Niedrigere humorale Immunantwort nach Immunisierung von gp120hC3d 3 -

Die Bestimmung der humoralen Immunantwort erfolgte durch die Untersuchung der Seren einzelner Mäuse oder Serenpools der Mausgruppen mittels Antikörper-ELISA oder Immunoblot auf die Bildung gp120- oder hC3d-spezifischer Antikörper. Die Mäuse wurden vor Beginn der Studie auf das Vorhandensein etwaiger bestehender gp120-spezifischer humoraler Antworten getestet (Präimmunseren). Für die Immunisierungsexperimente wurden zum einen die DNA-Konstrukte mit der Signalsequenz tpa3 verwendet, da kein

Expressions- oder Sekretionsunterschied zwischen den einzelnen tpa-Varianten festgestellt werden konnte. Außerdem die Konstrukte mit der HIV-Signalsequenz, da die autologe Signalsequenz in den Expressions- und Sekretionsversuchen geringfügig höhere Werte erzielte (Abbildung C.5C).

C.5.1.1 Geringfügige Verbesserung der humoralen Immunantwort bei Verwendung der HIV-1 Env Signalsequenz

Der Einfluss der unterschiedlichen Signalsequenzen tpa3 und HIV wurde nach der letzten Immunisierung anhand der α-gp120-Titer der individuellen Mausseren bestimmt. Beim Vergleich der gp120-Konstrukte mit tpa3 oder mit HIV als Signalsequenz zeigte sich, dass mit der HIV-1 Signalsequenz im Mittelwert scheinbar höhere gp120-spezifische Ig-Titer erzielt wurden. Bei der Auftragung der Einzelseren wird jedoch deutlich, dass die höheren Mittelwerte nur aufgrund des extrem hohen Titers einer einzelnen Maus zustande kommen (Abbildung C.13). Wenn der Wert dieser Maus nicht eingerechnet wird, ist der Mittelwert der Titer um fast die Hälfte niedriger (10.000) als der Gesamttiter der Mäuse, die mit tpa3gp120 immunisiert wurden (21.000). Die Verwendung von gp120hC3d₃ -Konstrukten mit der Signalsequenz HIV erzielte jedoch höhere Ig-Titer (9.400) verglichen mit den Mäusen, die mit tpa3gp120hC3d3 immunisiert wurden (3.200).

tpa3gp120

mock tpa1hC3d³ tpa3gp120hC3d³

HIVgp120

HIVgp120hC3d³ 100000

90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0

Endtiter

Abbildung C.13: Endpunkttiter individueller Mausseren nach der dritten DNA-Immunisierung.

Balb/C Mäuse wurden zum Zeitpunkt 0 sowie nach 5 und 12 Wochen mit je 100 µg der angegebenen Plasmid-DNA (mock entspricht pcDNA3.1) immunisiert. Für die Ermittlung der gp120-spezifischen Ig-Titer der einzelnen Mäuse nach der dritten Immunisierung wurden die Mausseren im ELISA vermessen. Die Titer korrespondierten mit dem reziproken Wert der höchsten Serumverdünnung, deren O.D. Wert dreimal höher war als der Wert der entsprechenden Verdünnung einer nicht-immunisierten Kontrolle.

C.5.1.2 Verringerte Induktion gp120-spezifischer Antikörper nach Immunisierung von gp120hC3d3-Fusionskonstrukten

Der Einfluss der hC3d3-Fusion wurde durch Vermessung der gp120-spezifischen Ig-Titer jeweils eine Woche nach der zweiten und der dritten Immunisierung untersucht. Die Seren einer Mausgruppe wurden hierbei jeweils vereinigt und erst dann in den spezifischen ELISA eingesetzt. Die Immunisierung mit tpa3gp120 und HIVgp120 resultierte in hohen Env-spezifischen Antikörpertitern. In tpa3gp120 immunisierten Tieren konnte nach sechs Wochen ein Titer von 12.000 und nach 13 Wochen ein Titer von 25.000 festgestellt werden. Nach Immunisierung mit HIVgp120 wurde jedoch bereits nach sechs Wochen ein Titer von 45.000 erreicht, der sich auch nach der dritten Immunisierung nicht mehr veränderte (Abbildung C.14). Dieser ELISA erfolgte allerdings mit den vereinigten Seren der Mausgruppen. Es kann daher aufgrund der Vermessung der Einzelmausseren (Abbildung C.13) davon ausgegangen werden, dass der Wert einer einzelnen Maus für den hohen Gesamttiter verantwortlich war. Den Titer der HIVgp120 immunisierten Tiere kann folglich mit dem der tpa3gp120 vakzinierten Mäuse gleichsetzt werden. Die nach Injektion von tpa3gp120hC3d3 und HIVgp120hC3d3 induzierten spezifischen Titer waren um den Faktor sieben beziehungsweise vier niedriger als die Titer der beiden gp120-kodierenden Konstrukte. Diese Reduktion entspricht auch der verringerten Expression und Sekretion der gp120-Konstrukte nach transienter Transfektion, die sich nach der Fusion mit hC3d3 ergab (Abbildung C.5C). Es zeigte sich, dass die Titer tpa3gp120hC3d3 -immunisierter Mäuse mit dem Wert 3.200 um die Hälfte geringer waren als die HIVgp120hC3d₃-vakzinierter Mäuse mit dem Werte 6.400. Die Verwendung der HIV-1 Env Signalsequenz scheint folglich einen positiven Einfluss auf die Sekretionseffizienz zu haben, entgegen früheren Ergebnissen von Li et al. und Wang et al. (Li et al., 2000; Wang et al., 2007; Wang et al., 2006b). Allerdings wurde bei den entnommenen Präimmunseren der mit HIVgp120hC3d₃ immunisierten Tiere ein leicht erhöhter Grundtiter von 93 festgestellt, der durchaus die erhöhten Antikörpertiter nach den Immunisierungen beeinflusst haben kann. Die Abweichungen zu den ELISA-Ergebnissen in C.5.1.1 kamen dadurch zustande, dass die Vermessung der individuellen Mausseren unabhängig von den vereinigten Mausseren erfolgte.

0 5 10 15 Wochen

Prime 1.Boost 2.Boost

Endtiter

1000000 100000 10000 1000 100 10 1

tpa3gp120 HIVgp120 tpa3gp120hC3d₃ HIVgp120hC3d₃ tpa1hC3d₃ mock

Abbildung C.14: Humorale Immunantwort nach intramuskulärer DNA-Immunisierung verschiedener gp120-Konstrukte. Balb/C Mäuse wurden am Zeitpunkt 0, sowie nach fünf und zwölf Wochen mit je 100 µg der angegebenen Plasmid-DNA (mock entspricht pcDNA3.1) immunisiert. Jeweils eine Woche nach der zweiten und dritten Immunisierung wurden die Env-spezifischen Ig-Titer der immunisierten Versuchstiere im ELISA ermittelt. Die Titer korrespondierten mit dem reziproken Wert der höchsten Serumverdünnung, deren O.D.-Wert dreimal höher war als der Wert der entsprechenden Verdünnung einer nicht-immunisierten Kontrolle.

C.5.1.3 Immunisierung von gp120-Konstrukten führt zu einer T_H1-Polarisierung der humoralen Immunantwort

In mehreren Studien wird davon ausgegangen, dass die Immunantwort bei C3d₃-gekoppelten Antigenen eher in Richtung T_H2-Antwort tendiert (Bower et al., 2005;

Liu et al., 2004; Mitchell et al., 2003; Wang et al., 2006d) Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden die Mausserenpools auf eine unterschiedliche Ausprägung der Immunglobulinantwort getestet. Die Expression der Immunglobulintypen IgG2a und IgG1 ist ein Indiz für die Ausrichtung der Immunantwort hin zu einer T_H1- oder T_H2-Antwort.

Anhand des dominierenden Immunglobulintyps kann so die Ausrichtung der Immunantwort bestimmt werden. Verstärkte Expression von IgG2a steht dabei für die Verschiebung in Richtung TH1-Antwort, verstärkte Expression von IgG1 für eine Verschiebung zu einer T_H2-Antwort. Die Mausserenpools tpa3gp120 und tpa3gp120hC3d₃ immunisierter Mäuse wurden auf ihren Gehalt an IgG2a- und IgG1-Antikörpern untersucht. Es stellte sich heraus, dass weder IgG2a-, noch IgG1-Antikörper in den Mausseren der mit gp120hC3d3-Fusionskonstrukten immunisierten Mäuse nachweisbar waren. Bei den Mäusen, die mit tpa3gp120 immunisiert wurden, zeigte sich, dass IgG2a die Immunglobulinexpression dominierte (Abbildung C.15). Dies wies darauf hin, dass DNA-Immunisierung von gp120-Konstrukten ohne hC3d₃-Fusion die humorale Immunantwort in Richtung TH1 verschiebt.

2000 Verhältnisses von IgG1 zu IgG2a

Abbildung C.15: Bestimmung der TH1-/TH2-Polarisierung. Die Mausserenpools wurden in mehreren Verdünnungen aufgetragen und auf ihren IgG2a und IgG1-Gehalt überprüft. Der ELISA wurde mit Streptavidin gebundenen α-Maus IgG2a und α-Maus IgG1 Antikörpern durchgeführt. Die Detektion erfolgte mit einem HRP gekoppelten α-Biotin Antikörper und dem Substrat TMB. Als Einheit ist die Optische Dichte bei 450 nm (OD450) angegeben. In (A)die Ergebnisse der mit tpa3gp120 immunisierten Mäuse und in (B)ELISA-Daten der mit tpa3gp120hC3d3 immunisierten Mäuse. (C)Endpunkttiter der jeweiligen Isotypen in den vermessenen Mausserenpools. Die Endpunkttiter korrespondierten mit dem reziproken Wert der höchsten Serumverdünnung, deren O.D.-Wert zweimal höher war als der Wert der entsprechenden Verdünnung einer nicht-immunisierten Kontrolle.

Für die Bestimmung der Polarisierung der vorherrschenden Immunantwort wurde zudem das Verhältnis IgG1-Titer zu IgG2a-Titer berechnet. Ein Verhältnis IgG1 zu IgG2a >> 1 weist auf eine TH2 Antwort hin, ein Verhältnis < 1 hingegen auf eine TH0/TH1 basierende Immunreaktion. Die Untersuchungen bestätigten, dass tpa3gp120 mit einem IgG1/IgG2a Verhältnis von 0,625 eine T_H0/T_H1-vermittelte Immunantwort stimuliert. Die Immunisierung der Mäuse mit tpa3gp120hC3d₃ resultierte in so niedrigen Gesamttitern, dass eine Bestimmung von IgG1 und IgG2a Titern nicht möglich war (siehe Tabelle C.2).

Gruppe Ratio IgG1 zu IgG2a tpa3gp120 0,625 tpa3gp120hC3d3 Nicht berechenbar

C.5.1.4 Induktion einer hC3d-spezifischen Immunantwort in Mäusen

In den Mausimmunisierungsexperimenten wurde im Gegensatz zu anderen Studien humanes und nicht murines C3d verwendet (Gor et al., 2006; Mitsuyoshi et al., 2005;

Ross et al., 2001; Wang et al., 2004a). Murines und humanes C3d weisen zwar eine hohe Homologie ihrer Aminosäuresequenz auf (71%), aber die Studie von Green et al. zeigt, dass die Verwendung speziesfremder C3d-Proteine zu Antikörperbildung führen kann (Green et al., 2003). Um zu überprüfen, ob die Mäuse α-hC3d Antikörper bildeten, wurden Zelllysate und Zellkulturüberstände von 293T-Zellen nach Transfektion von tpa1hC3d3 auf ein SDS-Acrylamidgel aufgetragen und eine Western Blot Analyse mit den vereinigten Mausseren durchgeführt (Abbildung C.16). Trotz der hohen Aminosäuresequenz-homologie ließen sich in den Seren der Mäuse, die mit tpa1hC3d₃, tpa3gp120hC3d₃ oder HIVgp120hC3d₃ immunisiert wurden, α-hC3d Antikörper nachweisen. Auf der erwarteten Laufhöhe des aufgetragenen hC3d₃ (ca. 100 kDa) wurden deutlich AP-gefärbte Banden sichtbar, folglich kam es zur Bildung von α-hC3d Antikörpern. Als Negativkontrollen wurden auch Seren von Mäusen überprüft, die mit pcDNA3.1 (mock), tpa3gp120 oder HIVgp120 immunisiert wurden, hier zeigten sich wie erwartet keine Banden auf der Höhe von hC3d3.

mock tpa1hC3d³ tpa3gp120

tpa3gp120hC3d³ HIVgp120hC3d³ HIVgp120

150 100 75 kDa 150 100 75 A

B

hC3d₃ hC3d₃

Abbildung C.16: Überprüfung der gepoolten Mausseren auf hC3d-spezifische Antikörper mittels Western Blot-Analyse. Für die Transfektion wurden 2 × 10⁵ 293T-Zellen ausgesät und mit 15 µg Plasmid-DNA (tpa1hC3d3) transfiziert. Nach 48 Stunden erfolgte die Abnahme des Zellkulturüberstands mit anschließender Abzentrifugation der Zellbestandteile (300 × g für 5 min) sowie die Ernte der Zellen mit nachfolgender Lyse durch 150 µl RIPA-Puffer. Je 50 µg Gesamtprotein des Zelllysats (A) beziehungsweise 30 µl des Überstands (B) wurden pro Spur auf ein 7,5%iges SDS-Acrylamidgel aufgetragen. Die nachfolgende Western Blot-Analyse wurde mit den angegebenen Mausserenpools durchgeführt. Die Entnahme der Seren erfolgte eine Woche nach der dritten Immunisierung. Die Seren der sechs Mäuse, die mit dem gleichen Konstrukt immunisiert wurden, wurden vereinigt. Nach Inkubation der Serenpools mit den auf der Membran immobilisierten hC3d3-Proteinen wurden die gebundenen α-hC3d Antikörper mit einem α-Maus AP Antikörper nachgewiesen.

C.5.2 Vergleichbare zelluläre Immunantwort nach Immunisierung von gp120- und