Mikrobiologische Analysen

Als anlagenbezogene Messparameter wurden die in Tabelle 3 aufgelisteten Leitparameter und Endotoxine in den Proben aus Roh- und Reingas, Prozesswasser und Füllkörper nachgewiesen. Die Leitparameter dienen zur Ermittlung des Einflusses der Anlage auf die Emissions- und Immissionssituation.

Tab. 3: Untersuchte Mikroorganismen (anlagenbezogene Leitparameter) und Endotoxine sowie eingesetzte Nachweisprinzipien

Messparameter Nachweisprinzip

Gesamtkeimzahl Kulturell

Streptokokken Kulturell

Actinomyceten (mesophil, thermophil) Kulturell Staphylokokken Kulturell

MRSA Kulturell, molekularbiol. Differenzierung

Enterokokken Kulturell

Enterobacteriaceae Kulturell, molekularbiol. Differenzierung Pseudomonaden Kulturell, molekularbiol. Differenzierung

Pilze Kulturell

Endotoxine LAL-Test

Die mikrobiologischen Untersuchungen erfolgten kulturell mittels Selektivmedien (Tabelle 4).

MATERIAL UND METHODEN

Tab. 4: Eingesetzte Selektivmedien, Bebrütungstemperatur und -dauer

Leitparameter Nährboden

Gesamtkeimzahl Blutbasis (36 °C, 36-48 Std.)

Streptokokken Azid Blood Agar Base (Oxoid GmbH, Art.-Nr. CM 259) + defibriniertes Schafsblut (Oxoid GmbH, Art.-Nr. SR 51) (CO₂ -Schrank, 36 °C, 36-48 Std.)

Actinomyceten (mesophil, thermophil) Difco^TM Actinomeces Isolation Agar (Becton Dickinson AmbH, Art.-Nr. 2121689) (25 °C und 50 °C, 7 Tage)

Staphylokokken Mannitol Salt Agar (Oxoid GmbH, Art.-Nr.

CM 85) (36 °C, 36-48 Std.)

MRSA CHROMagar MRSA Fertigplatten (Mast Diagnostica GmbH, Art.-Nr. 201402) (36°C, 36-48 Std.)

Enterokokken Enterococcus Selektivagar (BAA) (Galle Äsculin Azid Agar) (Oxoid GmbH, Art.-Nr.

PO 5062A) (36 °C, 36-48 Std.)

Enterobacteriaceae MacConkey Agar (Oxoid GmbH, Art.-Nr.

CMO 115) (36 °C, 36-48 Std.) aufgeschüttelt und direkt oder als Verdünnung auf die jeweiligen Selektivmedien ausplattiert (zwei Verdünnungsstufen pro Probe, die gewählte Verdünnung beruht auf den Erfahrungswerten von Vorversuchen). Wasserbad geschüttelt und anschließend 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Die Proben wurden direkt bzw. als Verdünnung (pro Probe zwei Verdünnungsstufen) auf

MATERIAL UND METHODEN

100 mg Staub wurden in 10 ml PBS + Tween 20 überführt. Die Proben wurden im Labor 15 Minuten bei 25 °C im Wasserbad geschüttelt, und anschließend 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Die Staubproben wurden direkt bzw. als Verdünnung (pro Probe zwei Verdünnungsstufen) auf die jeweiligen Selektivmedien ausplattiert.

Das detaillierte Ansatzschema ist in Tabelle 13 im Anhang dargestellt.

3.4.1 Gesamtkeimzahl (Gesamt KBE) Columbia-Blut-Agar (Oxoid GmbH, Art.-Nr. CM 0331)

Im Folgenden wird von „Gesamt KBE“ gesprochen. Die Gesamt KBE bezeichnet eine unspezifische Größe. Sie gibt an wie viele Kolonien aerober, mesophiler Mikroorganismen auf einem Nährboden auf Blutbasis im Verlauf von 36 bis 48 Stunden bei einer geregelten Bebrütungstemperatur von 36 °C zur Sichtgröße in Kolonien gewachsen sind. Blutagar ist ein Isolationsmedium für die Anzucht anspruchsvoller Bakterien. Er ist besonders nährstoffreich und daher für eine große Bandbreite aerober, mesophiler Bakterien unabhängig von deren jeweiligem Stoffwechsel geeignet.

3.4.2 Streptokokken

Azid Blood Agar Base (Oxoid GmbH, Art.-Nr. CM 259) + defibriniertes Schafsblut (Oxoid GmbH, Art.-Nr. SR 51)

Natriumazid wirkt auf die meisten gramnegativen Mikroorganismen bakteriostatisch, lässt jedoch das Wachstum grampositiver Bakterien wie Streptokokken zu. Durch die Zugabe von defibriniertem Schafsblut lässt sich gleichzeitig der Hämolysestatus bestimmen. Kolonien, die Hämolyse zeigen, werden gezählt.

Um eine bessere Selektivität zu erreichen, werden die Selektivplatten unter anaeroben Bedingungen 36 - 48 Stunden bei 36 °C bebrütet (CO2-Schrank).

MATERIAL UND METHODEN

3.4.3 Staphylokokken

Mannitol Salt Agar (Oxoid GmbH,Art.-Nr. CM 85)

Das Medium dient zur Isolierung von Staphylokokken. Das Wachstum der meisten anderen Bakterien wird durch die sehr hohe Salzkonzentration gehemmt.

Koagulase-positive Staphylokokken bilden Kolonien mit einem hellgelben Hof, während andere Staphylokokken einen rötlich violetten Hof bilden. Die Platten werden für 36 bis 48 Stunden bei 36 °C bebrütet.

3.4.4 MRSA

CHROMagar MRSA Fertigplatten (Mast Diagnostica GmbH, Art.-Nr. 201402)

Durch den Einsatz von Hemmstoffen wird die Begleitflora weitgehend unterdrückt, so dass die gesuchten MRSA morphologisch und farblich erfasst werden können.

Die Platten wurden für 36 - 48 Stunden bei 36 °C aerob bebrütet. Zunächst wurden die verdächtigen Kolonien (1 bis 1,5 mm Durchmesser, rosa bis malvenfarben, glänzend erscheinend) gezählt. Je zwei dieser verdächtigen Kolonien wurden ausgewählt und als Reinkultur auf Mannit-Kochsalzagar (Oxoid) bei 36 °C angezogen. Anschließend erfolgte die Vordifferenzierung von Staphylococcus aureus durch Gram-Färbung, einen positiven Katalase-Test, einen negativen Oxidase-Test (Bactident Oxidase Test, Merck), Hämolyse auf Columbia-Blut-Agar (Oxoid), einen positiven Koagulase-Test und den Staphylase-Test (Oxoid). Die Bestätigung der Vordifferenzierung wurde durch den ID 32 STAPH Test von Biomérieux ergänzt.

3.4.5 Schimmelpilze

Dichloran-Gylcerin-(DG18)- Agar Basis (Oxoid GmbH, Art.-Nr. Cm 729)

Der Nährboden enthält Dichloran, um die Ausbreitung mycelbildender Pilze zu hemmen und die Koloniegröße anderer Pilzarten zu reduzieren. Das Medium ist gut für die Keimzählung geeignet. Bei Pilzen, die normalerweise nur kleine Kolonien bilden, wird ein ungehindertes Wachstum zugelassen. Die Platten werden bei 25°C sieben Tage bebrütet und dann ausgewertet.

MATERIAL UND METHODEN

3.4.6 Enterokokken

Enterococcus Selektivagar (BAA) (Galle Äsculin Azid Agar) (Oxoid GmbH, Art.-Nr.

PO5062A)

Enterococcus Selektivagar dient zur Isolierung, Identifizierung und Keimbestimmung von fäkalen Bakterien der Gruppe D. Bakterien dieser Gruppe sind in der Lage, Äsculin in Äsculetin und Glucose zu spalten. Äsculetin bildet mit Eisen(III)ammoniumcitrat einen Komplex, der zur Ausbildung des braun-schwarzen bis schwarzen Hofes um die Bakterienkolonie führt. Diese werden dann nach 36 - 48 Stunden Bebrütung bei 36°C auf dem Selektivagar gezählt.

3.4.7 Pseudomonaden

Pseudomonas-CFC-Selektivnährboden (Oxoid GmbH, Art.-Nr. PO5132A)

Jegliches Wachstum nach 48 Stunden bei 42°C und bei 36°C auf Pseudomonas-Selektivnährboden (C-FC) lässt auf vorhandene Pseudomonas spp. schließen.

3.4.8 Actinomyceten

Difco™ Actinomyces Isolation Agar (Becton Dickinson GmbH, Art.-Nr. 2121689) Actinomyceten sind Bakterien, die wie Pilze verzweigte hyphenartige Fäden, Mycele und Sporen bilden können. Um die gewachsenen Actinomyceten-Kolonien bildet sich ein durchsichtiger Hof. Die Platten werden bei 25°C sowie bei 50°C für sieben Tage bebrütet.

3.5 Endotoxine

Endotoxine wurden mit dem Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test (LAL-Test) bestimmt.

Der Endotoxingehalt wurde nach dem in der BIA-Arbeitsmappe (Kennzahl 9450, Stand 28 Lfg IV/02) beschriebenen Verfahren mit dem chromogen-kinetischen

MATERIAL UND METHODEN

KQCL-Test (Limulus Amebocyte Lysate Kinetic-QCL® Bulk Kit, Lonza, Walkersville, USA) gemessen.

Der Endotoxingehalt einer Probe wurde mit Hilfe einer Eichgeraden (definierte Verdünnungsreihe aus Standard-Endotoxin) bestimmt. Die Linearität der Standardkurve wurde über den gesamten Konzentrationsbereich überprüft. Der lineare Regressionskoeffizient der berechneten Standardkurve durfte als Absolutwert nicht kleiner sein als ≥ 0,980, um eine erfolgreiche LAL-Testdurchführung zu gewährleisten. Das zu diesem Zweck verwendete Kontroll-Standard-Endotoxin (CSE) wurde am Referenz-Standard-Endotoxin (RSE) E. coli-6 der amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) kalibriert. Um Aufschluss über eine mögliche Hemmung oder Verstärkung der Reaktion durch das Probenmaterial zu erhalten, wurde jede Probe zusätzlich unter Zugabe einer definierten Menge Standard-Endotoxin (Interferenzprobe bzw. Spike) gemessen. Die Wiederfindungsrate musste bei 50 % liegen.

Die ermittelten Messwerte werden in Endotoxin-Einheiten (Endotoxin Units = EU) angegeben. 8 EU entsprechen etwa 1 ng Endotoxin. Die Angabe EU entspricht I.E. = Internationale Einheit.