-konvulsive Anfälle. Die PGP-Expressionsraten dieses Tieres unterscheiden sich nicht von dem der anderen Nonresponder. Es ist zu bedenken, dass dies nur ein Tier ist und somit keine statistische Aussage getroffen werden kann. Das Tier DS118 hatte auch nicht-konvulsive Anfälle in der Behandlungsphase, dennoch überwogen die konvulsiven Anfälle (90 % aller Anfälle).

R² = 0,9286

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

0 50 100 150 200 250

Anzahl spontaner Anfälle

OD

Abb. 47: Korrelation zwischen der gemessenen Färbeintensität der PGP-Expression im Bereich der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus und der Anzahl der spontanen Anfälle bei der Gruppe der Nonresponder. Bei den Nonrespondern konnte eine lineare Korrelation nur zwischen der Anfallsfrequenz und der OD in der Körnerzellschicht des ipsilateralen Gyrus dentatus bei -3,8 mm relativ zu Bregma (Pearson-Korrelationskoeffizient: r = 0,96; p-Wert<0,05) festgestellt werden.

ERGEBNISSE Die Einzeldaten der Flächenbestimmung (Tabelle 34 und Tabelle 35) und der Färbeintensität (Tabelle 36 und Tabelle 37) in Bezug auf ihre Anfallsfrequenz dargestellt. Die Tiere sind gemäß ihrer Anfallsfrequenz von links nach rechts abnehmend aufgelistet und sind unterteilt in Nonresponder und Responder.

Zusätzlich zu der Frequenz der konvulsiven Anfälle der Vorkontrollphase ist die gesamte Anzahl der konvulsiven Anfälle aufgeführt.

Bei den Korrelations-Untersuchungen der PGP-Expression mit der Anfallsfrequenz muss darauf hingewiesen werden, dass die Ratten vor der Gewinnung des Gehirngewebes ca. ein Monat nicht überwacht wurden. Die genaue Anzahl der Anfälle vor der Dekapitation sind dementsprechend nicht bekannt und muss bei der Auslegung der Daten bedacht werden.

PGP-markierte Fläche (%)

Responder Nonresponder

Gehirnregionen Bregma Contralateral Ipsilateral Contralateral Ipsilateral

Cortex -2,3 10,30 ± 1,56 26,24 ± 6,52 15,53 ± 2,92 22,49 ± 5,77 -3,8 16,89 ± 3,93 20,51 ± 4,37 19,37 ± 4,04 25,21 ± 1,93 -5,8 21,31 ± 6,94 22,87 ± 4,35 7,86 ± 0,56 25,21 ± 1,93

Piriformer -2,3 3,23 ± 0,91 2,04 ± 0,12 9,66 ± 1,89* 8,89 ± 1,58*

Cortex -3,8 3,47 ± 0,66 3,67 ± 1,21 7,80 ± 1,37* 8,49 ± 1,78*

Hippokampus

Gyrus dentatus -2,3 4,89 ± 1,50 2,62 ± 0,16 5,11 ± 0,16 4,53 ± 0,32*

-3,8 2,57 ± 0,47 3,71 ± 0,62 6,10 ± 1,42* 4,53 ± 0,50 Hilus -2,3 7,01 ± 2,86 4,40 ± 1,02 7,12 ± 0,42 6,24 ± 1,41 -3,8 7,01 ± 2,86 4,40 ± 1,02 7,12 ± 0,42 6,24 ± 1,41 CA1 -2,3 5,41 ± 1,68 3,57 ± 0,97 6,09 ± 0,39 7,53 ± 1,16*

-3,8 3,84 ± 0,77 3,73 ± 0,87 7,79 ± 2,22* 10,11 ± 2,69*

-5,8 5,95 ± 2,00 10,90 ± 4,85 9,58 ± 2,38 19,07 ± 8,48 CA3 -2,3 5,42 ± 0,92 9,08 ± 2,67 8,53 ± 2,15 11,63 ± 4,22 -3,8 10,06 ± 1,19 9,08 ± 2,67 5,41 ± 1,10 11,63 ± 4,22 -5,8 9,27 ± 3,50 7,43 ± 2,80 9,83 ± 3,81 8,15 ± 1,64

Substantia nigra -5,8 17,37 ± 6,40 10,00 ± 3,99 23,88 ± 3,91 17,89 ± 8,43

Tabelle 32: Messung der PGP-markierten Fläche bei Phenobarbital-Responder (n = 7) und Nonresponder (n = 4). Die PGP-markierte Fläche wurde in transversalen Gehirnschnitten der in der Tabelle genannten Gehirnregionen gemessen und in Relation zu dem gesamten Messfeld gesetzt. Pro Gehirnschnitt Hemisphäre und Ratte wurden drei bis zehn Messfelder in die zu messende Gehirnregion gelegt. Der Durchschnitt der gemessenen Werte pro Tier ging in den Gruppenwert mit ein. Werte sind angegeben als Mittelwerte ± Standardfehler. Die vier Schnittebenen werden im mm relativ

Messung der optischen Dichte

Responder Nonresponder

Gehirnregionen Bregma Contralateral Ipsilateral Contralateral Ipsilateral Cortex -2,3 0,35 ± 0,02 0,28 ± 0,02 0,35 ± 0,03 0,31 ± 0,03

-3,8 0,30 ± 0,03 0,28 ± 0,03 0,30 ± 0,02 0,29 ± 0,02 -5,8 0,41 ± 0,02 0,29 ± 0,02 0,30 ± 0,03 0,28 ± 0,03

Piriformer -2,3 0,48 ± 0,04 0,48 ± 0,01 0,51 ± 0,02 0,49 ± 0,01 Cortex -3,8 0,45 ± 0,03 0,45 ± 0,04 0,49 ± 0,02 0,50 ± 0,02

Hippokampus

Gyrus dentatus -2,3 0,43 ± 0,02 0,46 ± 0,03 0,50 ± 0,01* 0,50 ± 0,01

-3,8 0,43 ± 0,01 0,43 ± 0,02 0,49 ± 0,03* 0,49 ± 0,02 Hilus -2,3 0,31 ± 0,02 0,41 ± 0,05 0,50 ± 0,02* 0,46 ± 0,03 -3,8 0,31 ± 0,02 0,41 ± 0,05 0,50 ± 0,02* 0,46 ± 0,03 CA1 -2,3 0,40 ± 0,04 0,41 ± 0,01 0,48 ± 0,03 0,45 ± 0,03

-3,8 0,39 ± 0,02 0,42 ± 0,03 0,50 ± 0,03* 0,43 ± 0,03 -5,8 0,36 ± 0,03 0,35 ± 0,03 0,45 ± 0,04 0,39 ± 0,04

CA3 -2,3 0,38 ± 0,01 0,30 ± 0,02 0,44 ± 0,04* 0,38 ± 0,03*

-3,8 0,38 ± 0,02 0,30 ± 0,02 0,36 ± 0,01 0,38 ± 0,03*

-5,8 0,51 ± 0,04 0,37 ± 0,04 0,37 ± 0,04 0,48 ± 0,02*

Substantia nigra -5,8 0,33 ± 0,04 0,36 ± 0,03 0,34 ± 0,04 0,37 ± 0,02

Tabelle 33: Messung der Färbeintensität der PGP-markierten bei Phenobarbital-Responder (n = 7) und Nonresponder (n = 4). Die Färbeintensität der PGP-markierten Fläche wurde in transversalen Gehirnschnitten der in der Tabelle genannten Gehirnregionen in optische Dichte (OD) gemessen. Pro Gehirnschnitt Hemisphäre und Ratte wurden drei bis zehn Messfelder in die zu messende Gehirnregion gelegt. Der Durchschnitt der gemessenen

Abb. 48: PGP-Expression in Endothelien von Gehirnkapillaren bei Phenobarbital-Respondern und –Nonrespondern. Nur signifikante Unterschiede der PGP-Expressionsdaten in verschiedenen Gehirnregionen von Phenobarbital-Respondern (n = 7) und –Nonrespondern (n = 4) sind abgebildet. „A“ und

„B“ zeigt die Daten der Messung der PGP-markierten Fläche und „C“ bzw. „D“ die der optischen Dichte (OD).“ A“ und „C“ präsentiert die Daten der ipsilateralen Gehirnhälfte, „B“ und „D“ die der contralateralen Hälfte. Dargestellt ist der Mittelwert ± Standardfehler. Die Schnittebenen lagen bei -2,3

PGP-markierte Fläche (%)

Responder

DS 115 DS 117 DS 108 DS 109 DS 104 DS 119

Gehirnregion Bregma Links rechts links rechts links rechts links rechts links rechts links rechts

Cortex -2,3 15,67 38,16 14,11 23,30 14,11 18,07 7,39 23,72 10,45 19,26 6,64 14,96 -3,8 33,01 24,19 11,89 24,57 6,29 7,14 17,19 30,71 10,73 14,33 22,26 36,31 -5,8 13,00 25,32 6,94 5,34 14,76 46,63 60,48 30,10 14,33 15,42 24,15

Piriformer -2,3 2,98 1,51 3,45 1,99 0,70 2,36 6,98 2,07 3,90 2,30 1,34 2,02 Cortex -3,8 2,41 1,42 2,17 10,02 4,54 8,86 2,17 1,57 2,17 1,88 3,09 2,80 Hippokampus

Gyrus dentatus -2,3 3,27 3,04 10,72 2,38 2,37 2,33 4,62 3,47 2,72

-3,8 3,99 5,05 3,15 2,32 3,99 3,14 3,15 6,21 3,15 2,32 3,38 4,37 Hilus -2,3 5,42 7,19 17,68 4,66 2,44 3,05 7,64 1,88 2,70 12,18 -3,8 6,51 3,64 1,80 5,23 4,28 4,25 3,73 13,61 2,21 2,36 5,55

CA1 -2,3 2,45 2,87 6,55 1,76 6,32 3,28 11,50 3,29 3,33

-3,8 4,32 3,30 3,56 1,74 6,30 6,09 1,31 7,18 2,22 1,74 5,32 1,70 -5,8 2,00 5,66 1,76 1,98 8,09 1,77 14,78 33,55 5,95 10,90 4,04 10,48 CA3 -2,3 6,45 6,02 8,11 13,22 3,07 6,48 23,14 3,72 8,11

-3,8 2,21 4,83 3,98 2,69 6,78 7,59 13,14 3,20 6,87 3,90 -5,8 1,40 8,45 1,12 5,78 18,80 3,62 9,91 5,78 9,27 7,43 4,11 20,69

Substantia nigra -5,8 10,92 4,23 5,15 5,02 40,15 25,65 8,25 6,20 22,38 8,91 Anfälle (Predrug) 18 17 15 12 8 4

Anfälle (gesamt) 20 23 31 16 10 9

Tabelle 34: Einzeldaten der PGP-markierten Fläche in Bezug auf die Anfallsfrequenz der Responder in der Vorkontrollphase. In der Tabelle sind die Einzeldaten der Flächenbestimmung dargestellt. Die Tiere sind gemäß ihrer Anfallsfrequenz (Vorkontrollphase) von links nach rechts abnehmend

PGP-markierte Fläche (%)

Nonresponder

DS 118 DS 107 DS 110 DS 113

Gehirnregion Bregma links rechts links rechts links rechts links rechts Cortex -2,3 6,92 9,00 19,86 30,60 18,08 33,45 17,27 16,91 -3,8 30,20 24,30 20,90 25,46 12,90 30,20 13,49 20,88 -5,8 8,18 16,97 3,31 20,43 7,00 8,58 6,94 25,77

Piriformer -2,3 9,84 8,72 12,08 5,29 9,11 10,24 4,54 14,40 Cortex -3,8 6,28 7,33 4,71 10,71 10,15 11,91 10,06 4,01 Hippokampus 5,03 5,40 5,56 4,43 5,05 4,43 4,80 3,84 Gyrus dentatus -2,3 6,85 4,37 2,48 4,46 5,73 5,85 9,34 3,42 -3,8 6,10 5,14 8,14 4,37 7,14 10,40 7,09 5,02 Hilus -2,3 12,10 5,39 2,91 5,60 8,40 17,03 6,35 9,64 -3,8 5,34 7,33 6,30 7,34 10,54 6,64 4,90 CA1 -2,3 5,20 4,87 6,04 4,75 14,42 16,71 5,51 7,78 -3,8 4,80 9,33 8,57 9,94 16,16 44,43 8,80 12,60 -5,8 5,37 3,09 5,37 13,52 13,90 7,58 3,76 CA3 -2,3 12,39 8,48 9,65 6,19 8,27 24,20 13,10 7,65

-3,8 4,72 4,88 10,52 4,88 20,34 9,73 3,74

-5,8

14,13 7,65 4,94 8,95 65,20 43,03 11,25 11,95 Substantia nigra -5,8 6,92 9,00 19,86 30,60 18,08 33,45 17,27 16,91

Anfälle (Predrug) 219 58 3 2 Anfälle (gesamt) 712 842 14 9

Tabelle 35: Einzeldaten der PGP-markierten Fläche in Bezug auf die Anfallsfrequenz der Nonresponder in der Vorkontrollphase. In der Tabelle sind die Einzeldaten der Flächenbestimmung dargestellt. Die Tiere sind gemäß ihrer Anfallsfrequenz (Vorkontrollphase) von links nach rechts abnehmend aufgelistet. Die Frequenz aller Anfälle der Vorkontrollphase und die gesamte Anzahl der Anfälle sind dargestellt. Die PGP-markierte Fläche wurde in

Messung der optischen Dichte

Responder

DS 115 DS 117 DS 108 DS 109 DS 104 DS 119

Gehirnregion Bregma Links rechts links rechts links rechts links rechts links rechts links rechts

Cortex -2,3 0,25 0,21 0,37 0,31 0,40 0,30 0,39 0,31 0,37 0,24 0,35 0,30 -3,8 0,26 0,26 0,25 0,20 0,41 0,42 0,29 0,27 0,32 0,30 0,25 0,22 -5,8 0,34 0,27 0,37 0,36 0,32 0,23 0,21 0,25 0,23 0,31 0,28

Piriformer -2,3 0,46 0,51 0,56 0,45 0,51 0,48 0,31 0,49 0,51 0,47 0,55 0,50 Cortex -3,8 0,51 0,57 0,36 0,28 0,40 0,38 0,50 0,47 0,45 0,52 0,52 0,46 Hippokampus 0,43 0,51 0,35 0,47 0,49 0,41 0,37 0,49 0,48

Gyrus dentatus -2,3 0,39 0,39 0,40 0,40 0,43 0,42 0,44 0,39 0,49 0,54 0,47 0,42 -3,8 0,32 0,28 0,25 0,54 0,40 0,42 0,28 0,32 0,40

Hilus -2,3 0,51 0,25 0,27 0,29 0,32 0,33 0,44 0,24 0,37 0,37 0,39 0,28 -3,8 0,45 0,40 0,36 0,43 0,39 0,38 0,28 0,50 0,35

CA1 -2,3 0,40 0,49 0,36 0,39 0,32 0,39 0,39 0,34 0,48 0,31 0,42 0,33

-3,8 0,46 0,37 0,45 0,44 0,31 0,44 0,27 0,25 0,30 0,30 0,37 -5,8 0,37 0,34 0,36 0,51 0,39 0,30 0,37 0,40 0,37 0,30

CA3 -2,3 0,40 0,25 0,42 0,25 0,34 0,29 0,34 0,30 0,40 0,30 0,35 0,26 -3,8 0,47 0,29 0,50 0,33 0,35 0,38 0,27 0,47 0,22 0,48 0,39 0,27

-5,8

0,33 0,39 0,43 0,42 0,23 0,25 0,39 0,42 0,28 0,32 Substantia nigra -5,8 0,25 0,21 0,37 0,31 0,40 0,30 0,39 0,31 0,37 0,24 0,35 0,30 Anfälle (Predrug) 18 17 15 12 8 4

Anfälle (gesamt) 20 23 31 16 10 9

Tabelle 36: Einzeldaten der Färbeintensität der PGP-markierten Fläche in Bezug auf die Anfallsfrequenz der Responder in der Vorkontrollphase. In der Tabelle sind die Einzeldaten der OD Messung dargestellt. Die Tiere sind gemäß ihrer Anfallsfrequenz (Vorkontrollphase) von links nach rechts

Messung der optischen Dichte

Nonresponder

DS 118 DS 107 DS 110 DS 113

Gehirnregion Bregma links rechts links rechts links rechts links rechts Cortex -2,3 0,43 0,41 0,29 0,27 0,31 0,26 0,37 0,31

Gehirnregion Bregma links rechts links rechts links rechts links rechts Cortex -2,3 0,43 0,41 0,29 0,27 0,31 0,26 0,37 0,31

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