4 Material und Methoden
4.3 Chirurgische Vorgehensweise
4.3.3 Perfusion und Explantation
Bei den 15 Tieren der Versuchsgruppe I (Kontrollgruppe) erfolgte acht Wochen nach Implantation die intravitale Perfusion und Organentnahme. Durch diese Vorgehensweise war es möglich, Schädigungsmuster durch die Insertion sowie die Gewebeverträglichkeit der Implantate zu beurteilen.
Die Versuchstiere wurden hierfür mit Ketamin und Xylazin i. m. in einer subletalen Dosis narkotisiert. Die Kutis wurde im Bereich des thorakoabdominalen Übergangs über 3 cm quer inzidiert und die abdominelle Muskulatur etwa 1 cm kaudal des Processus xiphoideus angehoben. Anschließend wurde mit einem Transversalschnitt die Bauchhöhle eröffnet und unter Schonung der abdominellen Organe die Laparotomie nach beiden Seiten erweitert.
Die Thorakotomie erfolgte durch die Spaltung des Processus xiphoideus und des Sternums. Nach Einlage eines Wundspreizers wurde das Herz aufgesucht, im apikalen Drittel erfasst und eine Perfusornadel unter Sicht in den linken Ventrikel des Herzens eingeführt. Die Eröffnung des Blutkreislaufs erfolgte schließlich durch die Durchtrennung der Vena cava inferior.
Über die liegende, mittels einer Klemme fixierte und abgedichtete Perfusornadel wurden die Tiere mit einer vorbereiteten Perfusionslösung (250 ml NaCl 0,9 %, 5.000 IE Heparin, 1 ml Mepivacain 2 %) mit einem Druck zwischen 120 und 150 mmHg perfundiert. Während Heparin die Blutgerinnung hemmt, bewirkt Mepivacain eine Vasodilatation und verbessert so die Perfusion. Daran anschließend erfolgte mit dem gleichen Druck die Perfusion mit 4-prozentiger Formalinlösung in Phosphatpuffer (pH 7,3).
Eine gelungene intravitale Perfusion war anhand folgender vier Merkmale erkennbar:
• Abblassung von Leber und Darm,
• Abblassung der Konjunktiven,
• Faszikulation der Muskulatur mit dem Beginn der Perfusion mit Formalin,
• irreversible Kontraktur der Muskulatur nach Abschluss der Perfusion.
Nach der Perfusion wurden die Haut am Hals kragenförmig abpräpariert, die zervikale Muskulatur und die Weichteile des Halses durchtrennt und der Kopf auf Höhe von HWK 3 mit einer Schere abgesetzt. Das Kopfpräparat wurde mindestens für fünf Tage bei 4 °C fixiert. Durch die primär intrakranielle Fixation des Gehirns konnte das Auftreten von Artefakten aufgrund von Druck auf nicht fixiertes Hirngewebe (erkennbar an dunklen, geschrumpften Neuronen im histologischen Schnitt[131, 132]
) verhindert werden. Ferner konnte durch diese Art der Lagerung des Kopfes die Fixierlösung einen großen Teil des Gewebes durchtränken, wodurch die weitere Präparation erleichtert wurde.
Im Anschluss an die intrakranielle Fixation wurde die Haut vom Nacken aus bis zur Nase in der Mittellinie durchtrennt und stumpf vom Kopf abpräpariert. Nach Abschieben der autochthonen Nackenmuskulatur und der Musculi temporales wurde mit einer kleinen Trennscheibe die Schädeldecke vom Foramen magnum ausgehend zirkulär aufgesägt und mittels einer Knochenzange okzipital abgehoben. Am freigelegten Gehirn wurden rostral die Riechkolben und kaudal das Cerebellum einschließlich des Hirnstamms abgesetzt. Mittels einer Mikroschere wurden die Hirnnerven II und V an der Schädelbasis durchtrennt. Das so mobilisierte und isolierte Gehirn wurde für mindestens 10 Tage in 4-prozentiger Formalinlösung nachfixiert.
4.4 Stimulation
4.4.1 Aufbau
Für die elektrische Reizung mittels neuroelektrischer Schnittstellen wurden Stimulatoren verwendet, wie sie auch bei auditorischen Hirnstamm-Implantaten (Auditory Brainstem Implant; ABI) zum Einsatz kommen.
Grundlegend ist der technische Aufbau des ABI, mit Ausnahme des Designs der aktiven Elektrode (Stimulationselektrode), identisch mit dem des Cochlear Implant.
Die aktive Elektrode wurde in der vorliegenden experimentellen Versuchsreihe den anatomischen Gegebenheiten der Ratte und der chirurgischen Handhabbarkeit angepasst (vgl. Kapitel 4.1 Elektrodendesign).
Kapitel 4 Material und Methoden
42 4.4.2 Stimulator
Die Dauerstimulation wurde bei der vorliegenden tierexperimentellen Versuchsreihe mit einer speziell angepassten Version des CIS-PRO Sprachstimulators der Firma MED-EL durchgeführt. Bei einer maximalen Stimulationsfrequenz von ca. 12.100 Hz war dieser in der Lage, ladungsbalancierte, biphasische Pulse mit einer Pulsbreite zwischen 40 bis 637.5 µs zu liefern.
Die hier verwendeten neuroelektrischen Schnittstellen waren durch eine relativ geringe effektive Elektrodenfläche (140⋅10-5 cm2) und damit einhergehend mit einem hohen Gewebewiderstand (Impedanz) im implantierten Zustand gekennzeichnet. Da herkömmliche Sprachstimulatoren mit einer Betriebsspannung von 3 V arbeiten, würden diese bei einer Impedanz von 30 kΩ und einer Reizstärke von 100 µA bereits in eine vorzeitige Sättigung (hier: Erreichen des maximalen Reizstroms vor Auftreten einer messbaren Schädigung) gehen. Durch Einspeisung einer zusätzlichen externen Stromquelle konnte die Betriebsspannung bei dem hier verwendeten Stimulator auf 13 V erhöht und eine vorzeitige Sättigung der Implantate vermieden werden. Ferner war es hierdurch möglich, die für die Bestimmung der Schädigungsschwellen erforderlichen Ladungsdichten bereitzustellen (vgl. Abb. 24).
Abb. 24 Maximal möglicher Stimulationsstrom in Abhängigkeit von der Impedanz.
links: ABI-Sprachstimulator der Firma MED-EL (CIS-PRO); rechts: für die Versuchreihe angepasster Sprachstimulator. Bei einer Impedanz von 30 kΩ geht der kommerzielle Stimulator bereits bei einer Reizstärke von 100 µA in Sättigung, der hier verwendete Stimulator mit zusätzlicher Einspeisung von 13 V aber erst bei über 300 µA.
4.4.3 Impedanzen
Um morphologische Schädigungsmuster als Reaktion auf die elektrische Dauerstimulation klassifizieren zu können, sollte in diesen Untersuchungen eine ausreichend große Ladung pro Phase transportiert werden. In der vorliegenden Versuchsanordnung war die Stimulationselektrode physikalisch als Festkörper-Elektrolyt-Übergang anzusehen. Die bei der Stimulation übertragene Ladung pro Phase war durch die relativ geringe effektive Elektrodenfläche (140⋅10-5 cm2) und dem damit verbundenen hohen Übergangswiderstand zum Gewebe limitiert.
An verschiedenen Abschnitten der experimentellen Versuchsreihe (prä- und postoperativ sowie prä- als auch poststimulativ) wurde daher die Impedanz, d. h. der Übergangswiderstand zwischen Elektrode und Gewebe bei einer Messfrequenz von 10 kHz bestimmt. Dabei kamen sowohl direkte als auch telemetrische Methoden zur Anwendung.
4.4.4 Stimulationsablauf
Zur Klassifizierung der Gewebeschädigungen und zur Ermittlung der Schädigungsschwellen als Reaktion auf die elektrische Tiefenhirnstimulation erfolgte bei jeweils 12 bzw. 11 Tieren der Versuchsgruppen II und III eine 6-stündige Dauerstimulation mit „maximalen“ (300 µA) bzw. „halbmaximalen“ Reizstärken (150 µA).
Unter Ketaminnarkose wurde zunächst die subkutane Steckverbindung über eine kleine Hautinzision freigelegt und die Impedanz gemessen. Die elektrische Stimulation wurde hiernach für jeweils sechs Stunden mit einer hohen Pulswiederholrate von 1500 Hz durchgeführt. Dieser Wert ergab sich aus der maximal möglichen Stimulationsfrequenz des MED-EL Implantates (ca. 18000 Hz) dividiert durch die Anzahl der Stimulationskanäle (12). Dieser Wert liegt daher auch an der oberen Frequenzgrenze eines achtkanaligen ABI-Systems. Dadurch wurde die Voraussetzung für eine praxisrelevante Aussage zu morphologischen Schädigungsschwellen nach möglicher Implantation solcher Systeme im Hirnparenchym beim Menschen geschaffen.
Durch Kopplung über den achtkanaligen CIS-PRO Stimulator war es auch möglich, gleichzeitig mehrere Tiere über ein Ein-Kanal-Implantat mit den gleichen Reizparametern zu stimulieren (vgl. Abb. 25).
Kapitel 4 Material und Methoden
44
Abb. 25 Experimenteller Aufbau der elektrischen Stimulation mit Insertionselektroden Im Vordergund sieht man ein halbautomatisches, programmierbares Impedanzmessgerät. Die beiden Versuchstiere sind an den modifizierten Sprachstimulator angeschlossen, der über das Notebook programmiert und über die im Hintergrund rechts sichtbare Spannungsquelle geboostert wurde.
Die Pulsbreite (Reizphasendauer) wurde auf 50 µs festgesetzt. Bei einer geometrischen Oberfläche der hier verwendeten Elektroden von 4.56⋅10-5 cm2 war es somit für unterschiedliche Reizstärken jederzeit möglich, die Gesamtladung pro Phase (Q, Abb. 26) und die mit der Oberfläche der Elektrode korrelierende Ladungsdichte (D, Abb. 27) zu bestimmen. Wie oben bereits beschrieben wurden gerade diese beiden physikalischen Parameter für eine neuronale Schädigung als Reaktion auf die elektrische Stimulation im ZNS als besonders relevant erkannt[28].
Abb. 26 Zusammenhang zwischen Ladung und Strom
Übertragene Ladung in Abhängigkeit vom Strom für verschiedene Phasendauern (d).
Abb. 27 Zusammenhang zwischen geometrischer Ladungsdichte und Ladung
Geometrische Ladungsdichte (D) für die Fläche der verwendeten Insertionselektrode von 4.56⋅10-5cm2 in Abhängigkeit von der Ladung.
Für die maximale Stimulation mit 300 µA (Gruppe III) betrug die Ladung/Phase (Q) 15 nC und die Ladungsdichte (D) 328 µC/Phase/cm2. Die halbmaximale Stimulation in Gruppe II mit 150 µA wies eine Ladung/Phase von 7.5 nC und eine Ladungsdichte von 164 µC/cm2 auf (vgl. Tab. 3).
Versuchsgruppen
Gruppe I Nicht stimulierte Elektrodenträger (Kontrollgruppe)
Gruppe II Elektrodenträger mit
halbmaximaler Reizstärke
Gruppe III Elektrodenträger mit
maximaler Reizstärke
Anzahl der Tiere 15 12 11
Dauer der Implantation 8 Wochen 8 Wochen 8 Wochen
Stimulationsdauer [h] - 6 6
Stimulationsstrom [µA] - 150 300
Phasendauer [µs] - 50 50
Frequenz [Hz] - 1500 1500
Ladungsdichte [µC/cm2] - 164 328
Gesamtladung [nC] - 7.5 15
Tab. 3 Stimulationsparameter für die einzelnen Versuchsgruppen
Tabellarische Übersicht der Versuchsgruppen mit den für die Einteilung beschriebenen Stimulationsparametern.
Nach Beendigung der 6-stündigen Stimulation wurden die Tiere dieser beiden Gruppen ebenfalls intravital nach der oben beschriebenen Methode perfundiert und der histologischen und histomorphometrischen Analyse zugeführt.
Kapitel 4 Material und Methoden
46
4.5 Histologie
Die histologische Untersuchung der Versuchspräparate diente dazu, die Biokompatibilität der neuartigen Elektrodenträger und der Tiefenstimulation anhand einer modifizierten Klassifikation („damage score“[32, 56]) zu charakterisieren. Dabei wurden Schädigungsmuster erwartet, die sich in folgende Kategorien differenzieren ließen:
• Mechanische Schädigungen (Blutungen, Kompression, Herniation),
• Entzündungs- und Fremdkörperreaktionen (Makrophagen, Leukozyten, Gliose, Enkapsulation, Ödem, Vakuolisierung) sowie
• Neuronale Schädigungen (Neuronendichte / “kill zone“[56] [vgl. Kap. 1.6, Histomorphometrie]; Zellform, Zellgröße, Organisation im Zellverband).
Anhand der Ergebnisse wurde eine Graduierung der Schädigung vorgenommen.
Außerdem wurde die elektrische Schwelle für charakteristische morphologische Schädigungsmuster durch die Stimulation mit Tiefenelektroden definiert.
Zu diesem Zweck wurden die Hirne sämtlicher Versuchstiere zunächst für mindestens 10 Tage in einer vierprozentigen Formalinlösung nachfixiert. Noch bevor die Entwässerung der Präparate in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70 % - 70 % - 90 % - 100 % - 100 %) über Nacht erfolgte, wurden die Gehirne zu einem Gewebeblock reduziert, der die Großhirnrinde beidseits einschloss. Anschließend wurden die so präparierten Gewebeblöcke in Paraffin eingegossen.
Mit einem Schlittenmikrotom (Feather Microtome®, Feather Corporation USA) wurden axiale Schnitte mit einer Schichtdicke von 5 µm im Bereich des Elektroden-Stichkanals angefertigt. Jeweils zwei Schnitte wurden auf Objektträger aufgezogen, die zur besseren Haftung mit einer Poly-L-Lysin-Beschichtung versehen waren (100 ml Poly-L-Lysin 0,1 % in 900 ml Aqua bidest, 60 °C).
Nach einer standardisierten Reihenfolge wurden benachbarte Schnitte mittels verschiedener histochemischer und immunhistochemischer Methoden (HE, Trichrom, Thionin, und GFAP) gefärbt. Alle vier Färbungen wurden bei jedem Präparat jeweils über die gesamte Länge des Stichkanals angewendet und anschließend unter dem Lichtmikroskop (Olympus BX50) qualitativ beurteilt. Anhand der oben erwähnten Schädigungsmuster war es möglich, den Bereich der Stimulation bzw. des
Stimulationskontakts einzugrenzen und histomorphometrisch zu charakterisieren (vgl. Kap. 4.6 Histomorphometrie).
4.5.1 Verwendete Lösungen und Puffer
Im Rahmen der hier durchgeführten Versuchsanordnungen wurden folgende Lösungen und Puffer verwendet:
1. Saures Hämalaun nach Meyer[133]
1 g Hämatoxilin 0,2 g Natriumjodatin 50 g Chloralhydrat
1 g kristalline Zitronensäure 50 g Kalialaun in 1 l Aquadest 2. Eosin-Lösung
40 ml Eosinstammlösung 40 ml 100 % Alkohol 160 ml Aqua dest.
2 Tropfen Eisessig
3. Eisenhämatoxylin nach Weigert[134, 135]
Erste Stammlösung (A) 10 g kristallinem Hämatoxil 1.000 ml 100 % Ethanol 40 ml Aqua dest.
vierwöchige Reifung Zweite Stammlösung (B)
11,6 g Eisen-(III)-chloridhexahydrat 980 ml Aqua dest.
10 ml 25 % HCl 4. Säurefuchsin
Stammlösung A 10 g Säurefuchsin 5 ml Eisessig
Kapitel 4 Material und Methoden
48 1.000 ml Aqua dest.
Stammlösung B
10 g Pouceau de Xylidine 10 ml Eisessig
1.000 ml Aqua dest.
5. Anilinblaulösung 2,5 g Anilinblau 2,5 ml Eisessig 100 ml Aqua dest.
6. Wolframsäure
1 %; hier: 2,5 g Wolfram auf 2,5 l Aqua dest.
7. Thionin
0,1 %; hier: 100 mg Thionin-acetat auf 100 ml Aqua dest.
8. Lithiumcarbonat (Li2CO3)
0,05 %; hier: 150 mg in 300 ml Aqua dest.
9. Wasserstoffperoxid (H2O2)
3 %; hier: 20 ml 30 % H2O2 in 180 ml Methanol lösen 10. Tris-Puffer
6,1 g Tris-Base 37 ml 1 N HCl
mit Aqua dest auf 1 l auffüllen pH-Wert: 7,6 ± 0,2
11. Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) 100 ml Tris-Puffer
900 ml 0,85 % NaCl
mit Aqua dest auf 1 l auffüllen pH-Wert: 7,6 ± 0,2
12. Citratpufferlösung 1,92 g Natriumcitrat
mit Aqua dest. auf 1 l auffüllen pH-Wert: 6,0
13. DAB-Substatlösung 500 µl DAB (-20 °C) 500 µl TBS
20 µl 1 % H2O2
Sofern nicht anders angegeben wurden die Chemikalien von den Firmen Fluka, Merck, Pharmacia, Promega, Riedel de Häen und Sigma bezogen,.
4.5.2 Histochemische Färbungen
Im Rahmen der hier durchgeführten Versuchsanordnungen fanden insgesamt vier verschiedene histochemische Färbungen Anwendung, welche im Folgenden näher erläutert werden.
4.5.2.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Durch Hämatoxylin lässt sich das Zytoplasma und das Bindegewebe rosa bis rot darstellen, während Eosin für eine scharfe, blauviolette Kernfärbung sorgt. Darüber hinaus ist es mit Hilfe dieser Färbemethode möglich, Zelleinschlüsse als Kerndegenerationsprodukte (Hämatoxylinkörperchen) darzustellen[136, 137]
. Diese Eigenschaften sprachen für die Aufnahme dieser klassischen Übersichtsfärbung zur Charakterisierung einer Gewebeschädigung durch elektrische Stimulation.
Bei der Färbung erfolgte zunächst die Entparaffinierung der Schnitte mit Xylol für 10 Minuten und anschließend mit Xylol und 100-prozentigem Ethanol (Verhältnis 1:1). Zum Abschluss wurden die Schnitte mittels einer absteigenden Alkoholreihe (100 % - 100 % - 90 % - 70 % - 70 %) nachbehandelt.
Die entparaffinierten Schnitte wurden für 5 Minuten in saures Hämalaun nach Meyer[133] immergiert. Hieran schloss sich nach kurzer Waschung das 15-minütige Bläuen in 0,25-prozentiger Natriumhydrogencarbonatlösung an.
Kapitel 4 Material und Methoden
50 Es folgte die Einlage in 1-prozentiger Eosin-Lösung sowie in 70-prozentigem Ethanol für jeweils 1 Minute. Nachdem der Farbstoff auf das Gewebe aufgezogen war, wurden die Schnitte kurz in Wasser gespült und anschließend in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert und in n-Buthyl endfixiert. Das Eindecken der fertig gefärbten Präparate erfolgte schließlich mit Corbit.
4.5.2.2 Trichrom-Färbung
Mit dieser Färbung erscheinen die Kerne somatischer Zellen braun. Das die Penetration umgebende Gewebe erhält durch die Trichrom-Färbung einen bläulichen Grundton, aus dem Erythrozyten orangegelb hervorstechen. Aufgrund dieser Farbeigenschaft lassen sich insertionsbedingte Hämorrhagien leicht unterscheiden und somit qualitativ verifizieren[135].
Zur Kolorierung mit Trichrom wurden die Schnitte ebenfalls nach dem oben beschriebenen Verfahren mittels Xylol für 10 Minuten und anschließend in einem Verhältnis von 1:1 mit 100-prozentigem Ethanol entparaffiniert. Im Anschluss an die Nachbehandlung der Objektträger durch eine absteigende Alkoholreihe erfolgte eine Eisenhämatoxylinfärbung nach Weigert[134, 135]. Die dabei verwendeten Stammlösungen wurden im Verhältnis 1:1 gemischt und filtriert.
Mit diesen Lösungen erfolgte das Bläuen der Schnitte in warmem Wasser für jeweils 5 Minuten, mit einer einminütigen Zwischeneinlage in 0,5-prozentiger Essigsäure. Es schloss sich eine Fuchsinfärbung über einen Zeitraum von 5 Minuten an. Darauf folgend wurden die Schnitte kurz in destilliertem Wasser gewaschen und für 10 Minuten in 1-prozentiger Wolframsäure eingelegt. Nach einer erneuten Spülung in 0,5-prozentiger Essigsäure erfolgte die Färbung der Schnitte in Anilinblau für 1 Minute.
Die gefärbten Objektträger wurden hieran für 10 Minuten in Essigsäure immergiert, anschließend kurz in Wasser gespült, entwässert und in n-Buthyl endfixiert. Das Eindeckeln erfolgte ebenfalls mit Corbit.
4.5.2.3 Thionin-Färbung
Mit dieser Färbung werden die Zellkerne und die im Perikaryon befindlichen Nissl-Schollen violett gefärbt. Die Nervenzellen an sich erscheinen insgesamt schwach
blau, wohingegen das umgebende Nervengewebe farblos verbleibt. Diese Besonderheit der Thionin-Färbung (Synonym: „Nissl-Färbung“[134]) prädestiniert sie zur quantitativen Bestimmung der Neuronendichte um den Stichkanal (vgl. Kap. 1.6 Histomorphometrie).
Die Schnitte wurden hierzu nach Entparaffinierung und Nachbehandlung in einer absteigenden Alkoholreihe für 15 Minuten in 0,1-prozentiger Thioninlösung gefärbt.
Anschließend erfolgte kurz das Abspülen der frisch gefärbten Schnitte mit Aqua bidest und darauf folgend abwechselnd die Immersion in 0,05-prozentigem Lithiumcarbonat bzw. 70-prozentigem Ethanol. Dieses Vorgehen resultiert in schärferen Kontrasten zwischen den kolorierten Nervenbestandteilen und dem umgebenden Gewebe. Hoben sich die Neurone makroskopisch gut ab, wurden die Objektträger schließlich in 5-prozentiger Eisessig schonend angesäuert, in einer ansteigenden Alkoholreihe entwässert und in n-Buthyl endfixiert. Das Eindeckeln der fertig gefärbten Präparate erfolgte mit Corbit.
4.5.3 Immunhistochemische Färbung
Zusätzlich zu den histochemischen Färbungen wurde als immunhistochemische Methode die Anfärbung des Glial fibrillary protein (GFAP) eingesetzt. Diese wird im Folgenden dargestellt:
4.5.3.1 Glial fibrillary acidic protein-Färbung (GFAP)
Um das Auftreten bzw. den Grad einer Gliose entlang des Elektrodenschaftes und der Elektrodenspitze zur Klassifikation der Schädigung heranziehen zu können, war eine spezifische Darstellung der Neuroglia erforderlich. In diesem Zusammenhang hat sich insbesondere die histologische Darstellung der Astrozyten bewährt.
Charakteristisch an diesen spezifischen Gliazellen sind ihre zytoplasmatischen Intermediärfilamente (Durchmesser 5-10 nm), die sich zu Fibrillen zusammenlegen und über ein immunhistochemisch nachweisbares Protein (GFAP = glial fibrillary acidic protein) verfügen[138].
Bei der hier angewendeten indirekten Immunperoxidase-Methode wurden die Schnitte vorab zur besseren Haftung der Objekte bei 37 °C über Nacht im Brutschrank aufbewahrt. Die vollständige Entfernung des Einbettungsmediums erfolgte durch eine 30-minütige Erwärmung der Objektträger in einem auf 60 °C
Kapitel 4 Material und Methoden
52 vorgeheizten Ofen. Die Temperatur durfte dabei 60 °C nicht übersteigen, um eine Antigendenaturierung und Schädigung der zellulären Morphologie zu verhindern. Aus dem Wärmeofen wurden die Schnitte sofort in einem frischen Xylolbad für 20 Minuten und anschließend in einem Verhältnis von 1:1 mit 100-prozentigem Ethanol entparaffiniert. Die Nachbehandlung der Präparate erfolgte in einer absteigenden Alkoholreihe.
Zur Blockade der endogenen Peroxidase wurden die Gewebeschnitte im Dunkeln mit 4 bis 6 Tropfen 3-prozentigem Wasserstoffperoxid beträufelt und 10 Minuten inkubiert. Um eine bessere Reduktion der Hintergrundfärbung zu erzielen, wurde das Gewebe nachfolgend dreimal für 5 Minuten in 0,05-molarer Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) abgespült. Daran schloss sich eine 20-minütige Mikrowellenfixierung (730 Watt) der Schnitte in einer 10-millimolaren Citratpufferlösung (ph-Wert 6,0) an, die einer besseren Haftung des spezifischen Primärantikörpers für das GFAP diente. Die Schnitte wurden vorübergehend für 15 Minuten in der Pufferlösung belassen und anschließend abermals in TBS gespült.
Die einstündige Präinkubation der Objektträger erfolgte bei Raumtemperatur (RT) in einem Gemisch aus Schweine-Null-Serum (Normal-0-Serum, DAKO Art.-Nr.
Z033401) und TBS (Verhältnis 1:10). Anschließend wurden die Schnitte vorsichtig abgetupft und sogleich mit dem in TBS in einem Verhältnis von 1:400 verdünnten Kuhantikörper gegen GFAP (RB A-cow GFAP, Art.-Nr. Z033401) schonend beträufelt. Die Inkubation der mit dem unkonjugierten Antikörper versetzten Objektträger erfolgte schließlich über Nacht bei 4 °C (Abb. 28).
Am darauf folgenden Tag wurden die Schnitte zunächst für 30 Minuten bei RT erwärmt und in TBS gewaschen (dreimal 5 Minuten). Anschließend erfolgte das Auftragen des mit TBS in einem Verhältnis von 1:100 verdünnten Peroxidase-konjugierten Kaninchenantikörpers (Sw A-Rabbit IgG/HRP, Art.-Nr. P021702) gegen das Kuhimmunglobulin. Die Inkubation der fertig versetzten Gewebeschnitte dauerte eine Stunde an, bevor nach einer erneuten Spülung mit TBS den Objektträgern 4-6 Tropfen DAB als Substratlösung zugegeben wurde. Durch diese Zugabe entstand das braun gefärbte Endprodukt. Da es weder in Alkohol noch in organischen Lösungsmitteln löslich ist, konnten die Schnitte für 5 Minuten in saures Hämalaun nach Meyer[133] (siehe HE-Färbung; Verhältnis 1:10) gegengefärbt und nach Bläuen des Hämatoxylins unter fließendem Wasser in einer aufsteigenden Alkoholreihe
5 Ergebnisse
5.1 Qualitative Auswertung
In den hier vorliegenden Versuchsreihen wurde das in Zusammenarbeit mit der Firma Medical Electronics (MED-EL GmbH; Innsbruck/Österreich) entworfene Elektrodenmodell auf
• eventuelle Schädigungen durch den operativen Insertionsvorgang (Kap. 5.1.1 Versuchsgruppe I),
• die langfristige materialspezifische Gewebeverträglichkeit (Kap. 5.1.2 Versuchsgruppe I)
sowie
• Schädigungsmuster durch die elektrische Tiefenstimulation im Hirngewebe - Morphologische Muster und Schwellenwerte (Kap. 5.1.3 Versuchsgruppe II und III)
getestet.
5.1.1 Schädigungen durch den Insertionsvorgang (Versuchsgruppe I)
In den Hämatoxylin-Eosin- und Trichrom-Färbungen des parietalen Kortex war bei vier Präparaten subdural im Bereich unterhalb der Penetrationsstelle der Dura eine Ansammlung von Erythrozyten im Sinne eines subarachnoidalen Hämatoms zu erkennen (vgl. Abb. 30 a und b). Größere subdurale oder epidurale Blutauflagerungen waren jedoch nicht festzustellen.
Entlang des Stichkanals zeigten sich weder Zelleinschlüsse als Kerndegenerationsprodukte noch traten vermehrt Lymphozyten auf. Eine lymphozytäre Reaktion und Parenchymverschiebung mit vereinzelt auftretenden Zelleinschlüssen war allein um die meißelförmige Spitze des Elektrodenträgers zu sehen.
Penetrationsstelle zu einer subarachnoidalen Blutauflagerung. Eine Propagation der Schädigung in das angrenzende Hirngewebe entlang des Stichkanals war aber nicht festzustellen. Um die meißelförmige Spitze fand sich neben einer lymphozytären Reaktion in der HE-Färbung auch eine ausgeprägte Gliose in der GFAP-Färbung (vgl. Abb. 30 a-d).
5.1.2 Langfristige materialspezifische Gewebeverträglichkeit (Versuchsgruppe I)
Die in dieser Versuchsgruppe durchgeführte histologische Untersuchung diente nicht nur der qualitativen Beurteilung der langfristigen Biokompatibilität des neuartigen Elektrodenträgermaterials (Hysol® EE0079 / HD0070 und Epo-Tek 353ND), sondern sollte auch die Voraussetzung dafür schaffen, Läsionen, die durch das Elektrodenmaterial selbst hervorgerufen wurden, von solchen zu trennen, die durch die elektrische Stimulation selbst bedingt waren.
In der Abbildung 31 sind Querschnitte der im parietalen Kortex verlaufenden Stichkanäle nach Explantation der Elektroden dargestellt. Die Schnitte liegen hier im Bereich des Pt-Stimulationskontaktes, welcher in der gewünschten Tiefe von 2 mm rechtwinklig aus dem Schaft der Elektrode austrat.
Auch hier wurden zur Charakterisierung von Schädigungsmustern die angefertigten Querschnitte in den histologischen Färbungen HE, Trichrom, Nissl sowie immunhistochemisch in GFAP dargestellt.
In Einzelversuchen wurde die Implantationsdauer auf 16 bis 20 Wochen ausgedehnt.
Im Vergleich zu den nur für 8 Wochen implantierten Tieren ergab sich dabei kein
Im Vergleich zu den nur für 8 Wochen implantierten Tieren ergab sich dabei kein