Herstellung der stabilen Zelllinien

Um zu gewährleisten, dass eine mit syngag transfizierte Zelle auch die entsprechenden Env- und C3d-Konstrukte exprimiert, wurden folgende stabile Zelllinien generiert:

CD5gp140TM_HIV, HIVgp140TM_HIV und tpa1gp140TM_HIV, sowie tpa1hC3dTM_HIV und tpa1hC3dTMgp64 wurden über die Schnittstellen NheI und PmeI in den Vektor pcDNA5/FRT kloniert und durch Selektion stabile Zelllinien generiert (siehe Abbildung C.24). Die Herstellung von tpa1gp140TM_HIV, tpa1hC3dTM_HIV und tpa1hC3dTM_gp64 ist in Abschnitt C.7.1 beschrieben. Für die Konstruktion von HIVgp140TM_HIV wurde die aus der Arbeitsgruppe erhaltene kodonoptimierte gp140TM-Sequenz durch PCR mit den Oligonukleotiden cenvF1_A und TMHIVback vervielfältigt. Mit den Schnittstellen BsmBI und PmeI erfolgte die Klonierung des PCR-Fragments an das 3´OH-Ende der HIV-Signalsequenz, die über NheI und HindIII in den Vektor pcDNA5/FRT gesetzt wurde.

Das synthetische Signalpeptid CD5 wurde bereits in der ursprünglich erzeugten gp140TMHIV-Sequenz verwendet. Für die Herstellung von CD5gp140TMHIV konnte daher das gesamte Konstrukt über PCR mit den Oligonukleotiden CD5fwd und TM_HIVback amplifiziert und über NheI und PmeI in den Vektor pcDNA5/FRT transferiert werden. Der Vektor ermöglicht unter Verwendung des Flp-In^TM Systems die gezielte Integration einer Kopie des Transgens in einen definierten Lokus der Zielzelle. Als weitere Komponente enthält der Vektor pcDNA5/FRT einen eukaryontischen Selektionsmarker (Hygromycin), der die Generierung stabiler Zelllinien gewährleistet.

Abbildung C.24: Schema der RNA- und kodonoptimierten Konstrukte zur Herstellung stabiler Zelllinien. Detaillierte Beschreibung der Konstrukte im Text. Die Sequenz von gp140 ist als eng diagonal gestreiftes Feld abgebildet. Die synthetische Signalsequenz CD5 ist mit einem Wellenmuster, die Signalsequenz HIV ist weiß und die tpa1 grau dargestellt. Die humane C3d-Kassette wird durch ein schwarzes Feld repräsentiert, die Sequenz der (G4S)2-Linker durch eine schwarze Linie und die Transmembrandomänensequenz von HIV-1 Env durch schwarze Punkte auf weißem Grund, die von gp64 durch weiße Punkte auf schwarzem Grund.

Es wurden zwei unterschiedliche Säugetierzelllinien verwendet, um auszutesten, ob sich die Zelllinien hinsichtlich ihrer Expression oder in ihrem Transfektionsverhalten unterscheiden. Beide Zelllinien ließen sich auf 99% positive, Transgen-exprimierende

Zellen selektionieren. In diesen Zellen befand sich je eine Kopie des Transgens unter der Kontrolle des eukaryontischen CMV-Promotors. Die Proteinexpression der Klone wurde in Western Blot-Analysen überprüft. Zelllysate der stabilen Zellen wurden für den Proteinnachweis verwendet und die Expression mit α-gp120 beziehungsweise α-hC3d detektiert. Für alle Genvarianten konnte in den jeweiligen stabilen CHO- sowie 293T-Zellen gp140 (140 kDa) und hC3d (44 kDa) nachgewiesen werden (siehe Abbildung C.25).

Abbildung C.25: Western Blot-Analyse der stabil exprimierenden CHO- bzw. 293T-Zelllinien. Wie unter B.2.4 beschrieben wurden stabil gp140TM bzw. hC3dTM exprimierende CHO- sowie 293T-Zellen etabliert. Nach Selektion wiesen beide Zellpopulationen mehr als 99% positive, Transgen-exprimierende Zellen auf. (A) Jeweils 50 µg Gesamtprotein gp140TMHIV-produzierender Zellen (Spur 1,2,3) sowie mock-transfizierter Zellen (Spur 4) wurde aufgetragen. In der Western Blot-Analyse wurde gp140 mit dem polyklonalen α-gp120 aus Kaninchenserum gefärbt und über einen AP-gekoppelten α-Kaninchen Antikörper detektiert. In (B) wurde 50 µg Gesamtprotein hC3dTMHIV-(Spur 5) oder hC3dTMgp64-exprimierender Zellen (Spur 6) sowie mock-transfizierter Zellen (Spur 7) aufgetragen. Exprimiertes hC3d wurde mit monoklonalem α-hC3d aus Maushybridomen durch einen AP-gekoppelten α-Maus Antikörper nachgewiesen.

Die Expression von hC3d durch die stabilen Zellen konnte durch die Western Blot-Analyse nicht eindeutig nachgewiesen werden, da die Banden im Vergleich zum Hintergrund relativ schwach waren. Daher folgte der Versuch, die Expression von hC3d auf der Zelloberfläche durch eine FACS-Analyse der stabilen Zellen zu zeigen. Mittels eines α-hC3d spezifischen Antikörpers, der durch einen PE-gekoppelten α-Maus Antikörper detektiert wurde, konnte das exprimierte humane C3d gefärbt werden. In Abbildung C.26 zeigte sich, dass die stabilen 293T-Zellen eine starke hC3d-Expression aufwiesen, während hingegen die stabilen CHO-Zellen hC3d nur gering oder gar nicht exprimierten. CHO-Zellen, die stabil mit tpa1hC3dTMHIV transfiziert waren, zeigten keinerlei hC3d Expression, diejenigen, die mit tpa1hC3dTM_gp64 transfiziert waren, wiesen nur eine geringe Expression auf.

CHO

a b c d

293T

Zellzahl

PE (MFI)

0,5% 0,5%

1% 1%

α-mPE α-hC3d/ α-mPE

100 512 ⁰ 10¹ 10² 10³

100 512 ⁰ 10¹ 10² 10³

100 256 ⁰ 10¹ 10² 10³

100 256 ⁰ 10¹ 10² 10³

1% 9%

95%

90%

tpa1hC3dTM_HIV.

α-hC3d/ α-mPE tpa1hC3dTM_gp64 α-hC3d/ α-mPE

100 512 ⁰ 10¹ 10² 10³

10⁰ 10¹ 10² 10³

0 512

100 256 ⁰ 10¹ 10² 10³

10⁰ 10¹ 10² 10³

0 256

Abbildung C.26: Nachweis von hC3d-Expression auf stabilen CHO- und 293T-Zelllinien.Die stabilen Zellen wurden mittels eines spezifischen α-hC3d Antikörper gefärbt, der durch einen PE-gekoppelten α-Maus Antikörper (α-mPE) detektiert wurde. Gefärbt wurden stabile CHO-Zellen und stabile 293T-Zellen, die entweder mit tpa1hC3dTMHIV (a) oder tpa1hC3dTMgp64(b) transfiziert waren. Als Negativkontrollen wurden nicht transfizierte 293TFlp-In-Zellen mit α-mPE allein (c) oder mit α-hC3d und α-mPE gefärbt (d). Nicht gefärbte Zellen sind als graue Fläche dargestellt. Für die FACS-Analyse wurden jeweils 20.000 Zellen aufgenommen. Auf der Y-Achse ist die gemessene Zellzahl aufgetragen. Auf der X-Achse ist die Mean fluorescence intensity (MFI) dargestellt.

Die stabilen CHO-Zellen zeigten eine schwächere Expression von hC3d (siehe Abbildung C.26) und teilweise auch von gp140 (siehe Abbildung C.25) und wurden daher für weitergehende Experimente nicht mehr verwendet. Der Nachweis der gp140-Expression konnte nicht im FACS erfolgen, da die Env-spezifischen Antikörper ungeeignet für den Expressionsnachweis waren. Daher wurde eine LacZ-Analyse durchgeführt, um zusätzlich zu überprüfen, ob die generierten 293T-Zelllinien positiv für die Expression des Transgens waren. Ein funktionsfähiges lacZ-Gen liegt nur in Flp-In-Zellen vor, in die das Transgen nicht einrekombiniert wurde. Das Genprodukt des lacZ-Gens, die ß-Galaktosidase, kann das farblose Substrat X-Gal (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-ß-DGalaktosid) spalten und in das tiefblaue 5-Brom-4-Chlor-Indigo umsetzen. Mit dieser Färbung kann die Zerstörung des lacZ-Gens und die erfolgreiche Rekombination nachgewiesen werden. Die mit HIVgp140TMHIV (a) und tpa1hC3dTMHIV (b) stabil transfizierte 293T-Zellen, 293T-Flp-In Zellen und normale 293T Zellen wurden durch Färbung mit X-Gal analysiert. In Abbildung C.27 ist deutlich zu sehen, dass keine Blaufärbung der stabil transfizierten Zellen stattfand (a, b). Die stabilen Zellen wurden folglich zu fast 100% auf das Transgen hin selektioniert. Als Negativkontrolle wurden normale 293T-Zellen verwendet, die kein lacZ-Gen enthalten (c) und als Positivkontrolle 293T Flp-In Zellen, die ein intaktes lacZ besitzen (d).

a b

c d

Abbildung C.27: LacZ-Analyse der stabil gp140- bzw hC3d-exprimierenden 293T-Zelllinien. Wie unter B.2.4 beschrieben, wurden stabil gp140- (a) beziehungsweise hC3d- (b) exprimierende 293T-Zellen etabliert. Nach der Hygromycinselektion wiesen alle Zellpopulationen mehr als 99% positive, gp140 bzw. C3d exprimierende Zellen auf. Als Negativkontrolle wurden 293T Zellen (c) und als Positivkontrolle 293TFlp-In-Zellen (d)verwendet.

Um zu überprüfen, ob die gewünschten Transgene korrekt rekombiniert waren, wurde die genomische DNA der stabilen Zellen isoliert und eine spezifische PCR durchgeführt, gefolgt von einer Sequenzierung. In diesem Versuch wurden die stabilen CHO-Zellen auch getestet, um zu ergründen, ob eine fehlerhafte Gensequenz des Transgens für die fehlende beziehungsweise geringe Expression verantwortlich war. Die genomische DNA wurde aus den stabilen Zellen isoliert und als Matrize für spezifische Gradienten-PCR-Experimente mit den Oligonukleotiden hC3d1fwd/TMHIVback (5) beziehungsweise TM_gp64back (4) und cenv981f/TM_HIVback (1, 2, 3) analysiert (siehe Abbildung C.28). Als Kontrollen wurden die isolierten DNAs mit den jeweils unpassenden Oligonukleotiden eingesetzt, um zu sehen, ob spezifische Banden erkennbar sind. Es waren keine falsch positiven Banden erkennbar (Daten nicht gezeigt).

Die Durchführung der spezifischen PCR ergab, dass außer dem Transgen tpa1hC3dTM_HIV in stabilen CHO-Zellen alle Transgene korrekt amplifiziert wurde. Die Fragmente der spezifischen PCR wurden mit dem QIAquick PCR Purification Kit aufgereinigt und anschließend sequenziert. Durch den Vergleich mit den Ursprungs-sequenzen konnte festgestellt werden, dass tpa1gp140TM_HIV eine Deletion von drei Basen in der Transmembrandomäne in beiden stabilen Zelllinien aufwies. In den stabilen CHO-Zelllinien zeigte tpa1hC3dTM_gp64 eine Insertion von 30bp in hC3d und tpa1hC3dTMHIV konnte gar nicht nachgewiesen werden. Diese Zelllinie entstand vermutlich durch eine Spontanmutation, die zu einer hohen Hygromycinresistenz führte.

Die Sequenzierung bestätigte zudem die Daten der Western Blot Analyse (Abbildung

C.25), der FACS-Analyse (Abbildung C.26) und der Mikroskopieaufnahmen (Abbildung C.27), wonach fast alle 293T-Zelllinien das richtige Transgen stabil exprimierten und die beiden hC3d-stabilen CHO-Zelllinien keine oder nur eine geringe Expression zeigten.

293T CHO

M 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

kb 3

2 1,5

1

0,5

Abbildung C.28: PCR über isolierte genomische DNA der stabilen CHO- und 293T-Zelllinien. Nach Aufreinigung der genomischen DNA aus den stabil transfizierten 293T- und CHO-Zellen wurde mit einer spezifischen PCR mit den Oligonukleotiden cenv981f/TMHIVback und TMgp64back sowie hC3d1fwd/TMHIVback und TMgp64back überprüft, ob die Transgene enthalten waren. Aufgetragen sind die PCRs der mit CD5gp140TMHIV (1), HIVgp140TMHIV (2), tpa1gp140TMHIV (3), tpa1hC3dTMgp64 (4) und tpa1hC3dTMHIV (5) stabil transfizierten Zellen. Der DNA-Längenstandard ist mit M gekennzeichnet.

C.7.3.2 Transiente Transfektion der stabilen Zelllinien führt zu einer Verringerung der