5.3 PGP-L OKALISATION UND E XPRESSION IM G EHIRN
5.3.2 PGP-L OKALISATION IN VERSCHIEDENEN E PILEPSIEMODELLEN
Die Tiere stammen aus verschiedenen Epilepsiemodellen. Zum einem wurde die PGP-Expression 24 h nach einem SE im SE-Kainat-Modell (Kap. 5.3.2.1 - 5.3.2.3) bzw. 24 h und eine Woche nach einem SE im SE-Pilocarpin-Modell (5.3.2.1) untersucht. Zum anderem wurde die PGP-Expression acht Stunden nach einem gekindelten Anfall detektiert. Im weiteren wurde PGP in Gehirnschnitten von epileptischen Tieren mit individueller Empfindlichkeit gegenüber einem Standardantiepileptikums nachgewiesen.
ERGEBNISSE 5.3.2.1 Kryostatschnitte
PGP- Lokalisation im Kindling-Modell
Bei Tieren, die acht Stunden nach dem zehnten generalisierten gekindelten Anfall getötet wurden, konnte mit den Antikörpern C219 und MDR1ab eine PGP-Expression in Gehirngefäßen nachgewiesen werden (Abb. 27). Eine Co-Lokalisation des PGP-Markers C219 und des endothelspezifischen GLUT-1-PGP-Markers konnte wie bei den Sham-Ratten (Abb. 27) mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie nachgewiesen werden. Weiterhin konnte wie bei den Sham-Ratten (Abb. 27) in keiner Gehirnregion eine Doppelmarkierung eines PGP-Markers (C219 bzw. MDR1ab) und des Astrozyten-Markers GFAP bzw. des Neuronen-Markers NeuN festgestellt werden.
Abb. 27: P-Glykoprotein (PGP) Expression im Gehirn einer gekindelten Ratte 8h nach dem zehnten generalisierten Anfall. “A” zeigt den Hilus des Gyrus dentatus und die CA3c/CA4 Region des Hippokampus einer gekindelten Ratte (3.8 mm posterior zu Bregma). Der markierte Bereich in „A“ wird vergrößert in „B“ dargestellt. Für die Markierung von PGP wurde der Antikörper MDR1ab und das Chromogen 3,3’-Diaminobenzidin verwendet. PGP-markierte Endothelien sind durch Pfeile gekennzeichnet.
PGP- Lokalisation im SE-Pilocarpin-Modell
24 h nach einem pilocarpin-induzierten SE waren die Blutgefäße deutlich mit den Antikörpern C219 und MDR1ab markiert (Abb. 28). Im Gegensatz zu Kontrolltieren konnte bei allen Pilocarpin-behandelten Tieren eine PGP-Expression mit den Antikörper C219 und MDR1ab in einigen Neuronen des Hilus des Gyrus dentatus und der CA3c/CA4-Schicht des Hippokampus nachgewiesen werden (Abb. 28, „C“
und „D“). Die PGP-Markierung verschwand, wenn der primäre Antikörper durch die
100 µm
A
30 µm
B
ERGEBNISSE
Hierdurch konnte ausgeschlossen werden, dass die markierten Neurone durch Fehlbindungen des sekundären Antikörpers zustande kamen.
Die Färbeintensität der PGP-markierten Neurone entsprach der Färbeintensität der PGP-markierten Endothelzellen nach einem limbischen SE (Abb. 28). Die markierten Nervenzellen erschienen histologisch normal.
Die Lokalisation von PGP in Neuronen konnte durch Konfokale Laserscanning-Mikroskopie und Doppelmarkierung mit dem Antikörper MDR1ab und dem Neuronenmarker NeuN bestätigt werden (Abb. 29, „A“). Im Gegensatz hierzu konnte weder im Hippokampus noch in einer anderen Gehirnregion eine Doppelmarkierung des PGP-Antikörper C219 und des Astrozyten-Marker GFAP festgestellt werden (Abb. 29, „C“). Wie im Kontrollgewebe konnte durch eine Doppelmarkierung der Marker C219 und GLUT-1 die Lokalisation von PGP in Gefäßen dargestellt werden (Abb. 29, „B“). Neben den doppelmarkierten Gefäßen im Hilus des Gyrus dentatus und der CA3c/CA4 Region des Hippokampus waren Zellen PGP-markiert, die Neuronen-ähnliche Morphologie besaßen.
Um die neuronale PGP-Expression über einen längeren Zeitraum zu verfolgen, wurde eine weitere Gruppe von Tieren eine Woche nach Pilocarpin-induziertem SE getötet. Im Vergleich zur Situation 24 h nach einem Pilocarpin-induziertem SE waren nur vereinzelt Neurone im Hilus des Gyrus dentatus und in der CA3c/CA4 Region des Hippokampus markiert (Abb. 28, „E“ und „F“). Dies spricht für eine Abnahme der neuronalen PGP-Markierung sieben Tage nach einem SE.
ERGEBNISSE
Abb. 28: PGP-Expression bei Kontrolltieren (A, B), bei Tieren 24 h nach einem durch pilocarpin-induzierten SE (C, D) und 7 Tage nach einem pilocarpin-pilocarpin-induzierten SE (E, F). In den Abbildungen sind die mit dem PGP-Marker MDR1ab immunhistochemisch angefärbten Bereiche des Hilus des Gyrus dentatus und die CA3c/CA4 Region des Hippokampus dargestellt (transversale Gehirnschnitte, 2,3 mm posterior zu Bregma). Abbildung “A” und “B”
stammen von einer Kontrollratte. “C” - “F” sind von Ratten entweder 24 h (C,D) oder 7 Tage (E,F) getötet nach einem SE, der durch Pilocarpin ausgelöst wurde. Die markierten Flächen in
“A”, “C” und “E” werden vergrößert in “B”, “D” und “F” abgebildet. PGP-markierte
A
e e
C
e
e
100 µm
B
e
n
30 µm
D
e
n
n
F E
n n
e e
e
ERGEBNISSE
Abb. 29: Lokalisation von PGP in Neurone und Gefäße, nicht aber in Astrozyten. Alle transversalen Gehirnschnitte stammen von einem Tier 24h nach einem SE, der durch Pilocarpin ausgelöst wurde und zeigen den Hilus des Gyrus dentatus (2,3mm posterior zu Bregma). “A” zeigt ein doppelmarkiertes Neuron mit dem PGP-Marker (MDR1ab, rot) und dem neuronenspezifischen Marker NeuN (grün). In “B” ist eine Co-Lokalisation von PGP (C219, grün) und dem endothelienspezifischen Marker GLUT-1 (rot) dargestellt; die doppelmarkierten Bereiche erscheinen gelblich. Neben den doppelmarkierten Endothelzellen ist eine neuronen-ähnlichgeformte Zelle PGP-markiert. “C” zeigt die fehlende Co-Lokalisation von dem Astrozyten-Marker GFAP (rot) und dem PGP-Marker C219 (grün). PGP-markierte Endothelien sind mit „e“ und PGP-markierte Neurone mit „n“ gekennzeichnet.
PGP- Lokalisation im SE-Kainat-Modell
Zur Klärung, ob die neuronale PGP-Expression ein Phänomen ist, das nur im Pilocarpin-Modell auftritt, wurde die PGP-Expression auch in einem anderen SE-Modell untersucht. Der SE wurde durch das Krampfgift Kainsäure ausgelöst und die Tiere wurden 24 h nach Beendigung des SE getötet. Die Gehirne wurden den Tieren entnommen und immunhistologisch aufgearbeitet bzw. wurde in einer Kooperation mit der Neuropathologie der Universität Bonn für eine Bestimmung der mdr1a und mdr1b RNA-Expression im Hippokampus verwendet (s. Diskussion).
Wie bei dem Experiment mit Pilocarpin konnte eine neuronale Expression von PGP mit dem Antikörper MDR1ab im Hilus des Gyrus dentatus und in der CA3c/CA4 Region bei Kainsäure-behandelten Tieren festgestellt werden (Abb. 30). Das PGP-Expressionsmuster war ähnlich wie bei den mit Pilocarpin behandelten Tieren, wobei weniger Nervenzellen markiert waren und die Markierung weniger intensiv erschien.
Wie unter Kap. 5.3.1.1 erwähnt konnte bei Kontrolltieren keine neuronale PGP-A
ERGEBNISSE
Abb. 30: PGP-Expression in Kontrollen (A, B, C) und bei Ratten 24 h nach einem SE, ausgelöst durch Kainsäure (D, E, F). Die immunhistochemische Detektion von PGP mit dem Antikörper MDR1ab ist abgebildet an Transversalschnitten des Hilus des Gyrus dentatus und der CA3c/CA4 Region des Hippokampus (2.3 mm posterior zu Bregma). Die markierten Flächen in
„A“ und „D“ sind vergrößert in „B“, „C“, „E“ und „F“ dargestellt. PGP-markierte Endothelien
100 µm
D
n
E
n
e e
F
n C
B A
e
e
e
30 µm
10 µm
e
ERGEBNISSE
Durch eine Lasercapture-Microdissection Methode mit anschließender Real time PCR konnte eine verstärkte neuronale Expression der PGP-RNA mdr1a im Bereich des Hilus des Gyrus dentatus und von mdr1a und mdr1b in der CA3c/CA4 Region des Hippokampus bei Kainsäure-behandelten Ratten festgestellt werden (Volk et al., 2004).
PGP-Lokalisation in verschiedenen Epilepsie-Modellen mit Selektion auf individuelle Antiepileptika-Empfindlichkeit
In den drei Versuchsansätzen (erstens individuelle Levetiracetam-Empfindlichkeit bei spontan krampfenden Ratten; zweitens individuelle Phenobarbital-Empfindlichkeit bei spontan krampfenden Ratten; drittens individuelle Phenytoin-Empfindlichkeit im Kindling-Modell) konnte sowohl bei Respondern als auch bei Nonrespondern in allen untersuchten Gehirnregionen eine PGP-Expression nur in Gehirngefäßen detektiert werden.
5.3.2.2 Gefrierschnitte
PGP- Lokalisation im Kainat-Modell
Die Expression von PGP war mit allen Antikörpern (C219, MDR1ab, H241; Tabelle 21; Abb. 31 „A“-„C“) in den Endothelzellen der Gehirngefäße nachweisbar. Der PGP-Marker MDR1ab detektierte auch eine deutliche PGP-Immunoreaktivität in Astrozyten.
Wurden die Schnitte mit einem Ethanol-Essigsäure-Gemisch vorbehandelt, konnte PGP vor allem in Endothelzellen nachgewiesen werden (Abb. 31 „D“). Mit dem Antikörper MDR1ab wurde eine schwache Markierung der Astrozyten festgestellt.
Eine Expression von PGP in Neuronen konnte nicht gezeigt werden.
ERGEBNISSE
Abb. 31: P-Glykoprotein (PGP) Expression 24h nach Kainsäure-ausgelöstem SE - Gefriermikrotomschnitt. “A”-„D“ zeigt den Hilus des Gyrus dentatus einer kainsäure-behandelten Ratte bei 400facher Vergrößerung (3.8 mm posterior zu Bregma). Für die Markierung von PGP wurde in „A“ der Antikörper MDR1ab, in “B” C219 und in „C“ H241 als Marker für PGP benutzt. In „D“ wurde der PGP-Marker MDR1ab nach einer Vorbehandlung mit einem Essigsäure-Ethanol-Gemisch benutzt. Für die Färbung wurde das Chromogen 3,3’-Diaminobenzidin benutzt. PGP-markierte Endothelien sind mit „e“ und PGP-markierte Astrozyten mit „a“ gekennzeichnet.
5.3.2.3 Vibratomschnitte
PGP- Lokalisation im Amygdala-Kindling Modell
Bei gekindelten Ratten konnte keine PGP-Expression mit dem Antikörper C219 im Vibratomschnitt ohne Vorbehandlung (Ethanol-Essigsäure-Gemisch) festgestellt werden (Abb. 33).
A
30 µm
30 µm 30 µm
30 µm
D C
B
e
e
e e
a
e
e a
a
ERGEBNISSE
PGP- Lokalisation im Kainat-Modell
Die PGP-Antikörper C219, MDR1ab und H241 zeigten eine PGP-Expression hauptsächlich in Astrozyten (Tabelle 21 und Abb. 32). Nur der Antikörper MDR1ab signalisierte eine PGP-Expression in Endothelien der Blut-Hirn-Schranke.
Außer bei dem PGP-Marker MDR1ab verschwand nach einer Vorbehandlung mit einem Ethanol-Essigsäure-Gemisch das Signal von PGP in Astrozyten. Alle Marker wiesen dann hauptsächlich eine Expression von PGP in Endothelien der Blutgefäße nach (Tabelle 21 und Abb. 32). Nur der Antikörper MDR1ab markierte geringgradig PGP in Astrozyten.
Abb. 32: P-Glykoprotein (PGP) Expression 24h nach Kainsäure-ausgelöstem SE - Vibratomschnitt. “A”-„D“ zeigt den Hilus des Gyrus dentatus einer kainsäure-behandelten Ratte bei 400facher Vergrößerung (3.8 mm posterior zu Bregma). Für die Markierung von PGP wurde in „A“ der Antikörper MDR1ab, in “B” C219 und in „C“ H241 als Marker für PGP benutzt.
In „D“ wurde der PGP-Marker MDR1ab nach einer Vorbehandlung mit einem Essigsäure-Ethanol-Gemisch benutzt. Für die Färbung wurde das Chromogen 3,3’-Diaminobenzidin benutzt. PGP-markierte Endothelien sind mit „e“ und PGP-markierte Astrozyten mit „a“
gekennzeichnet.
ERGEBNISSE Schneideverfahren
(Fixierung)
Vorbehandlung
(Ethanol/Essigsäure) Antikörper Astrozyten Endothelien Neurone
C219 - + (+)
Tabelle 21: Nachweis der PGP-Expression und –Gehirnlokalisation bei verschiedenen histologischen Aufbereitungsmethoden. Das Gewebe stammt von Tieren 24 h nach Beendigung eines SE im Kainat-Modell. (- keine Expression; ((+)) geringgradige Expression; (+) mittelgradige Expression; + hochgradige Expression)
5.3.3 PGP-Expression in Astrozyten in verschiedenen Epilepsie-Modellen