6.1.1 Etablierung der Lasermikrodissektion zur Gewinnung muriner Keratinozyten aus Kryoschnitten
Die lasergestützte Isolierung mit anschließender PCR zum Expressionsnachweis bietet gegenüber etablierten Techniken wie z. B. der ISH den Vorteil, dass die zelltypspezifische Genexpression quantitativ und für eine Vielzahl von Genen parallel aus derselben Probe gemessen werden kann. Allerdings erfordert die Technik umfangreiche Vorversuche um valide Ergebnisse zu generieren.
Zum einen kann die Spezifität der Isolierung durch die Beschaffenheit des zu isolierenden Materials eingeschränkt sein. Die Beschaffenheit des Hautepithels erfordert zur Isolierung einzelner Zellen eine höhere Energie als bspw. Gewebe innerer Organe. Dadurch kann teilweise ein großer Bereich entstehen der mit dem Laser zerstört wird, wodurch die Anzahl Zellen, die pro Gewebeschnitt isoliert werden können, begrenzt wird. Somit stellt gerade die Epidermis der Haut auf Grund ihrer festen Gewebestruktur ein schwierig zu bearbeitendes Material dar. Zudem muss die Energiestärke, mit der die Keratinozyten isoliert werden, immer wieder neu justiert werden, was einen automatischen Betrieb des Lasers ausschließt
und so einen sehr hohen Aufwand erfordert. Grundsätzlich kann man bei der Arbeit am Mikroskop nicht ausschließen, dass auch geringe Anteile anderer Zellen als Keratinozyten, wie bspw. LC oder Melanozyten mitisoliert werden. Diesem Problem ist in der Hinsicht entgegengewirkt worden, indem die Keratinozyten einzeln und sehr nah am Rande der Zellmembran isoliert wurden. Zudem ist der Anteil anderer Zellen in der Epidermis im Vergleich mit Keratinozyten sehr gering (ca. 2-4 %) (SCHMITT 1994). Aber eine geringe Kontamination ist prinzipiell möglich, da Keratinozyten ohne spezielle Markierung nicht eindeutig identifiziert werden können. Es kann somit bei Genen, wie IL-10, IL-15, IL-18, IFN-γ, TGF-β, MCP-1, MCP-3, MIP-1α und MIP-1β, die in dieser Arbeit nur niedrig von Keratinozyten exprimiert wurden, ein Einfluß auf eine Expressionsanalyse durch kontaminierende Zellen nicht vollständig ausgeschlossen werden. Die Ergebnisse der Real-Time-PCR wurden daher nochmals mittels ISH und iIFL beispielhaft für Osteopontin (nur ISH) und I-TAC überprüft. Mit diesen Methoden konnte gezeigt werden, dass die Gene tatsächlich in Keratinozyten exprimiert wurden.
Falsch negative Ergebnisse könnten prinzipiell durch RNA Schäden bei Ablation, Mikrodissektion und Katapultieren des Untersuchungsmaterials zustande kommen. Bei der Umwandlung von Photonenenergie in elektrische Anregungsenergie wären DNA Schäden prinzipiell durch photochemische, also das Aufbrechen chemischer Bindungen, oder photophysikalische Prozesse, also temperaturbedingte Vorgänge, denkbar. Allerdings liegt die Wellenlänge des UV-Lasers mit 337 nm so weit von dem Absorptionsmaximum der DNA (260 nm) entfernt, dass es außerhalb des Laserfokus kaum zu photochemischen Reaktionen kommt. Da außerdem die Temperatur exponentiell vom Wirkort des Lasers nach außen hin abnimmt, sind auch photophysikalische Prozesse als Ursache für DNA Schäden zu vernachlässigen (GANGNUS, Firma PALM, persönliche Mitteilung). Desweiteren ist die Kontaminationsgefahr bei allen Arbeitsschritten zu berücksichtigen. Auch wenn die laserunterstütze Mikrodissektion als die „no-touch“ Methode mit der geringsten Kontaminationsgefahr des Untersuchungsmaterials angesehen wird, ist dies prinzipiell durch Gewebsentnahme, das Schneiden am Mikrotom, der Lagerung und Färbung, der Arbeit am Lasergerät sowie der RNA-Extraktion und PCR möglich. Einer eventuellen Kontamination während dieser Arbeitsschritte wurde so weit wie möglich vorgebeugt und die
Kontaminationsgefahr streng kontrolliert (s. 4.4.1. Allgemeine Maßnahmen zur Kontaminationsvermeidung).
Schließlich ist noch zu erwähnen, dass die Lebensdauer des Stickstofflasers begrenzt und das gesamte System sehr kostenintensiv ist. Während der Entstehung dieser Arbeit musste die Lasercartridge zweimal erneuert werden, was einen extrem langen Ausfall des Gerätes (>8 Monate) sowie hohe Reparaturkosten bedingte. Die Firma PALM ist sich dieser Problematik bewusst und hat dementsprechende Maßnahmen zur Verbesserung der Technik dahingehend unternommen, dass ein robusteres Feststofflasersytem entwickelt wurde. Eine Umrüstung des Systems wäre jedoch mit sehr hohen Kosten verbunden.
6.1.2 Qualität und Quantität der RNA aus Probenmaterial, das mittels Lasermikrodissektion gewonnen wurde
Für die Etablierung der Lasermikrodissektion musste zunächst geprüft werden, ob die RNA-Integrität erhalten bleibt. Dazu wurde ein Probenmaterial (Leber) gewählt, aus dem in kurzer Zeit eine große Anzahl an Zellen isoliert werden konnte.
Die Kontrolle der RNA-Integrität mit Hilfe des Agilent-2100-Bioanalyzers (BUSTIN 2002, SCHROEDER 2006) und die photometrisch ermittelten Werte zur RNA-Reinheit zeigten das zu erwartende 2:1 Verhältnis von ribosomaler 28s- zu 18s-RNA, welches als ein guter Indikator für die Intaktheit der isolierten RNA zu werten ist. Die mRNA-Menge innerhalb einer Zelle liegt schätzungsweise zwischen 0,1 und 1 pg (EBERWINE et al. 1992). Dies ergäbe bei denen in einem Pilotversuch untersuchten 50 000 Leberparenchymzellen 5000-50 000 pg oder 5-50 ng mRNA. Spektralphotometrisch wurden zwischen 46 und 52 ng/µl RNA gemessen, was bei 40 µl 1840-2080 ng oder ca 2 µg Gesamt RNA entspricht. 2 % der Gesamt RNA sind mRNA, dies entspricht ungefähr 40 ng mRNA. Auch wenn die Quantifizierung solch geringer Mengen schwierig ist, zeigen diese Daten, dass es gelungen ist eine hohe Ausbeute bei der RNA-Extraktion aus dem dissezierten Gewebe zu erreichen.
Aufbauend auf diesen positiven Ergebnissen erfolgte die weitere Aufarbeitung der RNA aus Keratinozyten mit diesem Protokoll (s 5.2). Bei den isolierten Keratinozyten konnte die isolierte RNA auf Grund der Sensitivitätsgrenze nur mit Hilfe der PCR kontrolliert werden.
Es konnten Produkte der zu erwartenden Größe für RPL und Osteopontin aus 10 000
Keratinozyten amplifiziert werden. Dabei lieferte die verwendete Trizol-Standard-Methode die höchste RNA-Ausbeute gegenüber kommerziellen Kit-Systemen.
6.1.3 Repräsentative Amplifikation kleiner RNA-Mengen
Bei der Lasermikrodissektion ist das Probenmaterial begrenzt und eine entsprechende Amplifikation der RNA in vielen Fällen wünschenswert oder sogar zwingend erforderlich.
Zudem ist es für eine routinemäßige Anwendung der sehr zeitaufwendigen Lasermikrodissektion erforderlich, die für nachfolgende Untersuchungen benötigte Zellzahl möglichst gering zu halten. Um dennoch genügend genetisches Material zur Verfügung zu haben, musste ein Amplifikationsschritt vor der eigentlichen semi-quantitativen Genexpressionsanalyse eingeschaltet werden. Dieses erstmals von VAN GELDER et al.
(1990) beschriebene Prinzip der linearen Amplifikation dient in den meisten Fällen der Synthese markierter cRNA. In der vorliegenden Arbeit wurde eine auf PCR basierende zufällige Amplifikation nur für die Synthese von doppelsträngiger cDNA verwendet (s. 4.4.9
„Vor“-Amplifikation geringer RNA Mengen). Der Vorteil letzterer Methode besteht in einem besseren 3`/5`Verhältnis der cDNA. Das optimale 3`/5`Verhältnis Verhältnis ist 1 und indiziert, dass die mRNA Sequenzen in voller Länge abgeschrieben werden, ohne jegliche Degradation oder Kürzung während der cDNA Synthese (KLUR et al. 2004). Die doppelsträngige cDNA wurde anschließend für Real-Time-PCR-Versuche verwendet. Die Zuverlässigkeit dieser Applikation wurde bereits erfolgreich getestet (FREY et al. 2002) und durch Genchipexpressionsanalysen von 1000 Zellen aus verschiedenen Bereichen des murinen Gehirns bestätigt (KLUR et al. 2004).
Zu beachten ist, dass zu hohe PCR-Zyklen die gleichmäßige Repräsentation verschiedener Transkripte beeinflussen können. Dies kann unter anderem dadurch erklärt werden, dass mit zunehmender Zyklenzahl die Polymerase nicht mehr so aktiv ist wie zu Beginn. Dies kann dazu führen, dass nicht mehr der gesamte cDNA Bereich zwischen den TAS-Sequenzen abgelesen wird und es so zur Überrepräsentation kürzerer Abschnitte kommt. Aus diesem Grund wurden Zyklenzahlen über 25 vermieden, was nur ab einer Zellzahl von 1000 Keratinozyten möglich war.
In dieser Studie konnte keine negative Beeinflussung auf den relativen Expressionslevel festgestellt werden, wenn die PCR Zyklen in einem Bereich bis maximal 25 Zyklen lagen, da
• mit einer PCR die Expression von Osteopontin und der „housekeeping“-Gene (GAPDH und RPL) vor und nach „Vor“-Amplifikation nachgewiesen werden konnte,
• diese „housekeeping“-Gene vor und nach „Vor“-Amplifikation wie erwartet stärker exprimiert wurden als Osteopontin,
• die aus Voruntersuchungen bekannte differentielle Regulation von Osteopontin in der Gesamthaut auch noch nach „Vor“-Amplifikation in den Keratinozyten nachweisbar war.
Weiterhin spricht die Übereinstimmung der Genexpression in den lasermikrodissezierten Keratinozyten und den konventionell präparierten Gesamthautproben dafür, dass die Methoden der Lasermikrodissektion und der „Vor“-Amplifikation das Endergebnis nicht negativ beeinflussten und das Gesamtmuster der Transkriptexpression erhalten blieb.
6.1.4 Real-Time-PCR
Die im Rahmen dieser Arbeit angewendete Methode der Real-Time-PCR im ABI 7900 HT RealTime-PCR cycler mit SYBR Green Sonden stellt eine semi-quantitative Technik dar (MORRISON et al. 1998), die in dieser Arbeit für die Analyse von Immunmodulatoren auf mRNA-Ebene verwendet wurde. Eine der Hauptursachen für falsch-positive PCR-Ergebnisse sind Kontaminationen der PCR. Diese Gefahr wird durch die Echtzeit-PCR im geschlossenen System verringert, da eine weitere Bearbeitung der Proben nach dem Ende der PCR überflüssig ist. Hierdurch wird zusätzlich ein Zeitvorteil bei der Probenanalyse erreicht. Um die Gefahr der Kontamination mit genomischer DNA zu minimieren, wurde bei allen extrahierten RNA-Proben ein Verdau mit DNAse durchgeführt. Ferner wurde das methodische Vorgehen kontrolliert, indem intron-spannende Primer verwendet wurden. Daher konnte ich zeigen, dass in den hier verwendeten Proben keine genomische DNA amplifiziert wurde.
Die Wahl eines geeigneten Referenzgens hängt von seiner Grundeigenschaft ab, eine konstante, stabile Genexpression bei den zu untersuchenden Proben zu besitzen. Die Expressionshöhe eines so genannten „housekeeping“-Gens kann aber nicht nur in verschiedenen Geweben sondern auch im gleichen Gewebe bei variablen Bedingungen wie bspw. verschiedenen Versuchstieren, Schwankungen aufweisen (SCHMITTGEN u.
ZAKRAJSEK 2000). Als interner Standard wurde deshalb die Expression von zwei unabhängigen Genen, GAPDH und RPL, gewählt. Bei den wenigen Veröffentlichungen zu Zytokinveränderungen bei experimentell infizierten Mäusen wurde ebenfalls GAPDH eingesetzt (GU et al. 2000, KHASKHELY et al. 2002) und zudem zeichneten sich beide Gene in eigenen Vorversuchen (Daten nicht gezeigt) durch geringe Expressionsunterschiede in infiziertem und nicht-infiziertem Gesamthautgewebe von Balb/c- und C57BL/6-Mäusen aus.
6.2 Expression von Zyto- und Chemokinen im Verlauf der