Aus dem Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
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Untersuchung der Mechanismen von Pharmakoresistenz
in verschiedenen Epilepsiemodellen
These
zur Erlangung des Grades eines
D OCTOR OF PHILOSOPHY
- Ph.D. -
im Fachgebiet Pharmakologie
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Holger Volk
aus Garmisch-Partenkirchen
Hannover 2004
Supervisor: Univ.-Prof. Dr. W. Löscher
Betreuungsgruppe: Univ.-Prof. Dr. W. Löscher
Univ.-Prof. Dr. E. Zimmermann Univ.-Prof. Dr. G. F. Walter
1. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. W. Löscher (Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover)
Univ.-Prof. Dr. E. Zimmermann (Institut für Zoologie der Tierärztliche Hochschule Hannover)
Univ.-Prof. Dr. G. F. Walter (Rektorat, Medizinischen Universität Graz)
2. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. C. Grothe (Institut für Neuroanatomie der Medizinische Hochschule Hannover)
Datum der mündlichen Prüfung: 03.06.2004
gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft Lo274/9-1/2 und durch ein Promotionsstipendium der Studienstiftung des deutschen Volkes
Für meine Eltern
1 Einleitung...1
2 Übersicht ...3
2.1 EPILEPSIE...3
2.1.1 DEFINITION UND BEDEUTUNG...3
2.1.2 TEMPORALLAPPENEPILEPSIE...4
2.2 PHARMAKORESISTENZ...6
2.2.1 MECHANISMEN DER PHARMAKORESISTENZ...7
2.2.2 HIPPOKAMPUS-SKLEROSE...8
2.2.3 TARGETSTRUKTURVERÄNDERUNG...10
2.2.4 MULTIDRUG-TRANSPORTER...11
2.3 TIERMODELLE...22
2.3.1 ELEKTRISCHE EPILEPSIEMODELL...24
2.3.1.1 Amygdala-Kindling Modell...24
2.3.1.2 SE-BLA-Modell...26
2.3.2 CHEMISCHE EPILEPSIEMODELLE...28
2.3.2.1 SE-Kainat-Modell ...28
2.3.2.2 SE-Pilocarpin-Modelle...29
2.3.3 PHARMAKOLOGISCHE UNTERSUCHUNG VON TEMPORALLAPPENEPILEPSIE-MODELLEN....31
2.3.3.1 Übersicht über Pharmakoresistenzmodelle...32
2.3.3.2 Selektion nach Phenytoin-Empfindlichkeit im Amygdala-Kindling Modell ...33
2.3.3.3 Pharmakologische Untersuchungen in Post-SE-Modellen...36
3 Zusammenfassung und Zielsetzung ...38
4 Material und Methoden...41
4.1 ELEKTRISCHE EPILEPSIE-MODELLE...41
4.1.1 VERSUCHSTIERE...41
4.1.2 ELEKTRODENIMPLANTATION...41
4.1.3 BEURTEILUNG DER KRAMPFSCHWERE...43
4.1.4 AMYGDALA-KINDLING-MODELL...44
4.1.4.1 Stimulationsprotokoll ...45
4.1.4.2 Initiale Nachentladungsschwelle ...45
4.1.5 SE-BLA-MODELL...46
4.1.5.1 Stimulationsprotokoll ...47
4.2 CHEMISCHE EPILEPSIE-MODELLE...48
4.2.1 VERSUCHSTIERE...48
4.2.2 SE-KAINAT-MODELL...48
4.2.3 KRAMPFPARAMETER...49
4.2.4 SE-PILOCARPIN-MODELL (FRAKTIONIERTES LITHIUM-PILOCARPIN-MODELL) ...50
4.2.5 SE-PILOCARPIN-MODELL MIT PHENYTOIN-VORBEHANDLUNG...51
4.2.6 FOKALE APPLIKATION VON PILOCARPIN ODER KAINSÄURE IN DIE RECHTE BASOLATERALEN AMGYDALA...52
4.2.6.1 Implantation der Führungsrohre ...53
4.2.6.2 Mikroinjektionen ...54
4.3 PHARMAKOLOGISCHE UNTERSUCHUNG IN VERSCHIEDENEN EPILEPSIE-MODELLEN...56
4.3.1 SELEKTION NACH INDIVIDUELLER PHENYTOIN-EMPFINDLICHKEIT IM AMYGDALA- KINDLING MODELL...56
4.3.2 BLUTENTNAHME...57
4.3.3 SELEKTION NACH INDIVIDUELLER LEVETIRACETAM-EMPFINDLICHKEIT IM POST-SE- PILOCARPIN-MODELL...57
4.3.3.1 Versuchsdesign und Auswahl der Tiere...58
4.3.3.2Selektion nach individueller Phenobarbital-Empfindlichkeit im Post-SE- BLA-Modell ...59
4.3.3.3 Versuchsdesign und Auswahl der Tiere...59
4.4 EEG- UND VIDEOÜBERWACHUNG...61
4.4.1 ÜBERWACHUNG AUF SPONTANE ANFÄLLE...61
4.4.1.1 EEG-Aufzeichnung...61
4.4.1.2 Video-Aufzeichnung ...62
4.5 HISTOLOGIE...63
4.5.1 GEWINNUNG DES GEHIRNGEWEBES...63
4.5.1.1 Dekapitation ...63
4.5.1.2 Perfusion ...63
4.5.2 GEWINNUNG DER GEHIRNSCHNITTE...64
4.5.2.1 Kryostatschnitte...64
4.5.2.2 Gefrierschnitte ...64
4.5.2.3 Vibratomschnitte...65
4.5.3 NISSL-FÄRBUNG...65
4.5.4 IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS VON MULTIDRUG-TRANSPORTERN...65
4.5.4.1 Standardprotokoll (Immunperoxidase-Reaktion an Kryostatschnitten) ...66
4.5.4.2 Immunfluoreszenz und Doppelmarkierung an Kryostatschnitten ...67
4.5.4.3 Immunperoxidase-Reaktion an Gefrier- und Vibratomschnitten...68
4.5.4.4 Nachweis des Multidrug-Transporters Multidrug-resistance-Protein 2 im Gehirn ...68
4.5.5 IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS VON GLUT-1 ...69
4.5.6 IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS VON GFAP UND NEUN...69
4.6 ÜBERSICHT ÜBER DIE MODELLE UND DIE ANGEWENDETEN METHODEN...69
4.7 AUSWERTUNG...72
4.7.1 MESSUNG DER FLÄCHE UND DER OPTISCHEN DICHTE...72
4.7.2 SCORE-SYSTEM DER PGP-EXPRESSION IN ASTROZYTEN:...76
4.7.3 MESSUNG DER NEURONENANZAHL...76
4.7.4 DOPPELMARKIERUNGSSTUDIEN...77
4.8 STATISTIK...77
4.9 ANHANG...78
4.9.1 GERÄTE FÜR DIE EEG- UND VIDEOÜBERWACHUNG...78
4.9.2 PROTOKOLLE FÜR DIE HISTOLOGISCHEN METHODEN...79
4.9.2.1 Substanzen ...83
5 Ergebnisse ...85
5.1 TIERMODELLE...85
5.1.1 ELEKTRISCHE EPILEPSIEMODELLE...85
5.1.1.1 Amygdala-Kindling Modell...85
5.1.1.2 SE-BLA-Modell...86
5.1.2 CHEMISCHE EPILEPSIE-MODELLE...87
5.1.2.1 SE-Kainat-Modell ...87
5.1.2.2 SE-Pilocarpin-Modell...89
5.1.2.3 SE-Pilocarpin-Modell mit Phenytoin Vorbehandlung...90
5.1.2.4 Fokale Applikation von Kainsäure oder Pilocarpin in die rechte BLA...95
5.1.3 PHARMAKOLOGISCHE UNTERSUCHUNG IN VERSCHIEDENEN EPILEPSIE-MODELLEN...99
5.1.3.1 Selektion nach individueller Phenytoin-Empfindlichkeit im Amygdala-Kindling Modell ...99 5.1.3.2 Selektion nach individueller Levetiracetam-Empfindlichkeit im Post-SE-
Pilocarpin-Modell...99
5.1.3.3 Selektion nach individueller Phenobarbital-Empfindlichkeit im Post-SE-BLA- Modell ...100
5.2 MRP2-LOKALISATION UND EXPRESSION IM GEHIRN...111
5.3 PGP-LOKALISATION UND EXPRESSION IM GEHIRN...112
5.3.1 PGP-LOKALISATION IM GEHIRN VON KONTROLLTIEREN...112
5.3.1.1 Kryostatschnitte...113
5.3.1.2 Gefrierschnitte ...115
5.3.1.3 Vibratomschnitte...116
5.3.2 PGP-LOKALISATION IN VERSCHIEDENEN EPILEPSIEMODELLEN...118
5.3.2.1 Kryostatschnitte...119
5.3.2.2 Gefrierschnitte ...124
5.3.2.3 Vibratomschnitte...125
5.3.3 PGP-EXPRESSION IN ASTROZYTEN IN VERSCHIEDENEN EPILEPSIE-MODELLEN...127
5.3.3.1 PGP-Expression im Amygdala-Kindling Modell ...127
5.3.3.2 PGP-Expression im SE-Kainat-Modell ...128
5.3.4 PGP-EXPRESSION IN ENDOTHELIEN DER GEHIRNKAPILLAREN IN VERSCHIEDENEN EPILEPSIEMODELLEN...130
5.3.4.1 Computer-gestütztes Bildanalysesystem zur Quantifizierung der PGP- Expression im Amygdala-Kindling- und SE-Kainat-Modell ...130
5.3.4.2 PGP-Expression im SE-Pilocarpin-Modell mit Phenytoin-Vorbehandlung ...138
5.3.4.3 PGP-Expression im Kindling-Modell mit Selektion auf Phenytoin- Empfindlichkeit...144
5.3.4.4 PGP-Expression bei Levetiracetam-Respondern und Levetiracetam- Nonrespondern im Post-SE-Pilocarpin-Modell ...149
5.3.4.5 PGP-Expression bei Phenobarbital-Respondern und Phenobarbital-Nonrespondern im Post-SE-BLA-Modell ...155
5.4 MORPHOLOGISCHE VERÄNDERUNGEN BEI MODELLEN FÜR TLE MIT PHAMAKO- UNEMPFINDLICHKEIT...167
5.4.1 NEURODEGENERATION IN VERSCHIEDENEN MODELLEN FÜR TEMPORALLAPPEN- EPILEPSIE...167
5.4.1.1 Neurodegeneration im Amygdala-Kindling Modell mit Phenytoin-Selektion...167
5.4.1.2 Neurodegeneration bei Levetiracetam-Respondern und Levetiracetam- Nonrespondern im Post-SE-Pilocarpin-Modell ...169
5.4.1.3 Neurodegeneration bei Phenobarbital-Respondern und Phenobarbital-
Nonrespondern im Post-SE-BLA-Modell ...171
5.4.2 ASTROZYTENPROLIFERATION IN VERSCHIEDENEN MODELLEN FÜR TEMPORALLAPPEN- EPILEPSIE...175
5.4.2.1 Astrozytenproliferation im Amygdala-Kindling Modell mit Phenytoin-Selektion...175
5.4.2.2 Astrozytenproliferation bei Levetiracetam-Responder und Levetiracetam- Nonresponder im Post-SE-Pilocarpin-Modell ...177
5.4.2.3 Astrozytenproliferation bei Phenobarbital-Respondern und Phenobarbital- Nonrespondern im Post-SE-BLA-Modell ...179
6 Diskussion ...181
6.1 TIERMODELLE...181
6.1.1 CHEMISCHE EPILEPSIEMODELLE...181
6.1.1.1 Fokale Applikation von Pilocarpin oder Kainat in die rechte basolaterale Amygdala (BLA)...181
6.1.2 PHARMAKOLOGISCHE UNTERSUCHUNG IN EINEM EPILEPSIE-MODELL...182
6.1.2.1 Selektion nach individueller Phenobarbital-Empfindlichkeit im Post-SE-BLA- Modell ...183
6.2 UNTERSUCHUNG DER MECHANISMEN FÜR PHARMAKORESISTENZ...188
6.2.1 MULTIDRUG-TRANSPORTER...188
6.2.1.1 Computer-gestütztes Bildanalysesystem zur Quantifizierung der PGP- Expression ...189
6.2.1.2 Lokalisation und Expression von PGP in verschiedenen Epilepsiemodellen ...191
6.2.1.3 Einfluss von Antiepileptika auf die Expression von PGP...204
6.2.1.4 PGP-Expression bei pharmakoresistenten und pharmakosensitiven Ratten ...205
6.2.2 MRP2-LOKALISATION UND EXPRESSION IM GEHIRN...213
6.2.3 MORPHOLOGISCHE VERÄNDERUNGEN UND IHRE BEDEUTUNG FÜR PHARMAKORESISTENZ...214
7 Zusammenfassung...218
8 Summary ...222
9 Literaturverzeichnis ...225
Abkürzungen
Abb. Abbildung
BLA basolaterale Amygdala d Tag
DAB 3,3´Diaminobenzidin DG Gyrus dentatus d.h. das heißt
EEG Elektroenzephalogramm
Fa. Firma
g Gramm h Stunde
Hz Hertz
i.m. intramuskulär i.p. intraperitoneal i.v. intravenös Kap. Kapitel
kg Kilogramm M Molar max. maximal meq Milliäquimolar
MEZ Mitteleuropäische Zeit mg Milligramm
min Minute mind. mindestens ml Milliliter mm Millimeter ms Millisekunde mV Millivolt
µA Mikroampère
µg Mikrogramm
µl Mikroliter µm Mikrometer NaCl Natriumchlorid OD optische Dichte PC piriformer Cortex s.c. subkutan
s Sekunde SD Sprague-Dawley SE Status epilepticus
SEM standard error of the mean (Standardfehler) sog. sogenanntes
SN Substantia nigra pars reticulata
SSSE self sustained status epilepticus (selbsterhaltender Status epilepticus) St.D. standard deviation (Standardabweichung)
Tab. Tabelle
TLE Temporallappenepilepsie VEn ventraler endopiriformer Nucleus
Wo Woche
z.B. zum Beispiel
EINLEITUNG
1 E INLEITUNG
Der Begriff Epilepsie fasst eine Vielzahl von Krankheiten und Syndromen zusammen, die durch das wiederholte Auftreten von epileptischen Anfällen gekennzeichnet sind (Fröscher und Vasella 1994). Epilepsie ist beim Menschen und bei Hund und Katze die häufigste chronische Erkrankung des zentralen Nervensystems (Hauser 1999;
Löscher 1994 und 2003).
Die wichtigste Therapieform der Epilepsie ist die Pharmakotherapie. Ungeachtet einer großen Anzahl von Antiepileptika sprechen ungefähr ein Drittel der Patienten, sowohl beim Menschen (Regesta und Tanganelli 1999; Kwan und Brodie 2000), als auch bei Hund und Katze (Löscher 2003) nicht ausreichend auf die Therapie an, d.h.
sie sind pharmakoresistent. Die Temporallappenepilepsie (TLE) mit komplex-fokalen Anfällen ist in der Humanmedizin die häufigste pharmakoresistente Epilepsieform beim erwachsenen Patienten. Etwa 70 – 80% der Patienten mit TLE sprechen auf eine medikamentöse Therapie nicht oder nur unzureichend an (Leppik 1992). Diesen Patienten bleibt häufig als letzte Möglichkeit nur eine chirurgische Entfernung des Hippokampus und angrenzender Regionen, um eine Linderung der Symptome zu erreichen. Die Mechanismen, die zu dem Phänomen Pharmakoresistenz führen, sind unbekannt. Neue rationale Ansätze für die Entwicklung neuer Antiepileptika zur zufriedenstellenden Therapie schwer behandelbarer Epilepsien stellen sich daher als schwierig dar.
Die Grundlagenforschung der Mechanismen von Pharmakoresistenz bei TLE ist vor allem deswegen schwierig, da ein Mangel an geeigneten Epilepsiemodellen besteht.
In der Arbeitsgruppe Löscher ist ein Tiermodell für pharmakoresistente TLE etabliert:
phenytoin-resistente amygdala-gekindelte Ratten. Um jedoch ein besseres Verständnis über die Hintergründe von Pharmakoresistenz zu erlangen und um neue Ansätze zur Entwicklung von besser wirksamen Therapien zu gewinnen, ist die Entwicklung neuer Tiermodelle unverzichtbar. Weiterhin sind vergleichende pharmakologische Untersuchungen neuer Therapien an verschiedenen Modellen für
EINLEITUNG
Pharmakoresistenz notwendig, damit eine bessere Voraussage über die klinische Effektivität einer Therapie getroffen werden kann.
Ziel dieser Arbeit war es, in tierexperimentellen Studien verschiedene mögliche Mechanismen von pharmakoresistenter Epilepsie näher zu untersuchen. Hierfür wurden zwei Hauptziele definiert.
Erstens sollte ein neues Modell für Temporallappenepilepsie zur Untersuchung pharmakoresistenter Epilepsie entwickelt werden. Zweitens wurden einige Hypothesen untersucht, wie die Bedeutung morphologischer Veränderungen (Neurodegeneration, Gliaaktivierung) und die Rolle von Multidrug-Transportern mittels verschiedener Modelle für Epilepsie. Für die Untersuchungen wurden unter anderem Modelle verwendet, bei denen eine Subgruppe von Tieren eine herabgesetzte Antiepileptika-Empfindlichkeit besaß (z.B. Amygdala-Kindling-Modell mit Phenytoin-Selektion).
ÜBERSICHT
2 Ü BERSICHT
2.1 EPILEPSIE
2.1.1 Definition und Bedeutung
Der Begriff Epilepsie fasst eine Vielzahl von Krankheiten und Syndromen zusammen, die durch das wiederholte Auftreten von epileptischen Anfällen gekennzeichnet sind (Fröscher und Vasella 1994). Epilepsie ist beim Menschen die häufigste chronische Erkrankung des zentralen Nervensystems. Epilepsien treten mit einer Prävalenz von schätzungsweise 1,4 – 5,7 % bei der Weltbevölkerung auf (Hauser 1999). Das entspricht weltweit ca. 50 Millionen Menschen. In der Veterinärmedizin werden Epilepsien vor allem bei Hund und Katze diagnostiziert und sind wie beim Menschen die häufigste chronische neurologische Erkrankung (Löscher 1994 und 2003).
Die Klassifikation der Epilepsien ist wesentlich für eine erfolgreiche Therapie.
Epileptische Syndrome und epileptische Anfälle werden nach den Merkmalen Anfallsmuster, Ursache, Alter bei Krankheitsbeginn, auslösende Faktoren und anhand des elektroenzephalographischen Befundes klassifiziert. Der Gelegenheitsanfall wird von der Anfallserie und dem Status epilepticus (SE) unterschieden. Nach dem Anfallsmuster werden lokalisationsbezogene fokale Epilepsien von generalisierten und unklassifizierbaren Epilepsien unterschieden.
Weiterhin wird differenziert nach dem Vorhanden- oder Nichtvorhandensein motorischer Funktionsstörungen, die entweder tonisch, klonisch, tonisch-klonisch, atonisch oder myoklonisch sein können. Fokale Anfälle können in elementar-fokale (ohne Bewusstseinstörung), partial-komplexe (Bewusstseinsbeeinträchtigung), hemilaterale und sekundär generalisierte fokale Anfälle gegliedert werden. Die weitere Unterteilung (idiopathisch, kryptogenetisch und symptomatisch) richtet sich nach der Ätiologie (Commission on Classification and Terminology of the International League against Epilepsy 1989).
Häufige Ursachen einer Epilepsieerkrankung beim Menschen vor dem 20.
ÜBERSICHT
Lebensjahr sind angeborene Entwicklungsstörungen des Gehirns, perinatale Hirnschäden, genetische und neurometabolische sowie bei älteren Menschen zerebrovaskuläre Schädigungen.
2.1.2 Temporallappenepilepsie
Der komplex-fokale Anfall mit oder ohne sekundäre Generalisierung ist die häufigste Anfallsform beim Menschen (Gastaut et al. 1975, Hauser et al. 1993). Bei Hund und Katze generalisieren analog zum Menschen die meisten fokalen Anfälle sekundär zu tonisch-klonischen Krämpfen (Löscher 1994 und 2003). In den Temporallappen (vor allem im Hippokampus und der Amygdala) beginnen etwa 70-80% der komplex- fokalen Anfälle, die deshalb auch als „Temporallappenepilepsie“ bezeichnet werden (Wolf 1994). Eine erfolgreiche Therapie der TLE ist mit den heute zur Verfügung stehenden Antiepileptika oft schwer oder überhaupt nicht zu erreichen, da neue Substanzen häufig anhand von Tiermodellen getestet werden, die für andere Anfallsformen prädiktiv sind (Löscher 1986; Löscher und Schmidt 1988).
Die TLE wird in ihrer Entwicklung durch einen primären Insult begünstigt. Der primäre Insult kann neben Infektionen des Zentralennervensystems oder einem Schlaganfall ein schweres Schädel-Hirn-Trauma oder eine verlängerte Krampfaktivität in Form eines SE gewesen sein. Diese Ereignisse können mehrere Jahre zurückliegen, bevor sich eine Epilepsie entwickelt. Bestätigt wird diese Erkenntnis durch retrospektive Studien an Vietnam-Veteranen mit schweren Kopfverletzungen, die innerhalb der ersten 12 Monate nach der Verletzung ein 580fach erhöhtes Risiko und in den weiteren 10 – 15 Jahren ein 25fach erhöhtes Risiko hatten, an Epilepsie zu erkranken (Caveness 1979; Salazar 1985). Zusätzlich steigt mit der Schwere der Kopfverletzung das Risiko, an Epilepsie zu erkranken (Annegers et al. 1980).
Neben den Kopfverletzungen wird das Auftreten eines SE als mögliche Ursache für eine Epilepsie aufgeführt. Ein SE wird definiert als eine mindestens 30 minütige Krampfaktivität in Form eines epileptischen Anfalls oder wiederholter Anfälle, bei
ÜBERSICHT
denen der Patient das Bewusstsein nicht wiedererlangt. Der SE wird klassifiziert nach dem überwiegenden Anfallstyp während des Krampfgeschehens in konvulsiv oder nicht-konvulsiv, primär oder sekundär generalisiert bzw. fokal oder komplex- fokal. Studien bei Kindern ergaben, dass 30 - 82 % der Kinder, die einen konvulsiven SE hatten, später spontane epileptische Anfälle entwickeln (Aicardi und Chevrie 1970; Maytal et al. 1989; Verity et al. 1993). Ferner treten bei 37% der Patienten im ersten Jahr und bei 56% in den ersten drei Jahren nach einem konvulsiven SE spontane Anfälle auf (Hauser et al. 1990).
Bei der Krampfentstehung und –ausbreitung der TLE kommt es zu Läsionen im Hippokampus, in anderen Gehirnstrukturen des Temporallappen und in benachbarten Gehirnstrukturen. Zu den Gehirnstrukturen mit diesen Veränderungen gehören unter anderem der Mandelkern (Amygdala) und der entorhinale Cortex, der zur Hippokampus-Formation gezählt wird (Falconer et al. 1964; Margerison und Corsellis 1966; Yilmazer-Hanke et al. 2000). Die Neurodegeneration tritt am massivsten im Hippokampus auf und ist in anderen Gehirnregionen zwar beschrieben, allerdings wurde ihr bisher im Zusammenhang mit der TLE eher eine untergeordnete Rolle beigemessen. Seit einiger Zeit ist die Amygdala bei Patienten mit TLE ins Interesse der Forschung gerückt und wird intensiver erforscht (Cendes et al. 1993; Hudson et al. 1993; Wolf et al. 1997; Zentner 1999; Salmenpera et al.
2001). Die Untersuchungen der Amygdala bei Patienten mit TLE weisen, ähnlich wie im Hippokampus, massive Neuronenverluste auf. Eine weitere Gehirnregion, die zuerst in Tiermodellen für TLE näher untersucht wurde, ist der primäre olfaktorische bzw. piriforme Cortex. Der piriforme Cortex wies in tierexperimentellen Studien eine große Bedeutung bei der Krampfausbreitung auf (Engel et al. 1978; Kairiss et al.1984; Ackermann 1986; Ebert und Löscher 1995). Auch beim Menschen konnte eine Schädigung des piriformen Cortex nach einem SE nachgewiesen werden (Fujikawa et al. 2000a).
ÜBERSICHT
2.2 PHARMAKORESISTENZ
Die Pharmakotherapie mit Antiepileptika ist unverändert die bedeutendste Therapieform der Epilepsie. Trotz der optimalen täglichen Dosierung eines angemessenen Antiepileptikums und eines frühen Beginns einer pharmakologischen Therapie gibt es eine Reihe epileptischer Menschen und Tieren, die eine vollständige oder unvollständige Pharmakoresistenz entwickeln oder von vornherein aufweisen.
In der Humanmedizin mangelt es zwar an einer einheitlichen Definition der Pharmakoresistenz von Epilepsien, trotzdem geht man im allgemeinen davon aus, dass ein Patient als pharmakoresistent einzustufen ist, wenn bei angemessener Auswahl und ausreichend langer Testung von mindestens zwei Antiepileptika kein Therapieerfolg, definiert als Anfallsfreiheit oder mindestens 50%ige Reduktion der Anfallsfrequenz, erzielt werden kann (Regesta & Tanganelli, 1999, Kwan & Brodie, 2002). Basierend auf dieser Definition sprechen mehr als 30 % der Patienten mit Epilepsie nicht oder unzureichend auf eine adäquate Pharmakotherapie an (Regesta und Tanganelli 1999; Kwan und Brodie 2000).
Die Epilepsieform, die beim Erwachsenen am häufigsten als pharmakoresistent eingestuft wird, ist die TLE mit komplex fokalen Anfällen. Etwa 70 – 80% der Patienten mit TLE sprechen auf eine medikamentöse Therapie nicht oder nur unzureichend an (Leppik 1992). Bei diesen pharmakotherapieresistenten Menschen wird häufig ein chirurgischer Eingriff mit Entfernung des epileptischen (fokalen) Gewebes als einzige Option angesehen, Anfallsfreiheit zu erlangen. Der chirurgische Eingriff kann aber nur durchgeführt werden, wenn die Epilepsie auf einen fokalen Bereich zurückgeht, der gut identifiziert werden kann (Foldvary et al. 2001).
Weiterhin ist zu bedenken, dass trotz Entfernen des epileptischen Fokus die Pharmakotherapie bei den meisten Patienten fortgesetzt werden muss, um die Anfallsaktivität zu kontrollieren (Löscher und Schmidt 2002). Dies lässt auf die Hypothese schließen, dass durch den chirurgischen Eingriff nicht das komplette epileptische Netzwerk entfernt werden konnte, sondern nur der Teil, der für die Pharmakoresistenz verantwortlich war (Coulter et al. 2002).
ÜBERSICHT
In der Veterinärmedizin konnten in zwei prospektiven Studien, in denen die Wirkung von Phenobarbital und Primidon in der Dauertherapie der Epilepsie beim Hund geprüft wurde (Schwartz-Porsche et al. 1985; Riek et al. 2002), festgestellt werden, dass ähnlich wie in der Humanmedizin zwischen 20 - 40 % der Tiere pharmakoresistent sind (Löscher 2003). Bei 20 - 30 % der pharmakoresistenten Hunde kann durch eine zusätzliche Behandlung mit Kaliumbromid Anfallsfreiheit erzielt werden (Trepanier et al. 1998). Weiterhin verbleibt also immer noch eine große Zahl von Hunden, bei denen die epileptische Anfallsaktivität nicht ausreichend kontrolliert werden kann. Für Katzen wurden bisher keine vergleichbaren klinischen Studien zur Effektivität von Antiepileptika erhoben.
Die Entwicklung der Pharmakoresistenz kann begünstigt werden durch verschiedene Faktoren. Zu diesen Faktoren zählen Anfälle in dem ersten Lebensjahr, hohe Anfallsfrequenz vor der Pharmakotherapie, Zeitpunkt der Therapie, Fieberkrämpfe, die Art des Anfalls, Persistenz der Krampfaktivität während der Pharmakotherapie, Strukturveränderungen des Gehirns (s. Hippokampus-Sklerose), Gehirntumore, Fehlbildungen des Cortex und massive EEG-Veränderungen (Regesta und Tanganelli 1999).
2.2.1 Mechanismen der Pharmakoresistenz
Die Ursachen und die Mechanismen einer Pharmakoresistenz sind zur Zeit unbekannt, so dass es keine rationalen Ansätze zur Entwicklung neuer Antiepileptika mit besserer Wirkung gegen schwer behandelbare Epilepsien bei Tier und Mensch gibt. Es wird vermutet, dass es sich um einen multifaktoriellen Prozess handelt (Regesta und Tanganelli 1999; Löscher und Potschka 2002; Kwan und Brodie 2002).
Genetische, krankheitsbedingte und pharmakotherapiebedingte Faktoren könnten eine Rolle spielen (Löscher und Potschka 2002).
Genetische Faktoren, wie z.B. genetische Polymorphismen, könnten bedeutsam sein und erklären, warum zwei Patienten mit der gleichen Epilepsieform unterschiedlich gut auf die Pharmakotherapie reagieren. Außerdem gibt es einige
ÜBERSICHT
schwerbehandelbare epileptische Syndrome mit genetischem Hintergrund. Zu diesem Faktorenkomplex gehören bedingt auch ontogenetische Abnormalitäten bei der Hirnentwicklung (z.B. fokale corticale Dysplasie).
Als krankheitsbedingte Faktoren sind die Ätiologie der Epilepsie, das Fortschreiten der Anfallsaktivität unter der Pharmakotherapie, Veränderung der pharmakologischen Angriffspunkte, abnorme neuronale Verknüpfungen („epileptic circuitry”), die während der Epileptogenese entstehen, neurodegenerative Veränderungen im epileptischen Focus, kindling-ähnliche Pathomechanismen und Veränderungen der Antiepileptikaaufnahme durch die Blut-Hirn-Schranke zu nennen (Heinemann et al 1994; Regesta und Tanganelli 1999; Löscher und Potschka 2002).
Pharmakotherapiebedingte Faktoren sind häufig mitverantwortlich für einen unzureichenden Therapieerfolg. Dies kann darauf beruhen, dass die Effektivität des Antiepileptikums über den Therapiezeitraum abnimmt (z.B. Toleranzentwicklung).
Ferner kann es sein, dass das Wirkungsspektrum des gewählten Antiepileptikums für schwer behandelbare Anfallsformen nicht ausreicht (Löscher und Potschka 2002).
Die Hippokampus-Sklerose, Targetstrukturveränderungen und die Veränderung der Aufnahme von Antiepileptika im Gehirn (Multidrug-Transporter) werden im folgenden näher erläutert.
2.2.2 Hippokampus-Sklerose
Die Sklerosierung des Hippokampus wurde schon vor über 100 Jahren mit der am häufigsten pharmakoresistenten Epilepsieform, der TLE in Verbindung gebracht (Sommer 1880). Die Hippokampus-Sklerose geht mit einer Gliose und einer massiven Neurodegeneration von über 40 % in den Pyramidenzellschichten des Hippokampus (CA1 und CA3c) und im Hilus des Gyrus dentatus einher (Bratz 1899;
Margerison und Coresellis 1966). Dieses Muster der Neurodegeneration wird häufig bei der TLE gefunden (Stauder 1936; Margerison und Corsellis 1966; Cendes et al.
1993). Allerdings wird auch beschrieben, dass nur ca. 50 - 70% der Patienten mit
ÜBERSICHT
TLE Neurodegeneration im Hippokampus aufweisen (Bratz 1899; Margerison und Coresllis 1966).
Die Hippokampus-Sklerose zählt zu den neuropathologischen Veränderungen, die am häufigsten bei Patienten mit pharmakoresistenter Epilepsie beobachtet werden (Kwan und Brodie 2002). Retrospektive Studien haben ergeben, dass Patienten, die eine pharmakoresistente TLE nach einem primären Insult entwickeln, zu 90% der Fälle eine Hippokampus-Sklerose haben. Demgegenüber konnte nur bei 16% der pharmakoresistenten Temporallappenepileptiker ohne initialen Insult eine Hippokampus-Sklerose nachgewiesen werden (Mathern et al. 1995a und 1995b).
Dies lässt vermuten, dass die neuropathologischen Veränderungen entscheidend für den Pharmakotherapie-Erfolg sein könnten. Eine prospektive Studie von Stephen et al. (2001) bestätigte, dass Patienten mit einer Hippokampus-Sklerose in ihrer Studie die schlechtesten Aussichten auf einen Therapieerfolg hatten. Außerdem mussten die Patienten mit einer Hippokampus-Sklerose häufiger mit mehr als einem Antiepileptikum therapiert werden.
Durch pathologische Veränderungen des sklerosierten Hippokampus könnte das epileptische Netzwerk insofern beeinflusst werden, dass es zu einer Pharmakoresistenz kommt. So könnten z.B. Targetstrukturveränderungen (Kap.
2.2.3), Unterschiede in der Neurodegeneration und in der neuronalen Plastizität die Pharmakosensitivität beeinflussen. Eine Bedeutung der Hippokampus-Sklerose für die Pharmakoresistenz wird dadurch gestützt, dass durch chirurgische Entfernung des epileptischen Fokus die Pharmakotherapie bei den Patienten zwar fortgesetzt werden muss, um die Anfallsaktivität zu kontrollieren, aber keine Pharmakoresistenz mehr vorhanden ist. Somit ist davon auszugehen, dass bei der Resektion nicht das komplette epileptische Netzwerk entfernt wird, sondern nur das epileptische Gewebe, das für die Pharmakoresistenz verantwortlich war (Löscher und Schmidt 2002).
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CA3a CA1
Hilus
CA3c DG
Moosfasern
entorhinaler Cortex
Tractusperforans
Schaffer Kolla
terat en CA2
CA3a CA1
Hilus
CA3c DG
Moosfasern
entorhinaler Cortex
Tractusperforans
Schaffer Kolla
terat en CA2
entorhinaler Cortex
CA3a CA1
Hilus
CA3c DG
Moosfasern
entorhinaler Cortex
Tractusperforans
Schaffer Kolla
terat en CA2
CA3a CA1
Hilus
CA3c DG
Moosfasern
entorhinaler Cortex
Tractusperforans
Schaffer Kolla
terat en CA2
entorhinaler Cortex
Abb. 1: Schematische Darstellung des Hippokampus mit wichtigen Verschaltungen.
2.2.3 Targetstrukturveränderung
Die Veränderung der Angriffspunkte („Targets“) der Antiepileptika im epileptischen Gewebe könnte ein möglicher Mechanismus für Pharmakoresistenz sein. Zum einen konnte im epileptischen Gewebe eine Veränderung der GABA- und Glutamat- Rezeptoren in ihrer Zusammensetzung, Verteilung und Sensitivität gefunden werden (Kwan und Brodie 2002). Zum anderen konnte eine Veränderung der Eigenschaften von spannungsabhängigen Natriumkanälen bzw. Calciumkanälen im Hippokampus von Menschen mit pharmakoresistenter TLE nachgewiesen werden (s. auch Kap.
4.1.4; Beck et al. 1997; Beck et al. 1998; Reckziegel et al. 1998).
Die Antiepileptika erster Wahl zur Therapie der TLE, wie Carbamazepin und Phenytoin, wirken über eine Aktivitätsbeeinflussung dieser spannungsabhängigen Natrium- und Calciumkanäle. Kürzlich konnten Remy et al. (2003) an hippokampalem Gewebe von pharmakoresistenten TLE-Patienten einen vollständigen Wirkungsverlust von Carbamazepin auf spannungsabhängige Natriumkanäle feststellen. Dieser Befund konnte auch in einem chronischen Epilepsie-Modell (Kap. 2.3.2.2) beobachtet werden.
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2.2.4 Multidrug-Transporter
Gegen eine Targetstrukturveränderung als Mechanismus für Pharmakoresistenz spricht, dass die meisten pharmakoresistenten Epilepsiepatienten eine Pharmakoresistenz gegenüber mehreren, wenn nicht allen Antiepileptika besitzen (Regesta und Tanganelli 1999). Es ist sogar so, dass Patienten, die auf eine Monotherapie mit einem Antiepileptikum nicht ansprechen, eine nur 13 %ige Chance haben, ihre Anfälle mit einem weiteren Antiepileptikum unter Kontrolle zu bringen, auch wenn dieses einen völlig anderen Wirkungsmechanismus besitzt (Brodie und Kwan 2002). Dieses Faktum spricht für unspezifische Mechanismen, die an der Ausprägung der Pharmakoresistenz von Epilepsien beteiligt sind.
Eine neue Hypothese lässt vermuten, dass trotz ausreichend therapeutischem Wirkstoffgehalt eines Antiepileptikums im Blut die Wirkstoffkonzentration im Bereich der pathophysiologisch bzw. pathomorphologisch veränderten Gehirnregion zu niedrig ist (Abb. 3; Multidrug-Transporter-Hypothese).
Seit 30 Jahren ist in der Krebsforschung bekannt, dass Pharmakoresistenz durch Multidrug-Transporter wie P-Glykoprotein (PGP) verursacht werden kann (Juliano &
Ling 1976). Auch in der Epilepsieforschung gibt es Hinweise, dass Multidrug- Transporter durch gesteigerte Expression an der Blut-Hirn-Schranke die Konzentration von Antiepileptika im Bereich des epileptischen Fokus beschränken und so zu einer Pharmakoresistenz von Epilepsien beitragen (Löscher und Potschka 2002).
Pharmakologische Wirkstoffe müssen die natürlichen Barrieren des Gehirns, die Blut-Hirn- und die Blut-Liquor-Schranke passieren können, um ins Gehirn zu gelangen. Die Bluthirnschranke weist mehrere Barrierefunktionen auf, wie Tight Junctions zwischen den Endothelzellen, das Fehlen transzellulärer Passagemöglichkeiten und einen Mangel an pinozytotischen Transportvesikeln (Abb.
2; Kandel et al. 2000; Lee et al., 2001). Die funktionelle Konsequenz hieraus ist, dass die Endothelien der Gehirnkapillare passiv wie eine Phospholipidmembran agieren
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und so die Penetration von großen, hydrophilen, polaren bzw. proteingebundenen Substanzen verhindern. Im Gegensatz hierzu können unpolare, nicht-geladene, kleine oder lipophile Wirkstoffe die Barriere per Diffusion passieren oder über ein Carrier-System transportiert werden (Spector 2000). Die Barrierefunktion wird höchstwahrscheinlich durch eine um die Endothelzellen gelegene Basalmembran und dieser direkt anliegenden astrozytären Fortsätze intensiviert (Abb. 2).
Diese anatomische Barriere wird neben auswärtsgerichteten, carrier-vermittelten Transportsystemen durch ein aktives Effluxtransportsystem funktionell verstärkt, das Substanzen unter Energieverbrauch zurück ins Blut transportiert (Lee et al. 2001; de Boer et al. 2003). Zu diesem Effluxtransportersystem werden bestimmte Vertreter der ABC-Superfamilie (ATP-binding cassette superfamily) gezählt, wie der Multidrug- Transporter P-Glykoprotein (PGP/ABCB1) und bestimmte Vertreter der MRP-Familie (multidrug resistance-associated protein family /ABCC-Familie) (Lee et al. 2001, de Boer et al. 2003).
Abb. 2: Darstellung des Aufbaus einer Kapillare im allgemeinen im Vergleich zu der Blut-Hirn- Schranke. In der Blut-Hirn-Schranke sind die zwei dargestellten Endothelzellen mittels Tight Junctions verbunden. Die Endothelzellen werden umgeben von einer Basalmembran und von astrozytären Fortsätzen. (modifiziert nach Kandel et al. 2000)
Bl B l ut u t- -H Hi ir r n- n -S Sc ch hr ra an nk ke e
Astrozyt
Perizyt
Tight Junctions Blut
Transportvesikel- vesikel
Interzellularspalt Endothelzelle Fensterung
(mit intakter Basalmembran)
Blut
Kapillare (allgemein) Kapillare (Gehirn)
Mitochondrien Basalmembran
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Während sowohl beim Menschen als auch beim Hund eine Isoform von PGP existiert, die eine Funktion als Multidrug-Transporter aufweist und kodiert wird durch das Gen MDR1, sind beim Nager hierfür zwei Isoformen bekannt, die von den zwei Genen mdr1a und mdr1b kodiert werden (Schinkel 1999; Mealey et al. 2001). Die Gewebsverteilung dieser Proteine lässt vermuten, dass die beiden Nager-PGP- Isoformen gemeinsam die gleiche Funktion innehaben, wie die einzelne des Menschen (Schinkel 1999). Der Multidrug-Transporter PGP befördert Substanzen wie ein Staubsauger („vacuum cleaner“) unter ATP-Verbrauch aus der Zelle (Gottesman und Pastan 1993). Eine andere Hypothese über den Transportmechanismus ist, dass PGP wie eine Flippase die Substanzen von der inneren Membran zur äußeren transportiert (Higgins und Gottesman 1992). Die Substanzen diffundieren erst vom Zytoplasma in die Phospholipidmembran und werden dann aktiv in den Extrazellulärraum transportiert. Die einzigen strukturellen Gemeinsamkeiten der transportierten Substanzen sind der hydrophobe Charakter, die planare Struktur und eine Molekülgröße von mehr als 400 Da (Schinkel 1999, Seelig et al. 2000).
Neben der Blut-Hirn- und der Blut-Liquor-Schranke wird PGP in verschiedenen Organen exprimiert, wie z.B. Niere, Leber und Darm (Fromm 2000). Die physiologische Funktion der Multidrug-Transporter in diesen Organen ist die Ausscheidung körpereigener Substanzen, aber auch die Exkretion von Fremdstoffen, womit sie auch eine Schutzfunktion darstellen (Jette et al. 1995). Die Schutzfunktion von PGP in der Blut-Hirn-Schranke wurde von Schinkel et al. (1996 und 1997) an mdr1a (-/-) bzw. mdr1a (-/-) und mdr1b (-/-) Knockout-Mäusen bestätigt. Er stellte fest, dass die Tiere verstärkt lipophile pharmakologische Substanzen (z.B.
Ivermectin) ins Gehirn aufnahmen und somit Anzeichen von Neurotoxizität aufwiesen. Auch beim Hund kommt es bei bestimmten Rassen, Collie und American Shepherd, aufgrund eines genetischen Defekts von MDR1 zu einer Ivermectin- Überempfindlichkeit (Mealey et al. 2001, Nelson et al. 2003).
Die genaue Lokalisation von PGP in der Blut-Hirn-Schranke wird in der Literatur
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kontrovers diskutiert (Schinkel 1999; Golden und Pardridge 2000). Pardridge et al.
(1997) berichteten, dass PGP in den Endfüßen der Astrozyten, die die Gehirnkapillaren umgeben, exprimiert wird. Die vorherrschende Meinung dagegen ist, dass PGP in der luminalen, apikalen Membran der Endothelzellen der Gehirnkapillaren lokalisiert ist (Abb. 3; Schinkel 1999).
Im normalen menschlichen Gehirn kann die PGP-Expression in der Blut-Hirn- Schranke immunhistochemisch detektiert werden, aber nicht im Gehirnparenchym, d.h. nicht in Astrozyten oder Neuronen (Tischler et al.1995; Sisodiya et al. 2002).
Dagegen wurde in epileptischen Gewebe eine Expression von PGP, sowohl in Astrozyten als auch in Neuronen gefunden (Sisodiya et al. 2002; Aronica et al. 2003).
Die Multidrug-Transporter der MRP-Familie kommen in neun Subtypen vor (MRP1-9) (Kruh & Belinsky, 2003). Gemäß einer neuen Nomenklatur wird die MRP-Familie inzwischen als ABCC-Familie bezeichnet. Zur ABCC-Familie wurden weitere Transporter eingeordnet, und sie umfasst im Moment 13 Transporter (ABCC1-13) (www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/genefamily/abc.html). Sie funktionieren wie organische Anionen-Transporter, können aber auch neutrale und kationische organische Substanzen durch Bindung an das Transportmolekül Glutathion transportieren (Borst et al. 1999).
PGP und Vertreter der MRP-Familie haben eine überlappende Substratspezifität, d.h. einige pharmakologische Substanzen werden von beiden Multidrug-Transporter- Familien transportiert (Borst et al. 1999; Seelig et al. 2000). Wie PGP sind einzelne Vertreter der MRP-Familie in mehreren Organen und Geweben sowie in der Blut- Hirn- und Blut-Liquor-Schranke exprimiert (Borst et al. 1999). Dabei sind einige Vertreter der MRP-Familie, wie MRP2, in der apikalen Zellmembran polarer Zellen lokalisiert, andere dagegen wie MRP1 und MRP5 in der basolateralen Zellmembran (Borst et al., 1999).
Aufgrund der Lokalisation von MRP2 in der apikalen bzw. luminalen Membran
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polarer Zellen in der Blut-Hirn-Schranke sowie in verschiedenen Organen und Geweben wird vermutet, dass dieser Transporter auch eine ähnlich protektive Rolle wie PGP besitzt (Borst et al. 1999; Miller et al. 2000). Im Gegensatz zu MRP2 wird bei MRP1 eine Expression primär in Astrozyten und in der Blut-Liquor-Schranke beschrieben (Regina et al. 1998; Wijnholds et al. 2000; Decleves et al. 2000). MRP1 kann die Gehirnkonzentration eines Stoffes über seine Funktion an der Blut-Liquor- Schranke beeinflussen (Wijnholds et al. 2000).
Neben den beiden genannten MRP-Vertretern wurde MRP5 in endothelialen Zellen von Gehirnkapillaren verschiedener Spezies nachgewiesen (Zhang et al. 2000;
Dombrowski et al. 2001). Die Bedeutung dieses Transporters für die Barrierefunktion der Blut-Hirn-Schranke ist jedoch aufgrund seiner basolateralen Lokalisation in Endothelzellen umstritten.
Die Bedeutung von Multidrug-Transportern, wie PGP und MRPs, für die intrinsische bzw. erworbene Kreuzresistenz gegenüber verschiedenen Chemotherapeutika wird in der Krebsforschung seit langem untersucht (Bredel 2001). Angeregt von diesen Untersuchungen und durch den Nachweis von Multidrug-Transportern in der Blut- Hirn- und Blut-Liquor-Schranke begannen verschiedene Arbeitsgruppen die Pharmakoresistenz-Untersuchungen auf neurologische Erkrankungen (z.B.
Epilepsie) auszuweiten.
Tishler et al. (1995) untersuchten erstmals die Expression des Multidrug-Resistance Gens (MDR1) an Gehirnresektionspräparaten von epileptischen Patienten. Die RNA von PGP war vermehrt vorhanden bei Patienten, die an einer therapieresistenten Epilepsie litten. Bestätigend zu diesen Ergebnissen wurde eine verstärkte immunhistochemische Expression von PGP in Astrozyten und in Endothelien der Gehirnkapillaren gefunden. Weitere Expressionsstudien von Multidrug-Transportern wurde von Sisodiya et al. (1999, 2001, 2002) an Gehirngewebe von pharmakoresistenten Epilepsiepatienten mit spezifischen neuropathologischen Befunden durchgeführt, wie Hippokampus-Sklerose, dysembryoplastische
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neuroepitheliale Tumore und fokale corticale Dysplasie. Sie fanden vor allem eine Überexpression von PGP in Astrozyten und von MRP1 in Astrozyten und dysplastischen Neuronen. Erst kürzlich konnte PGP auch in dysplastischen Neuronen im Gehirngewebe von Epilepsiepatienten mit fokaler corticaler Dysplasie bzw. Gangliogliomen beobachtet werden (Aronica et al. 2003).
Interessanterweise konnte jüngst die Gruppe von Janigro im Gewebe von pharmakoresistenten Epilepsiepatienten neben einer glialen PGP-Überexpression eine solche in „normalen“ Neuronen detektieren (Cucullo et al. 2003). Die Neurone sahen normal aus und hatten keine Anzeichen eines Zelltodes. In einer weiteren Studie konnte mittels Bestimmung des mRNA-Gehalts eine Hochregulation von PGP, MRP2 und MRP5 in Endothelzellen aus reseziertem Gewebe von Patienten mit pharmakoresistenter Epilepsie nachgewiesen werden (Dombrowski et al. 2001).
Zusammenfassend geben die Untersuchungen Hinweise auf eine Überexpression von Multidrug-Transportern in der Blut-Hirn-Schranke als auch im Parenchym des Gehirns bei pharmakoresistenten Epilepsiepatienten. In der Tabelle 1 sind die Daten zusammengefasst dargestellt.
Eine ungeklärte Frage bleibt jedoch, ob die Überexpression von MDR1 und seinem Produkt PGP im Gehirn von pharmakoresistenten Epilepsiepatienten durch Epilepsie, unkontrollierte Anfälle, eine chronische Behandlung mit Antiepileptika oder eine Kombination dieser Faktoren verursacht wird. Tiermodelle könnten helfen, die einzelnen Faktoren näher zu untersuchen. Eine Reihe von tierexperimentellen Studien haben bisher untersucht, ob Anfälle eine Überexpression von PGP induzieren können. Zhang et al. (1999) fanden nach mit Kainat ausgelösten Krämpfen eine Induktion der Expression von PGP in reaktiven Astrozyten des Hippokampus bei der Ratte. Die verstärkte Expression von PGP konnte noch nach zehn Wochen nachgewiesen werden. Rizzi et al. (2002) fanden nach einem mit Kainat induzierten SE bei Mäusen einen transienten Konzentrationsanstieg der mRNA von mdr1 im Hippokampus. Die Arbeitsgruppe Löscher konnte auch im
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Kainat-Modell bei der Ratte einen transienten Anstieg der PGP-Expression im Hippokampus und in anderen limbischen Gehirnregionen sowohl in parenchymalen Zellen als auch in Endothelien der Blut-Hirn-Schranke nachweisen (Seegers et al.
2000a). Ferner war bei Ratten mit spontanen Anfällen der mdr1 mRNA Gehalt im Hippokampus und im entorhinalen Cortex erhöht (Rizzi et al., 2002). Im Gegensatz
Überexpression von Multidrug-Transportern in menschlichem epileptogenem Gehirngewebe
Überexpression in
Transporter
Endothelzellen Astrozyten Neuronen
Literatur
(PGP/MDR1) + + + Tishler et al. 1995
Sisodiya et al. 1999, 2001 und 2002
Dombrowski et al. 2001 Aronica et al. 2003 Cucullo et al. 2003
MRP1 - + + Sisodiya et al 2001 und 2002
Dombrowski et al. 2001
MRP2 + ? ? Dombrowski et al. 2001
MRP5 + ? ? Dombrowski et al. 2001
Tabelle 1: Überexpression von Multidrug-Transportern in menschlichem epileptogenem Gehirngewebe von pharmakoresistenten Epilepsiepatienten. Dargestellt sind die Expressionsdaten einzelner Multidrug-Transporter (PGP, MRP1, MRP2, MRP5) hinsichtlich ihrer Lokalisation im Gehirn. „?“ = keine Daten vorhanden.
zu den SE-Modellen konnte in einem Tiermodell für komplex-fokale Anfälle, dem Amygdala-Kindling Modell keine langanhaltende PGP-Überexpression im Hippokampus oder in anderen limbischen Gehirnregionen ein bis zwei Wochen nach
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et al. 2000 b).
Eine subchronische Behandlung mit Phenytoin induzierte keine Hochregulation von PGP im Hippokampus oder in anderen limbischen Gehirnregionen (Seegers et al.
2000c). Bei einer subchronischen Therapie mit Phenobarbital konnte im piriformen und parietalen Cortex nur ein leichter Anstieg der Intensität der PGP-markierten Fläche detektiert werden (Seegers et al. 2000c). Offen bleibt, ob eine Kombination von Epilepsie bzw. unkontrollierter Anfälle und Pharmakotherapie eine Überexpression von PGP auslösen kann, die höher ist, als die Expression kurz nach einem Anfall. Erste Hinweise gibt es, dass sich diese genannten Faktoren synergistisch auf die PGP-Expression verhalten (Wang et al. 2003). Die genannten Autoren konnten in einem neuen Anfallsmodell zeigen, dass die PGP-Expression bei behandelten Tieren (Carbamazepin, Phenytoin, Valproinsäure) mit Anfällen höher war als bei unbehandelten.
Die Überexpression im epileptischen Fokus von pharmakoresistenten Epilepsiepatienten könnte, wie in Abbildung 3 schematisch dargestellt, funktionelle Konsequenzen auf die Antiepileptikakonzentration im Gehirn haben.
Es wird angenommen, dass es durch die Überexpression der Multidrug-Transporter PGP und MRP2 in der luminalen Membran der Endothelzellen im Bereich des epileptischen Fokus von pharmakoresistenten Epilepsiepatienten zu einem verstärkt gefäßlumenwärts gerichteten Transport der Antiepileptika kommen kann (Abb. 3B);
d.h. die Wirkstoffkonzentration ist im Bereich der epileptischen Neuronen reduziert und die Krampfentstehung und –ausbreitung kann ungehindert voranschreiten. Für diese Hypothese müssen Antiepileptika Substrate von Multidrug-Transportern sein.
Es wird jedoch angenommen, dass Antiepileptika relativ schwache Substrate der Multidrug-Transporter sind, da Substanzen, die von PGP sehr effizient transportiert werden, wie z.B. Ivermectin (s. oben), fast keine Gehirngängigkeit aufweisen (Schinkel 1999). Ferner liegt die Molekülgröße von Antiepileptika unter 400 Da, d.h.
Antiepileptika sind keine idealen Substrate von PGP. Die Annahme für die Multidrug-
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Transporter-Hypothese ist daher, dass es erst zu einer funktionell relevanten Reduktion der Antiepileptikakonzentration im Parenchym des Gehirns kommen kann, wenn Multidrug-Transporter im epileptischen Fokus überexprimiert sind.
Abb. 3: Darstellung der Multidrug-Transporter-Hypothese der Pharmakoresistenz von Epilepsien. In „A“ ist die Expression von Multidrug-Transportern (MDT) unter physiologischen Bedingungen abgebildet. Die lipophilen Antiepileptika diffundieren durch die Blut-Hirn- Schranke (Pfeile). „B“ zeigt eine Überexpression von MDTs sowohl in Endothelien als auch in Astrozyten und Neuronen im epileptischen Fokus von Patienten mit pharmakoresistenter Epilepsie. Im Gegensatz zu „A“ werden die zuvor diffundierten Antiepileptika aktiv gefäßlumenwärts mittels MDT transportiert. Es kommt zu einer Reduktion der Wirkstoffkonzentration im Parenchym des Gehirns. (modifiziert nach Löscher und Potschka 2002)
Ferner weisen pharmakoresistente Epilepsiepatienten bei gleicher Dosierung die gleichen gehirnbedingten Nebenwirkungen auf wie pharmakosensitive Patienten.
Dies ist ein weiterer Hinweis auf eine Überexpression ausschließlich im Bereich des epileptischen Fokus.
A
Expression von MDT (normal)
B
Überexpression von MDT
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Die Überexpression von PGP in Astrozyten wurde von Sisodiya et al. (2002) vor allem im Bereich der Gefäße nachgewiesen. Sie postulierten, dass die PGP- Expression in den astrozytären Fortsätzen eine zweite Barriere zusätzlich zu der Blut-Hirn-Schranke bildet und so zu einer Limitierung der Antiepileptikakonzentration beitragen könnte. Bei anfalls-induzierter Erhöhung der Durchlässigkeit der Blut-Hirn- Schranke könnte diese zweite Barriere zu einer Wiederherstellung der Barrierefunktion dienen (Löscher und Potschka 2002).
In Neuronen könnte eine Überexpression von Multidrug-Transportern in der Zellmembran zu einer Reduktion der Antiepileptikakonzentration im Zellinneren führen. Hierdurch könnte die Wirkung des Antiepileptikums an intrazellulären Zielstrukturen vermindert sein.
Verschiedene Antiepileptika werden von den Multidrug-Transportern PGP (Tabelle 2) und/oder von MRPs, wie MRP2, transportiert (Tabelle 3). Bisher werden mindestens drei Strategien zur Aufklärung des Transports der einzelnen Antiepileptika verwendet. Einerseits verwendet man spezifische Inhibitoren dieser Transporter, zum anderen Zelllinien mit Überexpression eines dieser Transporter oder transporter- defiziente Tiere (Mäuse bzw. Ratten).
Die Transporterhemmstoffe können in intrazerebralen Mikrodialyse-Studien freibeweglicher Nager benutzt werden. Hierfür wird den Tieren in jede Hemisphäre eine Mikrodialyse-Sonde implantiert. Die eine Sonde dient als Kontrollsonde, die nur mit einer Ringerlösung durchspült wird. Die Sonde in der anderen Hemisphäre wird zusätzlich mit einem Hemmstoff beladen. Das systemisch applizierte Antiepileptikum wird im Dialysat beider Sonden analysiert und die Konzentrationen miteinander verglichen.
Neben Zelllinien mit einer Überexpression von Multidrug-Transportern werden transporter-defiziente Nager verwendet. In der Literatur findet man vor allem den Einsatz von knock-out Mäusen, bei denen entweder eines oder mehrere dieser
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Transportermoleküle funktionell ausgeschaltet wurden. Zum anderen werden Nager- Mutanten verwendet, wie die MRP2-defiziente TR--Ratte (transporter-negative Ratte). Der TR--Ratte fehlt aufgrund eines natürlichen Gendefektes eine funktionelle Form von MRP2 (Paulusma et al. 1996). Die knock-out Mäuse bzw. die Nager- Mutanten werden hinsichtlich der Gehirngängigkeit der einzelnen Antiepileptika mit dem jeweiligen Hintergrundstamm verglichen.
Transport von Antiepileptika durch PGP
In-vivo In-vitro Antiepileptikum
Mikrodialyse (Inhibitoren)
KO-Mäuse Zellkultur Literatur Phenytoin
+ (+) +
Tishler et al. 1995 Schinkel et al. 1996 Potschka et al. 2001a Rizzi et al. 2002
Carbamazepin + (+) - Potschka et al. 2001b Owen et al. 2001
Phenobarbital + ? ? Potschka et al. 2002b
Lamotrigin + ? ? Potschka et al. 2002b
Felbamat + ? ? Potschka et al. 2002b
Topiramat ? + ? Sills et al. 2002
Levetiracetam - ? ? Potschka et al. 2004 Tabelle 2: Transport von Antiepileptika durch PGP. Neben In-vitro- sind auch In-Vivo-Daten dargestellt, die mit der Mikrodialyse-Technik an Nagern oder durch Knock-out Mäuse (KO- Mäuse) ermittelt wurden. (+)=Datenlage nicht eindeutig; „?“ = keine Daten vorhanden.
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Transport von Antiepileptika durch MRP
In-vivo In-vitro Antiepileptikum
Mikrodialyse (Inhibitoren)
TR- (MRP2-)
Ratten Zellkultur Literatur
Phenytoin + + ? Potschka et al. 2001c
Potschka et al. 2003a
Carbamazepin + (+) ? Potschka et al. 2001b Potschka et al. 2003b
Phenobarbital - - ? Potschka et al. 2003a
Valproinsäure + ? + Frey und Löscher 1978
Huai-Yun et al. 1998 Scism et al. 1999
Lamotrigin ? - ? Potschka et al. 2003b
Felbamat ? - ? Potschka et al. 2003b
Levetiracetam - ? ? Potschka et al. 2004
Tabelle 3: Transport von Antiepileptika durch MRP. Dargestellt sind In-vitro- und In-Vivo-Daten im Vergleich zueinander. Für die Gewinnung der In-Vivo-Daten wurde einerseits die Mikrodialyse-Technik an Nagern und andererseits MRP2-defiziente Ratten verwendet.
(+)=Datenlage nicht eindeutig; „?“ = keine Daten vorhanden.
Die Multidrug-Transporter-Hypothese könnte ebenso für die Tiermedizin eine Erklärung für die in der Klinik auftretenden pharmakoresistenten Epilepsiepatienten (Hund und Katze) sein. Bisher gibt es an diesen Tierarten noch keine Expressionsstudien an epileptischem Gewebe.
2.3 TIERMODELLE
Tiermodelle sind für die Epilepsieforschung unabdingbar, da die meisten Versuche an Menschen nicht durchgeführt werden können. Dies hat zum einen ethische, zum anderen versuchstechnische Gründe, wie Mangel an Kontrollen (z.B.:
Kontrollgewebe) oder eine zu großen Varianz innerhalb der Testgruppe.
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Tiermodelle sollten die Symptome bzw. die Pathogenese der zu untersuchenden Krankheit reflektieren und prädiktiv für die klinische Wirksamkeit von Arzneimitteln sein. Bei Erkrankungen ohne eindeutige Pathogenese, wie den Epilepsien, können nur Tiermodelle verwendet werden, die die Symptome der Erkrankung widerspiegeln.
Dabei können verschiedene Modelltypen unterschieden werden.
Einerseits gibt es die Anfallsmodelle, bei denen akut durch elektrische oder chemische Induktion ein epileptischer Anfall ausgelöst wird, wobei ohne Induktion keine Anfälle auftreten. Andererseits sind die Epilepsie-Modelle zu nennen, bei denen die Tiere durch einen chemischen oder elektrisch-induzierten Insult nach einer gewissen Zeit (Latenzzeit) spontan epileptische Anfälle entwickeln; d.h. diese Tiere sind nach einer Latenzzeit chronisch krank bzw. epileptisch geworden. Diese Epilepsie-Modelle stellen die klinische Situation nach, bei der Menschen z.B. durch ein Schädel-Hirn-Trauma oder in Folge eines SE TLE entwickeln. Tierexperimentelle Modelle, bei denen ein SE ausgelöst wird, können als SE-Modell und als Post-SE- Modell verwendet werden und bieten somit die Möglichkeit, den SE und die Epileptogenese, also den Krankheitsprozess bis zur Manifestation der Epilepsie, sowie den Krankheitskomplex der Epilepsie an sich zu untersuchen. Ein weiteres tierexperimentelles Modell für Epilepsie ist das Kindling-Modell, bei dem durch wiederholte elektrische Stimulation epileptische Anfälle ausgelöst werden, die zu chronischen Gehirnveränderungen führen (Kap. 2.3.1.1). Spontane epileptische Anfälle können im Kindling-Modell nach ausreichend häufiger elektrischer Stimulation bei gekindelten Ratten (im Mittel ca. 200 Stimulationen) auftreten (Pinel und Rover 1978, Brandt 2002).
Trotz einer großen Anzahl von Antiepileptika ist eine erfolgreiche Therapie der TLE oft schwer oder überhaupt nicht zu erreichen. Dieser „Therapienotstand“ kann darauf begründet sein, dass neue Substanzen häufig anhand von Tiermodellen getestet werden, die für andere Anfallsformen prädiktiv sind (Löscher 1986; Löscher und Schmidt 1988). Die zwei wichtigsten Tiermodelle sind der „Maximale-Elektroschock- Test“, bei dem akut ein primär generalisierter tonisch-klonischer Anfall durch
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elektrische Korneal-Stimulation ausgelöst wird, und der „Pentylentetrazoltest“, der durch Verabreichung einer bestimmten Menge von Pentylentetrazol akut Myoklonien und klonische Krämpfe auslöst. Die zu testenden Substanzen werden auf ihre antikonvulsive Wirkung geprüft.
Die genannten Tiermodelle sind nicht geeignet, die pathophysiologischen Mechanismen der Epileptogenese zu untersuchen. Sie können lediglich zur Erforschung von akuten Anfällen dienen (Löscher 1997). Die Mechanismen der Pharmakoresistenz und der Epileptogenese für komplex-fokale Anfälle lassen sich mittels genetischer Modelle (z.B. epileptische Hunde [Löscher 1997]), chemischer Tiermodelle (z.B. Kainsäure [Ben-Ari et al. 1981] und Pilocarpin [Honchar et al.
1983]) und mit dem Kindling-Modell (Goddard et al. 1969) untersuchen.
2.3.1 Elektrische Epilepsiemodell 2.3.1.1 Amygdala-Kindling Modell
Im Jahre 1969 wurde von der Arbeitsgruppe des experimentellen Psychologen Graham Goddard das Kindling-Modell beschrieben, das ursprünglich entwickelt wurde, um das Lernverhalten durch subkonvulsive elektrische Stimuli zu beeinflussen. Die wiederholten subkonvulsiven elektrischen Stimulationen über die unilaterale Reiz- und Ableitelektrode im Bereich des limbischen Systems führten zu epileptischen Anfällen, die bei weiteren Stimulationen schnell an Schwere und Dauer zunahmen (Goddard et al. 1969). Der Begriff „Kindling“ („to kindle“: entflammen) beinhaltet heute einerseits den fortschreitenden Prozess der Epileptogenese, andererseits den permanenten Zustand einer erhöhten Anfallsbereitschaft. Die Empfindlichkeit des Gehirns auf den Stimulus nimmt fortlaufend bis zu einem bestimmten Zeitpunkt zu, an dem der erhöhte Grad der Empfindlichkeit permanent geworden ist. Die Tiere gelten zu diesem Zeitpunkt als „vollgekindelt“ (McNamara 1984).
Die Arbeitsgruppe Löscher schlug schon 1986 vor, dass das Amygdala-Kindling Modell ein Modell für die Untersuchung der Mechanismen von Pharmakoresistenz
