und dem Institut für Experimentelle Dermatologie der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster
Die Rolle des Epithels der Haut in der Frühphase der
Leishmania-major-Infektion
INAUGURAL–DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Kirsten Roebrock
aus Bocholt
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth
Prof. Dr. Johannes Roth
1. Gutachter: Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth 2. Gutachterin: Apl.-Prof. Dr. Astrid M. Tenter
Tag der mündlichen Prüfung:24.11.2006
Meinen Eltern
2 LITERATURÜBERSICHT...14
2.1 Das Immunsystem der Haut ... 14
2.1.1 Immunmodulatoren: Zyto- und Chemokine... 15
2.1.2 Keratinozyten als immunologisch aktive Zellen... 16
2.2 Atopische Erkrankungen ... 18
2.2.1 Pathomechanismen der AD... 19
2.3 Leishmaniose ... 22
2.3.1 Entwicklungszyklus der Leishmanien... 22
2.3.2 Experimentelle Leishmaniose ... 23
2.3.3 Resistenz und Suszeptibilität gegenüber einer Infektion mit L. major... 25
2.3.4 Erste Mechanismen am Infektionsort... 26
2.3.5 Funktion dendritischer Zellen und der T-Zell-Aktivierung ... 28
2.3.6 Die Rolle von IL-4 in der T-Zell-Differenzierung... 29
2.3.7 Die Rolle von IL-12 in der T-Zell-Differenzierung... 32
2.3.8 Osteopontin (early T-lymphocyte activation 1) ... 33
2.3.9 Bedeutung der Zusammensetzung und der Kinetik lokal produzierter Immunmodulatoren auf die T-Zell-Differenzierung... 34
2.4 Lasermikrodissektion ... 36
3 ZIELSETZUNG ...39
4 GERÄTE, MATERIAL UND METHODEN...40
4.1 Geräte... 40
4.2 Material... 41
4.2.1 Verbrauchsmaterial ... 41
4.2.2 Reagenzien ... 41
4.2.3 Lösungen und Puffer ... 43
4.2.4 Medien... 48
4.2.5 Antibiotika... 49
4.2.8 Oligonukleotide... 50
4.2.9 Plasmide ... 52
4.2.10 Molekularbiologische Kits... 52
4.2.11 Versuchstiere... 52
4.2.12 Probenmaterial ... 54
4.3 Mikrobiologische Methoden ... 55
4.3.1 Generelle Vorsichtsmaßnahmen im Umgang mit L. major... 55
4.3.2 Leishmanien ... 55
4.3.3 Propagierung von L. major... 55
4.3.4 Kultur von L. major... 56
4.3.5 Auszählung von L. major... 56
4.3.6 Modulation der experimentellen L.-major-Infektion durch I-TAC in vivo ... 56
4.3.7 Limiting dilution assay von L. major... 57
4.4 Molekularbiologische Methoden ... 58
4.4.1 Allgemeine Maßnahmen zur Kontaminationsvermeidung ... 58
4.4.2 RNA-Isolierung... 59
4.4.3 Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung ... 61
4.4.4 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von DNA und RNA ... 61
4.4.5 Reverse Transkription (RT) ... 62
4.4.6 Qualitative PCR – Standard-Polymerase-Kettenreaktion (PCR)... 63
4.4.7 Gelelektrophorese ... 64
4.4.8 Aufreinigung von DNA aus einem Agarose-Gel ... 65
4.4.9 „Vor“-Amplifikation von lasermikrodisseziertem Material ... 65
4.4.10 Quantitative PCR – Real-Time-PCR ... 69
4.4.11 Auswertung der Real-Time-PCR – Relative Quantifizierung ... 71
4.4.12 Klonierungsreaktion... 72
4.4.13 Ligation ... 73
4.4.14 Transformation... 73
4.4.15 Aufreinigung von Plasmid-DNA (Miniprep)... 74
4.4.18 Anzucht positiver Klone ... 76
4.4.19 Aufreinigung von Plasmid-DNA (Maxiprep) ... 76
4.4.20 DIG-markierte RNA-Sondensynthese (in vitro-Transkription) ... 77
4.4.21 Sonden-Hydrolyse... 78
4.4.22 Aufreinigung der fragmentierten Sonden... 78
4.5 Histologische und Immunhistochemische Methoden ... 80
4.5.1 Kryoschnitte (Gefriergewebeschnitte) ... 80
4.5.2 Indirekte Immunfluoreszenz (iIFL)... 80
4.5.3 Färbungen für die Lasermikrodissektion ... 81
4.5.4 Laser Microbeam Microdissection (LMM) und Laser Pressure Catapulting (LPC) (LMPC) ... 81
4.6 Cytogenetische Methoden ... 84
4.6.1 In situ-Hybridisierung (ISH) ... 84
5 ERGEBNISSE ...86
5.1 Optimierung der Präparation von Gefrierschnitten für die Lasermikrodissektion ... 86
5.2 RNA-Qualität und -Quantität am Beispiel von lasermikrodissezierten Leberparenchymzellen ... 86
5.3 Untersuchung verschiedener Lasermikrodissektionsfunktionen... 89
5.4 Auswirkung der RNA-Isolierungsmethode auf die RNA-Ausbeute aus lasermikrodissezierten Keratinozyten ... 92
5.5 Quantifizierung der für die „Vor“-Amplifikation benötigten Keratinozyten ... 94
5.6 Infektionsbedingte Expression von Entzündungsmediatoren in residenten Zellen der Epidermis im Vergleich mit Zellen der Gesamthaut ... 96
5.6.1 Nachweis von Osteopontin ... 98
5.6.2 Nachweis von IL-1β... 99
5.6.3 Nachweis von IL-4... 100
5.6.4 Nachweis von IL-10... 101
5.6.7 Nachweis von IL-18... 104
5.6.8 Nachweis von IFN-γ... 105
5.6.9 Nachweis von TNF-α... 107
5.6.10 Nachweis von TGF-β... 108
5.6.11 Nachweis von S100A8/MRP-8 ... 109
5.6.12 Nachweis von S100A9/ MRP-14 ... 110
5.6.13 Nachweis von MCP-1/ CCL1 ... 111
5.6.14 Nachweis von MIP-1α/ CCL3 ... 112
5.6.15 Nachweis von MIP-1β/ CCL4 ... 113
5.6.16 Nachweis von RANTES/ CCL5 ... 114
5.6.17 Nachweis von MCP-3/ CCL7 ... 115
5.6.18 Nachweis von IP-10/ CXCL10 ... 116
5.6.19 Nachweis von I-TAC/ CXCL11... 117
5.7 Bestätigung der mRNA-Expression von Osteopontin und I–TAC in der Epidermis durch ISH... 118
5.7.1 Nachweis der Osteopontin-mRNA ... 119
5.7.2 Nachweis der I-TAC-mRNA ... 121
5.8 Immunhistochemischer Nachweis von I-TAC in der Epidermis L.-major- infizierter Versuchstiere... 123
5.9 Lokaler Effekt am Infektionsort durch die Applikation von I-TAC im Verlauf einer Infektion mit L. major in resistenten C57BL/6-Mäusen... 125
5.10 Einfluss von I-TAC auf die Parasitendichte in L. major infizierten C57BL/6- Mäusen... 127
6 DISKUSSION ...128
6.1 Methodische Aspekte... 128
6.1.1 Etablierung der Lasermikrodissektion zur Gewinnung muriner Keratinozyten aus Kryoschnitten... 128
6.1.3 Repräsentative Amplifikation kleiner RNA-Mengen ... 131
6.1.4 Real-Time-PCR... 132
6.2 Expression von Zyto- und Chemokinen im Verlauf der L.-major-Infektion ... 133
6.2.1 Infektionsbedingte Expression von Immunmediatoren in der Haut und den Keratinozyten von resistenten Mäusen ... 135
6.2.2 Infektionsbedingte Expression von Immunmediatoren in der Haut und den Keratinozyten von suszeptiblen Mäusen... 141
6.2.3 Der pharmakologische Einfluss von I-TAC in L.-major-infizierten, resistenten Mäusen ... 146
6.2.4 Können Keratinozyten das spezifische Immunsystem beeinflussen, indem sie die Th-Zell-Differenzierung modulieren?... 147
7 ZUSAMMENFASSUNG...150
8 SUMMARY...153
9 LITERATURVERZEICHNIS ...156
10 DANKSAGUNG ...191
A. bidest. Aqua bidestillata
AD atopische Dermatitis
APC antigen presenting cell (Antigen-präsentierende Zelle)
BSA Bovines Serum Albumin
bspw. beispielsweise
ca. circa
CCR Rezeptoren der C-C Chemokin Unterfamilie
CD Cluster of Differentiation (System zur Bezeichnung von Differenzierungsantigenen)
CD25+ Zellen, die das Differenzierungsantigen CD25 an der Oberfläche exprimieren
CD4+ Zellen, die das Differenzierungsantigen CD4 an der Oberfläche
exprimieren
CD8+ Zellen, die das Differenzierungsantigen CD8 an der Oberfläche
exprimieren
cDNA komplementäre DNA (Desoxyribonukleinsäure) CL cutaneous Leishmaniasis (kutane Leishmaniose)
CO2 Kohlenstoffdioxid
CR Complement Receptor (Komplementrezeptor) CTACK cutaneous T-cell attracting chemokine
DC dendritic cells (dendritische Zellen)
DEPC Diethylpyrokarbonat
DMSO Dimethylsulfoxid
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
Eotaxin eosinophil chemotactic protein
F forward (vorwärts)
Fc Fragment cristalline (kristallisierbarer Antikörperteil, carboxy- terminales Ende des Immunglobulins
FCS fetal calf serum (foetales Kälberserum) Fcε−RI hochaffiner IgE-Rezeptor
FITC Fluoreszeinisothiocyanat
FU Fluorescence Units (Fluoreszenzeinheiten) IDEC inflammatorische dendritische epidermale Zellen I-309 inflammatory cytokine I-309
IFN-γ Interferon-gamma
IgE/ G Immunglobulin E/ G
iIFL indirekte Immunfluoreszenz
IL Interleukin
iNOS inducible nitric oxide synthase (induzierbare NO Synthase) IP-9 IFN-γ-inducible protein-9
IP-10 interferon (gamma)-induced protein of 10kDa
ISH in situ-Hybridisierung
I-TAC interferon (gamma)-induced T-cell alpha chemoattractant IU international units (internationale Einheiten)
LB Luria Bertani
LC Langerhans cells (Langerhans-Zellen)
L. major Leishmania major
Lm Leishmania major
Lsg. Lösung
m milli (x 10-3)
mA milliampere
M Molar (Mol/L)
MCL mucocutaneous Leishmaniasis (mukokutane Leishmaniose) MCP-1 bis 5 macrophage chemotactic proteins 1 and 3
MDC macrophage-derived chemokine
MG Molekulargewicht
MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex)
MIG monokine induced by IFN-γ
Min. Minute(n)
MIP-1α und 1β macrophage inhibitory proteins 1α und 1β mRNA messenger-RNA (Ribonukleinsäure)
MW arithmetischer Mittelwert
n nano (x 10-9)
(n) eine Variable, deren Werte auf natürliche Zahlen beschränkt sind
NaCl Natriumchlorid
NC/Nga-Mäuse Mausinzuchtstamm der einen der AD ähnlichen Phänotyp entwickelt
n.d. nicht detektierbar
n-fold Regulationsfaktor
NK-Zellen natürliche Killerzellen
NLDC145+ DC-Zell-Marker
NO Stickstoffmonoxid
Nr. Nummer
nt Nukleotid
OCT optimal cutting temperature
p Wahrscheinlichkeit mit der die Hypothese nicht zutrifft pg picogramm (x 10-12)
PBS Phosphate Buffered Saline (Phosphat-gepufferte Salzlösung) PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion) p.i. post infectionem, nach Infektion
PMN polymorphonuclear leukocytes (hier Granulozyten inklusive Basophile und Eosinophile)
PV parasitophore Vakuole
R reverse (rückwärts)
RANTES Bezeichnung eines Chemokins: “regulated upon activation, normally T-expressed, and presumably secreted”
s. siehe
S. Seite
s.c. subkutan
SCID Severe Combined Immunodeficiency Disease Scl1 Susceptibility to cutaneous leishmaniasis 1 SD Standard Deviation (Standardabweichung) SDM Medium Schneider`s Drosophila Medium
Sek. Sekunde(n)
SEM Standard error of mean (Standardfehler)
Std. Stunde(n)
Tab. Tabelle
TARC Th2-type CC chemokine thymus and activation-regulated chemokine
Taq Thermophilus aquaticus
TBE-Puffer Tris-Borat-EDTA-Puffer
T-bet T-box expressed transcription factor (ein Th1-spezifischer Transkriptionsfaktor, der die Differenzierung vonTh2- in Th1-
Lymphozyten initiieren kann).
TCR T-cell-receptor (T-Zell-Rezeptor) TGF-ß Transforming growth factor ß
Th1 T-Helfer Zelle vom Typ 1 Th2 T-Helfer Zelle vom Typ 2 Thy1.2+ T-Zell-Marker
T-memory-Zellen T-Gedächtnis-Zellen
TNF-α Tumornekrosefaktor α
U Units (Einheiten)
u.a. unter anderem
Units Einheiten
v/v Volumen pro Volumen
VL visceral Leishmaniasis (viszerale Leishmaniose) well Vertiefung einer Mikrotiterplatte
z.B. zum Beispiel
μ mikro (x 10-6)
1 EINLEITUNG
Entzündliche Hautkrankheiten, die mit einem Ungleichgewicht der Immunantwort, insbesondere mit einer gestörten Entwicklung von sogenannten Th1- und Th2-Lymphozyten, einhergehen wie bspw. die Volkskrankheit Psoriasis und die atopische Dermatitis (AD) haben bei Mensch und Tier im Laufe der Zeit zunehmend an Bedeutung gewonnen. So liegt die Prävalenz der AD unter deutschen Schulkindern derzeit bei 15-20 %. Zu den betroffenen Tieren gehören insbesondere Pferde, Katzen und Hunde, bei denen die Häufigkeit bei 3-15 % liegt, jedoch werden bis zu 30 % in Überweisungspraxen diagnostiziert. Der genaue Pathomechanismus dieser Erkrankung ist derzeit nicht bekannt, und zudem gibt es nur wenige Studien, die sich mit der Bedeutung der Haut als lokal immunologisch wirksames Organ hinsichtlich der Auswirkungen auf die T-Zell-Differenzierung in Th1- und Th2-Zellen befassen. Zusätzlich ist trotz einiger Fortschritte auf dem Gebiet der Behandlung dieser Erkrankung eine kausale und effiziente Therapie derzeit nicht verfügbar.
Für die Erforschung der natürlichen Infektresistenz und der zellulären Immunantwort von Th1- und Th2-Lymphozyten ist die Infektion von Mausinzuchtstämmen mit Leishmania major ein geeignetes Model. Bei diesem Modell führt die Infektion mit dem Erreger der kutanen Leishmaniose in resistenten Mausstämmen zu einer Th1-Antwort, die gekennzeichnet ist durch die Ausbildung einer lokal begrenzten, selbstheilenden kutanen Läsion, die lebenslange Immunität hinterlässt. Bei anfälligen Mausstämmen kommt es hingegen zur Entwicklung einer Th2-Antwort, die in einer letalen, generalisierten Infektion des gesamten retikulo-endothelialen Systems (RES) endet.
Aufgrund der Vielzahl entzündlicher Hauterkrankungen, die mit einer veränderten T-Zell- Differenzierung einhergehen, wird im Folgenden die AD als Beispiel für die involvierten Mechanismen verwendet.
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Das Immunsystem der Haut
Vor nicht allzu langer Zeit war man noch der Meinung, dass die Schutzmechanismen der Haut und das Immunsystem unabhängig voneinander arbeiten. Die Haut schien mechanisch das Eindringen fremder Antigene in den Körper zu blockieren; das Immunsystem bekämpfte diejenigen Antigene, die dennoch in den Körper hineingelangten. Heute ist bekannt, dass die Haut ein immunologisch aktives Organ darstellt, welches an der immunologischen Überwachung und Reaktivität beteiligt ist. Diese Erkenntnis führte dazu, dass die Haut heute als Teil des Immunsystems verstanden wird; man spricht von dem Hautimmunsystem (BOS 1997).
Das Immunsystem wird in drei separate Bereiche unterteilt, nämlich in das humorale, das zelluläre und in das unspezifische System. Die vier Typen der Hypersensibilitätsreaktionen, wie sie von COOMBS und GELL (1963) definiert wurden, beruhen auf dieser Unterteilung (HALLIWELL u. GORMAN 1989, TIZARD 1996, ROITT et al. 1998) und sind ein gutes Beispiel für die Bedeutung des Hautimmunsystems im Rahmen von Hautallergien oder chronischen Ekzemen.
Die Entzündung ist ein komplexer Vorgang, an dem Elemente unspezifischer, zellulärer und humoraler Immunität, sowie eine Kaskade untereinander reagierender, löslicher Mediatoren-, der Zytokine und Chemokine beteiligt sind. Antigene (Proteine/Glykoproteine) die in die Hautschichten gelangen, werden zunächst in den meisten Fällen phagozytiert, metabolisiert und in kleinere Untereinheiten zerlegt, die an den Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC) Klasse-II binden. Dieser Peptid-MHC-Komplex wandert zur Oberfläche der Antigen präsentierenden Zelle (APC), wo er mit T-Zell-Rezeptoren (TCR) für dieses spezifische Antigen interagiert. Als APC dienen mononukleäre Phagozyten (Monozyten, Makrophagen), dendritische Zellen und B-Lymphozyten (BOS 1989, NICKOLOFF 1993, TIZARD 1996).
Die dendritische Zellpopulation der Haut setzt sich aus Langerhans-Zellen (LC) und dermalen Dendrozyten zusammen. LC, die von Knochenmarkszellen abstammen repräsentieren 3-4 % Prozent der Zellpopulation der Epidermis. Sie exprimieren sowohl MHC-Klasse-II-Moleküle
als auch die Rezeptoren für bestimmte Komplementfaktoren (C3b) und den Fc-Bereich von IgG und IgE. Ihre Hauptfunktion besteht in der Verarbeitung und Präsentation von Antigenen.
Die Wechselwirkung von APC und T-Zelle über den trimolekularen TCR-Peptid-MHC- Komplex löst eine spezifische Immunreaktion gegen das betreffende Antigen aus.
Keratinozyten können ebenfalls MHC-Klasse-II-Moleküle exprimieren, ihre Bedeutung bei der Antigenpräsentation ist allerdings noch nicht schlüssig bewiesen (REEDY et al. 2002).
2.1.1 Immunmodulatoren: Zyto- und Chemokine
Zytokine sind lösliche Proteine mit niedrigem Molekulargewicht die als chemische Botenstoffe das angeborene (unspezifische) und erworbene (spezifische) Immunsystems regulieren. Sie werden von praktisch allen Zellen gebildet, die mit dem Immunsystem in Beziehung stehen. Bei Aktivierung der Zytokin-produzierenden Zellen synthetisieren und sezernieren diese ihre Botenstoffe, welche an spezifische Zytokinrezeptoren auf anderen Zellen des Immunsystems binden und so deren Aktivität beeinflussen. Zytokine sind pleiotrop, da sie auf eine Vielzahl unterschiedlicher Zellen wirken und redundant, da unterschiedliche Zytokine die gleiche Funktion ausüben können. Zudem sind sie multifunktional, da ein Zytokin mehrere unterschiedliche Funktionen regulieren kann. Einige Zytokine wirken antagonistisch indem ein Zytokin eine bestimmte Abwehrfunktion stimuliert die ein anderes Zytokin hemmt. Andere Zytokine sind synergistisch in ihrer Wirkung indem die Kombination verschiedener Zytokine einen größeren Effekt hat als die einzelnen Proteine (PAUL 1989, LEONARD 1994, JANEWAY et al. 2002).
Zu den Zytokinen, die in den allerersten Phasen einer Infektion in dem betroffenen Gewebe freigesetzt werden, gehören zudem Vertreter einer Familie von chemotaktisch aktiven Zytokinen, die man als Chemokine bezeichnet. Chemokine werden entsprechend der Anordnung von zwei Cystein Gruppen unterteilt in die C-X-C Unterfamile (α Chemokine) wozu das als erstes charakterisierte Interleukin-8 (IL-8) gehört sowie die C-C Unterfamile (β Chemokine), wozu bspw. die „monocyte chemoattractant proteins“ (MCP) und das
„macrophage inflammatory protein α“ (MIP-1α) gehören. Die α Chemokine locken hauptsächlich neutrophile Granulozyten zu Infektionsherden während die β Chemokine
größtenteils auf Monozyten, T-Lymphozyten, und Natürliche Killerzellen (NK) wirken (SCHALL u. BACON 1994).
2.1.2 Keratinozyten als immunologisch aktive Zellen
Da die Keratinozyten sowohl eine Vielzahl von Zytokinen und Chemokinen produzieren als auch Adhäsionsmoleküle exprimieren, spielen sie zweifelsohne eine Schlüsselrolle bei den entzündlichen Reaktionen (BOS et al. 1989, SUTER et al. 1996). Stimulierte Keratinozyten sezernieren proinflammatorische Zytokine um epidermale und dermale Zellen zu aktivieren und bilden Chemokine für die Rekrutierung von Leukozyten ins entzündliche Gewebe.
Desweiteren sind sie durch Regulierung der Proliferation und Differenzierung epidermaler Zellen und Unterstützung der Funktion und Migration von LC wesentlich an der Homeostase der Haut beteiligt. Die Tabellen 1 und 2 geben eine Übersicht der Rezeptoren und Zyto- /Chemokine deren Expression oder Sekretion durch Keratinozyten bisher nachgewiesen werden konnte (WANG et al 1999, UCHI et al. 2000).
Tab. 1: Zyto- und Chemokin-Rezeptoren auf Keratinozyten
Rezeptoren Rezeptor vermittelte Antwort
IL-1R1 Zytokin Ausschüttung
IL-1R2 Hemmt lokale IL-1 Produktion
IL-4R IL-6 Produktion
IL-6R Wachstums Induktion
IL-10R Hemmt HLA-DR Produktion?
IL-13R IL-6 Produktion
IL-17R Zytokin Ausschüttung
TNF-α Zytokin Ausschüttung, ICAM-1 Induktion
EGF-R Wachstums Induktion
FGF-R1 (Ratte) Wachstums Induktion
KGF-R Wachstums Induktion
IGF-1R Wachstums Induktion
NGF Wachstums Induktion
ET-1 Wachstums Induktion
TGF-β Kontrolle der Differenzierung
LIF-R Unbekannt
IFN-α/β Wachstums Hemmung
IFN-γ Induziert HLA-DR und ICAM-1
CXCR2, CCR6 Unbekannt
Tab. 2: Zyto- und Chemokine die von Keratinozyten produziert werden und ihre Hauptfunktion in der Haut
Zyto-/Chemokin Hauptfunktion in der Haut
IL-1α, β Initiierung der Immun Reaktion
IL-1Ra Kompetitiver IL-1 Inhibitor
IL-4 Th-Zell Differenzierung
IL-10 Th1 Hemmung
IL-12 Th1 Induktion
IL-18 Kofaktor der Th1 und Th2 Induktion?
TNF-α Induziert Adhäsions Moleküle
GM-CSF Moduliert die Funktion von LC
M-CSF Unbekannt IL-3 (Maus) Mastzellen Wachstumsfaktor
IL-6 Keratinozyten Proliferation
IL-7, IL-15 T-Zellen Wachstumsfaktor
TGF-α Verstärkt die Motilität von Keratinozyten Amphiregulin, HB-EGF Keratinozyten Wachstumsfaktor
BFGF Keratinozyten Wachstumsfaktor
FGF-10 Haar Wachstumsfaktor
IGF-II Keratinozyten Wachstumsfaktor
NGF Keratinozyten und MelanozytenWachstumsfaktor
VEGF Endothelzellen Wachstumsfaktor
PDGF Fibroblasten und Glatte Muskelzellen Wachstumsfaktor ET-1 Keratinozyten und MelanozytenWachstumsfaktor SCF Mastzellen und Melanozyten Wachstumsfaktor LIF Unbekannt
IFN-β Infektionsabwehr
IFN-γ Th1 Induktion?
TGF-β1 Hemmt Keratinozyten Wachstum, induziert Birbeck Granula
MIP-3α Chemotaktisch für LC über CCR6
SDF-1α Chemotaktisch für LC über CXCR4?
IP-9, IP-10, MIG T-Zell Chemotaxis über CXCR3 IL-8, GROα Neutrophilen Chemotaxis über CXCR2 RANTES, MCP-1 Inflammatorische Chemotaxis
2.2 Atopische Erkrankungen
Der Begriff „Atopie“ (griechisch Atopia = Ungewöhnlichkeit, Seltsamkeit) wurde erstmalig von COCA und COOKE (1923) als klinisches Bild einer Überempfindlichkeitsreaktion oder einer allergischen Reaktion vom Typ I beschrieben. Zu den atopischen Erkrankungen gehören das allergische Asthma, die allergische Rhinitis und Konjunktivitis und das atopische Ekzem.
Heute versteht man unter dem Begriff Atopie, eine genetisch bedingte Disposition zur spontanen Entwicklung einer Typ-I-Überempfindlichkeitsreaktion gegenüber Inhalations- oder perkutan aufgenommenen Allergenen, die normalerweise harmlose Substanzen darstellen (REEDY et al. 2002). Bei der Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ I nach COOMBS und GELL (1963) werden B-Zellen zur Bildung von spezifischem IgE durch T-Zell-Hilfe angeregt. Dieses antigenspezifische IgE bindet über Fc-Rezeptoren an Mastzellen, wodurch diese sensibilisiert werden. Beim nächsten Antigenkontakt mit der sensibilisierten Mastzelle wird das gebundene IgE kreuzvernetzt, und die Zelle degranuliert unter Freisetzung von Mediatoren, welche die bekannten Symptome wie Asthma bronchiale, allergische Rhinokonjunktivitis oder atopisches Ekzem hervorrufen. Bei der durch IgE vermittelten allergischen Reaktion lassen sich eine frühe und eine späte Phase unterscheiden.
Die Sofortreaktion beruht auf der Wirkung von Histamin und anderen, von den Mastzellen ausgeschütteten, schnell metabolisierten Effektoren. Die Entzündungseffekte von Histamin erklären sich aus seinen pharmakologischen Eigenschaften, die über H1-Rezeptoren auf Blutgefäße, glatte Muskulatur und die Oberfläche von Schleimhäuten einwirken. Die Spätreaktion wird durch eingewanderte inflammatorische Leukozyten hervorgerufen, die durch Chemokine und andere von den Mastzellen während oder nach der Sofortreaktion freigesetzte Mediatoren angelockt werden. Immunologisch wird die verstärkte IgE-Bildung bei der Atopie durch ein Überwiegen der Th2-Immunantwort gesteuert, bei partieller Unterdrückung der Th1-Immunantwort (ROITT et al. 1991).
Bei Menschen und Haustieren ist die AD eine mit starkem Juckreiz einhergehende entzündliche Hauterkrankung mit akut-entzündlichem, chronischen oder chronisch- rezidivierenden Verläufen. Die Erkrankung ist weltweit verbreitet und tritt aufgrund der genetischen Prädisposition bei bestimmten Rassen oder Familien gehäuft auf. Die am
häufigsten betroffenen Stellen sind Schnauze (Gesicht), Pfoten (Handrücken), Flexor-und Extensorflächen (REEDY et al. 2002).
Die Atopie der Hunde weist viele Gemeinsamkeiten mit ihrem Gegenstück beim Menschen auf:
• Familiäre Disposition,
• Auftreten im Jugendalter,
• Chronischer Pruritus,
• Typische Hautveränderungen an den Beuge- oder Streckseiten der Extremitäten,
• Sofortreaktion im Hauttest (HELTON RHODES et al. 1987, RHODES et al. 1987)
2.2.1 Pathomechanismen der AD
Der der AD zugrundeliegende Pathomechanismus ist noch nicht vollständig geklärt; es liegt wahrscheinlich eine Kombination von defekter zellulärer Immunantwort, IgE-mediierter Immunreaktion und äußeren Faktoren die zu einer Verschlimmerung der Symptomatik führen (z.B. durch Staphylokokkenprodukte, Malassezia Hefen) vor. Sowohl beim Menschen (VAN DER HEYDEN et al. 1991, ZACHARY et al. 1995) als auch beim Hund (NIMMO WILKIE et al. 1991, 1992) wurden bei atopischen Patienten Veränderungen der zellvermittelten Immunität beobachtet. Außerdem weisen sowohl erkrankte Hunde (WILLEMSE et al. 1985, KLEINBECK et al. 1989) als auch der Großteil betroffener Menschen (PARISH 1981, UEHARA 1986) erhöhte Serumkonzentrationen von allergenspezifischem IgE und einigen Untergruppen von IgE auf. Aus pathogenetischer Sicht ist die AD durch eine inadäquate T- Zell-Antwort definiert. Die T-Zell-Reaktion hat bei Mensch und Hund (SINKE et al. 2002) eine Prägung vom Th2-Typ, der gekennzeichnet ist durch die Bildung von Interleukin (IL)-4, IL-5, IL-6 und IL-13. Daraus resultiert eine unangemessene und erhöhte IgE-Produktion. Die Ekzemreaktion basiert auf erhöhtem spezifischem IgE, das über Fcε-Rezeptoren (Fcε-R) (HAAS et al. 1992) an Langerhans-Zellen und inflammatorische, dendritische, epidermale Zellen (IDEC) bindet. Bei Allergenexposition wird das Antigen durch diese Zellen prozessiert und den T-Zellen präsentiert, dies induziert eine gezielte T-zelluläre Antwort. Während IDEC bereits früh in der Entwicklung von AD betroffenen Hautbereichen in die Epidermis einwandern, findet die Expression des Fcε-RI auf ihrer Oberfläche erst später in der
chronischen Phase statt (KERSCHENLOHR et al 2003). Fcε-RI-aktivierte IDEC instruieren naive T-Zellen zu IFN-γ produzierenden T-Zellen und der Ausschüttung von IL-12 und IL-18, wodurch möglicherweise die Umwandlung von einer Th2- zu einer Th1-Antwort bedingt ist.
In der Tat werden in chronisch veränderter Haut höhere Mengen dieser Zytokine gefunden, weshalb man auch von einem biphasischen Verlauf der AD spricht, gekennzeichnet durch eine akute Th2-dominierte und chronische Th1-dominierte Phase (HAMID et al. 1994).
Die European Academy of Allergology and Clinical Dermatology (EAACI) hat eine neue Nomenklatur der AD vorgeschlagen, da es eine allergische IgE-assoziierte Form der AD, das
„allergic Atopic eczema/dermatitis syndrome“ (AAEDS) welches 70–80 % der Patienten betrifft und eine nicht-allergische Form, das „nonallergic Atopic eczema/dermatitis syndrome“ (NAAEDS) gibt (JOHANSSON et al 2001), das bei 20–30 % der Patienten beobachtet wird (NOVAK et al. 2003). Patienten mit NAAEDS zeigen keine respiratorischen Symptome, wie bronchiales Asthma oder allergische Rhinitis, haben normale IgE Level im Serum, kein spezifisches IgE und negative Haut-Prick Test Ergebnisse gegenüber Aero- oder Nahrungsallergenen. Immunologische Unterschiede bestehen zudem zwischen diesen beiden Formen hinsichtlich des Zytokinmusters im peripheren Blut und der betroffenen Hautbereiche sowie in der phänotypischen Charakterisierung epidermaler dendritischer Zellen (WUTHRICH et al. 2003). Beide Formen gehen mit einer Eosinophilie einher. Bei dem AAEDS produzieren die T-Gedächtnis-Zellen erhöhte Mengen an Th2-Zytokinen, wie IL-4 und IL-13, die die Synthese von IgE induzieren, sowie IL-5 welches maßgeblich an der Entwicklung von eosinophilen Granulozyten beteiligt ist (SICHERER u. LEUNG 2004).
Diese T-Zellen produzieren außerdem abnorm geringe Mengen von IFN-γ, welches als Th1-Zytokin die Th2-Zell Funktion inhibiert. Das NAAEDS ist assoziiert mit einer vergleichsweise geringeren Produktion von IL-4 und IL-13. In beiden Formen wird eine IL-10 vermittelte Th2-Zell-Differenzierung vermutet (LAOUINI et al. 2003, HOWELL et al.
2005).
Beim Menschen mit AD enthält die Haut ein Infiltrat, das sich vorwiegend aus CD4+-T-Zellen und einer kleinen Anzahl von CD8+-T-Zellen zusammensetzt, die vermutlich über eine zytotoxische und suppressive Wirkung verfügen (LEUNG et al. 1981, LEVER et al.
1987). SINKE et al. (1997) berichteten, dass besonders in veränderter atopischer Epidermis
des Hundes ein Anstieg von CD4+-T-Zellen zu beobachten war. In unveränderter atopischer Haut dagegen infiltrieren sowohl CD4+- als auch CD8+-T-Zellen die Epidermis ohne erkennbare Bevorzugung der CD4+-T-Zellen. In der Dermis atopischer Hunde war lediglich die Anzahl der CD8+-T-Zellen erhöht. Daraus wurde geschlossen, dass CD8+-T-Zellen wahrscheinlich wichtige Regulatoren bei der AD von Hunden sind (SINKE et al. 1997, OLIVRY et al. 1997). Untersuchungen zeigten dass sich das Hautinfiltrat atopischer Hunde hauptsächlich aus Mastzellen, dendritischen APC (die wahrscheinlich von LC abstammen) und T-memory-Zellen zusammensetzt. Eosinophile und degranulierte Eosinophile wurden nur in der Epidermis veränderter atopischer Haut nachgewiesen. Ebenso wurden T-Lymphozyten, die den γδ-T-Zellrezeptor exprimieren in der Epidermis oder Dermis aller atopischen Hunde, jedoch nur selten bei gesunden Tieren beobachtet (OLIVRY et al. 1997). Diese Beobachtungen stehen im Gegensatz zu Ergebnissen beim Menschen, wo eine reduzierte Anzahl dieser T-Zellen im peripheren Blut nachgewiesen wurde. Da die γδ-T-Zellen IFN-γ sezernieren, könnte ihre Reduzierung die IgE–Produktion potenzieren.
Auch Chemokine prägen das Infiltrat akuter und chronischer Läsionen (BLAUVELT et al.
2003, ONO et al. 2003, LEUNG et al. 2004). So scheinen das „Th2-type CC chemokine thymus and activation-regulated chemokine“ (TARC, CCL17), das „macrophage-derived chemokine“ (MDC, CCL22) und das „inflammatory cytokine I-309“ (I-309, CCL1) an einer Amplifikation der ursprünglich allergischen Entzündungsreaktion teilzuhaben. Das Chemokin mit der Bezeichnung „regulated upon activation, normally T-expressed, and presumably secreted“ (RANTES, CCL5), sowie das „monocyte chemoattractant protein 4“ (MCP-4, CCL13) und das „eosinophil chemotactic protein“ (Eotaxin, CCL11) sollen darüber hinaus an einer Rekrutierung von Eosinophilen und Th2-Zellen in die Region der Läsionen verantwortlich sein. Auch das „cutaneous T-cell attracting chemokine“ (CTACK, CCL27), ein hautassoziiertes Chemokin, soll am sog. „T-cell-homing“ beteiligt seint. Weiterhin ist CTACK, bei AD-Patienten deutlich hochreguliert. Ebenfalls hochreguliert sind MDC und TARC, die selektiv CCR4-exprimierende Th2-Zellen anlocken, wobei der Schweregrad der AD mit den TARC-Spiegeln positiv korreliert (HIJNEN et al. 2004). Th1-Zell-Migration auf der anderen Seite scheint durch erhöhte Level des „interferon (gamma)-induced protein of 10kDa“ (IP-10, CXCL10), sowie des „monokine induced by IFN-γ“ (MIG, CXCL9) und des
„interferon (gamma) induced T-cell alpha chemoattractant“ (I-TAC, CXCL11) in Keratinozyten ausgelöst zu werden (KLUNKER et al. 2003).
2.3 Leishmaniose
Die Leishmaniose ist eine Infektion mit parasitisch lebenden Protozoen der Klasse Kinetoplastea, Ordnung Trypanosomatida, von denen bisher 30 Arten der Gattung Leishmania bekannt sind (ASHFORD 2000). Die Leishmanien wurden von CUNNINGHAM (1885) als erster entdeckt und nach dem britischen Tropenarzt Sir William Boog Leishman benannt (HANDMAN 1999). Weltweit sind 12 Millionen Menschen in 88 Ländern von der Infektionskrankheit betroffen, die sich laut WHO mit einer jährlichen Inzidenz von rund 2 Millionen Fällen abhängig von der Leishmanienspezies in einer kutanen- (CL), mukokutanen- (MCL), viszeralen- (VL) oder diffusen-kutanen- (DCL) Leishmaniose äußert.
2.3.1 Entwicklungszyklus der Leishmanien
Im natürlichen System dienen Nager und andere Kleinsäugetiere als Reservoire für den Erreger der CL, während der Erreger der VL vornehmlich von Hunden, aber auch Füchsen und Schakalen beherbergt wird. Durch den Biß eines Insektenvektors, der weiblichen Schmetterlingsmücke (Phlebotomus oder Lutzomyia) werden die Leishmanien wiederum auf Wirbeltiere oder den Menschen übertragen. Die mit der Blutmahlzeit aufgenommenen Leishmanien befinden sich in einem amastigoten, unbeweglichen Stadium und transformieren im Mitteldarm des Insekten-Vektors innerhalb von 4-25 Tagen zu promastigoten, teilungsfähigen Leishmanien, die durch Ausbildung eines Flagellums beweglich sind (SACKS 1989). Über den Speichel und durch Regurgitation des Mageninhaltes der Schmetterlingsmücke gelangen die nun metazyklisch promastigoten Leishmanien während erneuter Blutmahlzeit in die Stichwunde des Wirbeltieres. Leishmanien sind in ihrer amastigoten Form obligat intrazellulär lebende Parasiten, die vermittelt über den Komplementrezeptor 3 (CR3) auf der Oberfläche von Phagozyten in membranständige Phagosomen aufgenommen werden (MOSSER u. EDELSON 1985, SCHONLAU et al.
2000). Diese fusionieren mit sekundären Lysosomen zu Phagolysosomen, der so genannten parasitophoren Vakuole (PV) (CHANG 1983). Innerhalb von 2-5 Tagen erfolgt in den
Phagolysosomen eine Ausdifferenzierung zur replizierenden amastigoten Form. Die Replikation in den Phagozyten erfolgt solange, bis die Zelle ruptiert und die frei werdenden Leishmanien von neuen Makrophagen phagozytiert werden. Kann dieser Kreislauf nicht durch körpereigene Abwehrmechanismen gestoppt werden, wie bspw. nach Infektion mit Leishmania donovani, Leishmania infantum oder Leishmania chagasi, kommt es zur Viszeralisierung; einer Ausbreitung des Parasiten in die lymphatischen Organe, die unbehandelt letal endet. Eine Infektion mit Leishmania major führt zur Entwicklung lokal begrenzter Haut-Läsionen die spontan abheilen und eine lebenslange Immunität hinterlassen.
Abb. 1: Schematische Darstellung des Entwicklungszyklus der Leishmanien (Modifiziert nach einer Abbildung der WHO, Life-cycle of Leishmania) [http://www.who.int/tdr/diseases/leish/lifecycle.htm], 2006
2.3.2 Experimentelle Leishmaniose
Die Infektion von Mausinzuchtstämmen mit dem Protozoon L. major, die experimentelle Leishmaniose, ist ein ausgezeichnetes Modell für die Erforschung der natürlichen Infektresistenz und der Entwicklung einer T-Helfer (Th)1/Th2-Zell-vermittelten Immun-
antwort (ETGES u. MÜLLER 1998, BEEBE et al. 1999, LAUNOIS et al. 1999, SACKS u.
NOBEN-TRAUTH 2002).
Bei dem konventionellen L.-major-Maus-Modell wird eine hohe Dosis (2 x 105 – 2 x 107) in vitro kultivierter promastigoter Leishmanien der metazyklischen Entwicklungsphase subkutan in den Rücken oder die Hinterfußsohle injiziert. Eine Anzahl weiterer Varianten dieses Modells ist beschrieben worden, wodurch Unterschiede im Verlauf der Infektion beobachtet wurden. Dazu gehörten die Verwendung von Leishmanien unterschiedlicher Entwicklungszustände (SACKS et al. 1985), alternative Inokulationsrouten wie bspw.
intravenös, intradermal und intranasal (NABORS et al. 1995, BELKAID et al. 2000, CONSTANT et al. 2000), sowie eine natürliche Infektion durch den Schmetterlingsmücken- Vektor (KAMHAWI et al. 2000). Unterschiede wurden auch durch die Verwendung unterschiedlicher Leishmanienstämme beobachtet (NOBEN-TRAUTH et al. 1999). Zu den meist verwendeten Stämmen gehören Friedlin (Jordan Valley, WHOM/IL/80/FN), IR173 (Iran, WHOM/IR/-173), LV39/Neal (Southern Russia, MRHO/SU/59/P), NIH/Seidman (West Africa, MHOM/SN/74/S), und CC-1 (Iran, MHOM/IR/83/LT252). (SACKS u. NOBEN- TRAUTH 2002). Die genannten Orte (bspw. Jordan Valley) beziehen sich hierbei auf den Ort an dem der jeweilige Stamm isoliert wurde und die nachgestellte Bezeichnung (bspw.
WHOM/IL/80/FN) bezieht sich auf einen von der WHO vergebenen Code. Zusätzlich bestimmen die Anzahl injizierter Parasiten (DOHERTY et al. 1996), sowie das Alter der verwendeten Versuchstiere (EHRCHEN et al 2004) das Geschehen.
Abb. 2: Zeitliche Entwicklung des L.-major-Maus-Modells (modifiziert nach SACKS u. NOBEN-TRAUTH 2002)
2.3.3 Resistenz und Suszeptibilität gegenüber einer Infektion mit L. major
Alle bisher untersuchten Mausstämme konnten mit Leishmanien infiziert werden, jedoch spricht man von resistenten Mäusen bei denen die Infektion in Form einer auf die Haut und Lymphknoten beschränkten, spontan ausheilenden Erkrankung abläuft (z.B. C56BL/6- oder C3H-Mäuse). Als suszeptibel werden jene Stämme bezeichnet, bei denen die Infektion zu einer nicht-abheilenden und abhängig von der Leishmanien Spezies und Dosis tödlichen Ausbreitung des Parasiten führt (z.B. Balb/c-, C57BL/10ScCr-, DBA/2- oder SWR- Mäuse) (BEHIN et al.1979, HANDMAN et al. 1979, NABORS u. FARRELL 1994).
Der Hintergrund der Resistenz und Suszeptibilität wird seit langem diskutiert. Die Resistenz gegenüber L. major ist gekoppelt an die Differenzierung von CD4+-T-Lymphozyten zu Th1-Zellen (BOGDAN u. ROLLINGHOFF 1998, JANKOVIC et al. 2001, SACKS u.
NOBEN-TRAUTH 2002, GUMY et al. 2004) und bei initial niedriger Parasitenzahl auch an zytotoxische T-Zellen (CTL oder auch CD8+-Zellen genannt) (BELKAID et al. 2002). Diese aktivieren vermittelt durch IL-12 die Makrophagen zur Freisetzung von Interferon-γ (IFN-γ), zur Produktion der „inducible nitric oxide synthase“ (iNOS) und dem leishmaniziden Stichstoffmonoxid (NO). Die Produktion von NO und reaktiven Sauerstoffverbindungen führt letztendlich zur Abtötung der intrazellulären Parasiten (LIEW u. O´DONELL 1993, WEI et al. 1995). In suszeptiblen Mäusen kommt es hingegegen zu einer Vermehrung L.-major- spezifischer Th2-Zellen die unter anderem IL-4, IL-10 und IL-13 sezernieren (SACKS u.
NOBEN-TRAUTH 2002) und dadurch eine Th1-Antwort hemmen sowie die Makrophagen deaktivieren.
Es bestehen verschiedene, genetische Unterschiede zwischen den Mausstämmen, die für die unterschiedliche Resistenz verantwortlich gemacht werden. Die ursächlichen Resistenz- faktoren sind aber noch nicht identifiziert worden. Zum einen wird das Gen für den Transkriptionsfaktor des Interferon-regulatory factor 1 als Resistenzfaktor beschrieben (LOHOFF et al. 1997) und zum anderen die Loci mit der Bezeichnung „susceptibility to cutaneous leishmaniasis 1“ (Scl1 oder humanes 17q) auf Chromosom 11 und Scl2 auf Chromosom 4 (GORHAM et al. 1996) sowie Gene auf sechs weiteren Loci (DEMANT et al.
1996, BEEBE et al. 1997). Der Scl1 Locus beinhaltet Gene wie Nos2 das für iNOS codiert und eine Reihe von Zytokinen die von aktivierten Makrophagen gebildet werden, wie z.B.
MCP-1 und MCP-2, MIP-1α und 1β sowie RANTES (ETGES u. MÜLLER 1998).
ROBERTS et al. (1997) postulierten, dass die Resistenz durch das Heterochromatin (H-Region) auf Chromosom 17 und 9 kontrolliert wird (ROBERTS et al. 1997). Neueste Untersuchungen erweiterten die Anzahl beteiligter Gen-Loci auf 17, von denen jeder einzelne unterschiedliche immunologische und pathologische Faktoren kontrolliert (HAVELKOVA et al. 2006).
Eine lebenslange Resistenz erfordert nicht nur eine Th1-Antwort, sondern eine kontinuierliche IL-12-Produktion (SCOTT 2003). Gewiss ist auch, dass eine geringe Anzahl an Leishmanien unbegrenzt in den DC der den Infektionsort drainierenden Lymphknoten verbleiben können (MOLL et al. 1995). Diese DC sind vermutlich für die Antigenpräsentation an T-memory-Zellen zuständig, wodurch die Th1-Antwort über IL-12-Produktion aufrechterhalten wird. Die Persistenz vitaler Organismen in Wirten, die eine schützende Immunantwort entwickelt haben, ist IL-10-abhängig (BELKAID et al. 2001). IL-10-defiziente Mäuse werden zwar Erreger-frei, können aber keine lebenslange Immunität aufrechterhalten.
Ebenso sind CD4+CD25+-T-Zellen für die Kontrolle der schützenden Th1-Antwort sowie das Überleben einzelner Parasiten und Aufrechterhaltung der T-memory-Antwort in resistenten Mäusen notwendig (BELKAID et al. 2002). Trotz intensiver Forschung ist die Ursache für die inadequate Th2-Zell-Differenzierung in den Balb/c-Mäusen noch nicht geklärt. Die entscheidenden Mechanismen wirken sehr schnell nach Beginn der Infektion, eine Beeinflussung des Infektionsverlaufs mit den meisten immunmodulierenden Substanzen ist nur innerhalb der ersten Woche möglich, wobei vermutlich die ersten 2 Tage nach der Infektion am bedeutsamsten sind (CHATELAIN et al. 1992, HEINZEL et al. 1993, LEIBY et al. 1993, SYPEK et al. 1993, LAUNOIS et al. 1997, BIEDERMANN et al. 2001). In den ersten 2 Tagen der Infektion findet eine Infiltration mit Zellen des angeborenen Immunsystems, vor allem Makrophagen und Granulozyten statt, die durch die Synthese immunmodulierender Stoffe einen entscheidenden Beitrag zum Infektionsverlauf leisten.
2.3.4 Erste Mechanismen am Infektionsort
Die obligat intrazellulären Protozoon werden neben residenten Makrophagen in ihrem promastigoten Zustand als erstes von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN)
phagozytiert, da diese die ersten Phagozyten darstellen, die den Infektionsort infiltrieren (LAUFS et al. 2002). Sie werden durch chemotaktische Moleküle, die von den Leishmanien produziert werden, innerhalb von 24 Std. angelockt (SORENSEN et al 1989, VAN ZANDBERGEN 2002). Trotz Phagozytose überleben die Leishmanien in den PMN, deren normalerweise nach 6-12 Std. eintretende Apoptose erst nach 42 Std. verzögert stattfindet.
Zudem bewirkt die Aufnahme der Parasiten eine Ausschüttung chemotaktischer Faktoren wie bspw. MIP-1β. In resistenten Mäusen wandern im Vergleich mit suszeptiblen Mäusen nach ca. 2 Tagen eine größere Anzahl an Makrophagen ein (BEIL et al. 1992, SUNDERKÖTTER et al.1993, TACCHINI-COTTIER et al. 2000) die den transforming growth factor beta (TGF-β) produzieren und die apoptotischen PMN phagozytieren, die nur promastigote nicht replizierende Leishmanien enthalten. Deshalb wurde vermutet, dass Leishmanien PMN als Trojanisches Pferd für das Eindringen in den Makrophagen verwenden (LASKAY et al. 2003, VAN ZANDBERGEN et al. 2004). Die funktionelle Relevanz dieser Beobachtung wurde dadurch demonstriert, dass eine Behandlung von Balb/c-Mäusen zum Zeitpunkt der Infektion mit einem zytotoxischen Antikörper gegen neutrophile Granulozyten zu einer Hemmung der Th2-Zell-Differenzierung und zu einer partiellen Resistenz gegenüber L. major führte (TACCHINI-COTTIER et al. 2000). Die Differenzierung zu replizierenden amastigoten Leishmanien findet unter Ausnutzung des sauren Milieus innerhalb der Phagolysosomen der Makrophagen statt (ZILBERSTEIN u. DWYER 1985, GLASER u. MUKKADA 1992).
Chemokine sind von entscheidender Bedeutung für die Rekrutierung von Leukozyten in entzündliches Gewebe. Für die Leishmaniose konnte bereits gezeigt werden, dass die frühe Einwanderung von Granulozyten und NK-Zellen mit der Expression der Chemokine
„cytokine-induced neutrophil chemoattractant“ (KC) und IP-10 in der infizierten Haut korreliert (MÜLLER et al. 2001). Die differentielle Expression von Chemokinen könnte für den bei den Mausstämmen beobachteten unterschiedlichen Influx oder die unterschiedliche Aktivierung von frühen Effektorzellen (z.B. Granulozyten, NK-Zellen, monozytären Zellen) in das Gewebe verantwortlich sein. Unterschiedliche Zytokin- und Chemokinfreisetzung der infiltrierenden Makrophagenpopulation könnten letztendlich zu einem lokal distinktivem Zytokinmilieu mit Folgen für die T-Zell-Differenzierung führen. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass es in der Haut von C57BL/6- verglichen mit Balb/c-Mäusen 24 Std. nach der Infektion zu einer stärkeren Expression des NK-Zell-aktivierenden IP-10 kommt. Eine
Behandlung von Balb/c-Mäusen mit IP-10 führte zu einer Zunahme der Aktivität der NK-Zellen (VESTER et al. 1999, MÜLLER et al. 2001). Die ersten Tage nach der Infektion sind besonders kritisch, da naive T-Zellen in dieser Zeit zu Effektorzellen differenzieren, und somit der Typ der T-Helfer-Zell-Entwicklung festgelegt wird (SEDER et al. 1994, ABBAS et al. 1996). Ausdifferenzierte T-Zellen sind erst ab dem vierten/fünften Tag nachzuweisen.
2.3.5 Funktion dendritischer Zellen und der T-Zell-Aktivierung
Intensive Studien des Verhaltens von DC in resistenten und suszeptiblen Mäusen konnten keine spezifischen Unterschiede in ihrer Rekrutierung, Antigenprozessierung und-präsentation sowie Migration nach Infektion mit L. major feststellen (VON STEBUT et al. 2000, FILIPPI et al. 2003). In der Antigenpräsentation und der damit verbundenen Migration sind die DC und LC den Makrophagen überlegen (DEMOTZ et al. 1990, HARDING et al. 1990), während der Makrophage die Zelle darstellt, in der die Leishmanien zu proliferieren vermögen und längere Zeit beherbergt werden (BOGDAN u.
ROLLINGHOFF 1998, CUNNINGHAM 2002).
Nur die amastigote Leishmanienform wird auch von DC, insbesondere LC (BLANK et al.
1993) aufgenommen. Aus diesem Grund geschieht die Infektion der DC wahrscheinlich erst später im Verlauf der Infektion, wenn amastigote Leishmanien aus den Makrophagen ins Gewebe ausströmen. Dieser Vorgang könnte eine Erklärung für die verzögerte Zeitdifferenz zwischen Inokulation des Parasiten und zellulärer Immunantwort sein. Die Infektion von DC führt zu deren Aktivierung und Reifung die verbunden ist mit einer Herunterregulation von E- Cadherin, ein Molekül das die Adherenz von LC an Keratinozyten in der Epidermis ermöglicht (TANG et al. 1993, VON STEBUT et al. 1998). Deshalb können aktivierte LC die Epidermis verlassen und in die Lymphknoten auswandern.
Die infektionsbedingte Aktivierung der DC bewirkt eine Hochregulation von MHC-Klasse-I- und -II-Molekülen (FLOHE et al. 1998, JAKOB et al. 1999, VON STEBUT et al. 2000) die konstitutiv auf ihrer Oberfläche exprimiert sind. Auf diesen MHC-Molekülen präsentieren sie im Lymphknoten den T-Zellen Leishmanienantigene, wodurch ruhende T-Zellen aktiviert werden. Die T-Zell-Aktivierung verläuft über mindestens zwei Signalwege. Das erste Signal
ist antigenspezifisch und wird über die Interaktion des MHC/Antigen-Komplexes mit dem TCR übertragen. Das zweite Signal wird auch kostimulatorisches Signal genannt und ist entscheidend für eine vollständige zelluläre Aktivierung. Eines der bekanntesten kostimulatorischen Moleküle ist das Adhäsionsmolekül B7 (CD80/CD86), das mit dem CD28-Rezeptor auf der T-Zell-Oberfläche interagiert (BRETSCHER u. COHN 1970, LENSCHOW et al. 1996, CHAMBERS u. ALLISON 1997). Wird das Antigen auf MHC- Klasse-I-Molekülen präsentiert, wird es von naiven CD8-T-Zellen erkannt, die sich dann in zytotoxische Effektorzellen umwandeln. Diese sorgen für die Abtötung aller Zellen, die solche Antigene über MHC-I präsentieren, sowie für die Sezernierung von Zytokinen, die Makrophagen anlocken und aktivieren. Die Antigenpräsentation in Verbindung mit MHC-Klasse-II-Molekülen bewirkt eine Erkennung von CD4-T-Zellen die dann zu inflammatorischen und T-Helfer-Zellen werden. Es wird davon ausgegangen, dass das Maß an Expression kostimulatorischer Moleküle, sowie die Stärke und Affinität der Interaktion zwischen diesen Molekülen und ihren Korezeptoren auf den T-Zellen, die Antigen-spezifische primäre Aktivierung der T-Zellen beeinflussen (THOMPSON 1995, CONSTANT u.
BOTTOMLY 1997). Die gewichtige Rolle kostimulatorischer Moleküle wie bspw.
CD80/CD86 und CD40 sind für den Verlauf der Infektion mit L. major erwiesen (CORRY et al. 1994, CAMPBELL et al. 1996, KAMANAKA et al. 1996, ELLOSO u. SCOTT 1999).
Auch Zellen am Infektionsort beteiligen sich an der Signalübertragung durch Herrunterregulation von CD86 auf Thy1.2+-epidermalen Keratinozyten resistenter C3H- aber nicht auf den entsprechenden Zellen von Balb/c-Mäusen. Auf NLDC145+-Langerhans-Zellen von Balb/c-Mäusen konnte zudem eine Herrunterregulation von CD80 und CD86 dokumentiert werden. Diese Ergebnisse legten die Vermutung nahe, dass Keratinozyten als sogenannte „bystander“ in der Antigenpräsentation mitwirken (MBOW et al. 2001).
2.3.6 Die Rolle von IL-4 in der T-Zell-Differenzierung
Die sehr frühe Produktion von IL-4 scheint von entscheidender Bedeutung für die Th2-Zell- Differenzierung zu sein. Es konnte gezeigt werden, dass es bereits einen Tag nach der Infektion zur Produktion von IL-4 im lokalen Lymphknoten kommt (LAUNOIS et al. 1995, LAUNOIS et al. 1999). Dabei scheint u. a. eine Population von CD4+-T-Zellen, die über
einen Vβ4α8 TCR, der das L.-major-Antigen „Leishmania Homolog für Rezeptoren der aktivierten C Kinase“ (LACK) erkennt, die Quelle des IL-4 darzustellen (LAUNOIS et al.
1997, LAUNOIS et al. 1999). Transgene Balb/c-Mäuse, denen die Vβ4 Kette des TCR fehlt, zeigen eine Th1-dominierte Immunantwort und können die Infektion kontrollieren (HIMMELRICH et al. 2000). Deshalb wird vermutet, dass LACK-spezifische Vβ4α8CD4+- T-Zellen die IL-4 produzieren eine einzigartige Zelllinie in Balb/c-Mäusen repräsentieren (MALHERBE et al. 2000). Überraschenderweise zeigte sich jedoch eine ähnliche Nutzung des Vβ4α8-TCR in resistenten wie suszeptiblen Mausstämmen (REINER et al. 1993) und LACK-spezifische Zellen produzierten zudem explosionsartig IL-4 in resistenten B10.D2 Mäusen (JULIA u. GLAICHENHAUS 1999) ohne eine Veränderung des Phänotyps zu provozieren.
Studien mit IL-4-Reporter-Mäusen (Mäuse denen zur Identifizierung von IL-4 das green fluorescence protein in den IL-4 Locus eingebaut wurde) zeigten eine ähnliche Frequenz und Kinetik IL-4-produzierender Zellen in resistenten wie suszeptiblen Tieren (STETSON et al.
2002). Dennoch resultierte die Neutralisation von IL-4 in einer Resistenz suszeptibler Mäuse (SADICK et al. 1990, HEINZEL et al. 1991, CHATELAIN et al. 1992), während umgekehrt ein Überschuss an IL-4 in IL-4-transgenen C57BL/6-Mäusen zu einem suszeptiblen Phänotyp führte (LEAL et al. 1993). Diese Ergebnisse führten zu der vorherrschenden Auffassung, dass IL-4 und IL-4-produzierende-Th2-Zellen entscheidende Antagonisten der Th1-induzierten Immunantwort sind (RACKE 1994, REINER et al. 1995, ABBAS et al. 1996, MOSMANN u.
SAD 1996, ROCKEN et al. 1996, KING et al. 2001). Paradoxerweise wurde in Balb/c- Mäusen mit einer Ausschaltung des IL-4-Gens einerseits Suszeptibilität und andererseits relative Resistenz beobachtet. So blieben Balb/c-Mäuse mit einem IL-4-Defekt suszeptibel gegenüber einer Infektion. Sie zeigten keine Anzeichen einer Abheilung der Hautläsionen oder Eleminierung des Parasiten und zeigten auch keinen Th1-Phänotyp (NOBEN-TRAUTH et al. 1996). Andererseits zeigten in einer anderen Untersuchung heterozygote IL-4-knockout- Balb/c-Mäuse im Vergleich zum Wildtyp geringere Läsionen und keine Unterschiede in der Expression inflammatorischer Zytokine wie bspw. IL-1β, IL-1α, TNF-α, IL-12 (KOPF et al.
1996). Eine weitere Studie mit homozygoten IL-4 und IL-4-Rezeptor-knockout-Balb/c- Mäusen demonstrierte eine reduzierte Fußschwellung und Parasitenzahl sowie eine
Th1-assoziierte Antikörperproduktion während der ersten drei Monate nach Infektion. Danach verschlimmerte sich das Krankheitsbild der Rezeptor-knockout-Mäuse und endete letal nach 6 Monaten, während die IL-4-knockout-Mäuse eine vergleichsweise moderate Infektions- symptomatik zeigten, jedoch ohne den Erreger eliminieren zu können (MOHRS et al. 1999).
Ähnliche Beobachtungen konnten durch die Gruppe um BIEDERMANN (2001) gemacht werden. Die Behandlung von Balb/c-Mäusen mit IL-4 in den ersten 8 Std. nach Infektion führte zu einer Th1-Zell-Differenzierung und Resistenz. Dieser Effekt ging mit einer höheren IL-12-Produktion dendritischer Zellen einher. Eine Applikation von IL-4 zu späteren Zeitpunkten resultierte in einer Th2-Zell-Differenzierung und Suszeptibilität. Eine IL-4- vermittelte Induktion von IL-12 durch DC wurde in weiteren Experimenten bestätigt (HOCHREIN et al. 2000, KALINSKI et al.2000, EBNER et al. 2001, STAGER et al. 2003a und b). Des Weiteren zeigte sich eine nur transiente Th2-Antwort in C3H-Mäusen denen IL-4 appliziert wurde. Diese Mäuse waren jedoch nicht dazu fähig, den normalerweise resistenten Phänotyp umzukehren (CHATELAIN et al. 1992). Zusätzlich konnte die Schlüsselrolle von Il-13 als Suszeptibilitäts-Faktor in IL-13-überexprimierenden C57BL/6-Mäusen demonstriert werden (MATTHEWS et al. 2000).
Die Rolle von IL-4 als Hauptfaktor für die Verschlimmerung der Erkrankung ist durch aktuellere Untersuchungen vor allem durch eine relativ häufig bestätigte Expression von IL-4 in resistenten Mausstämmen (MORRIS et al. 1992, REINER et al. 1994, HEINZEL et al.
1995, SCOTT et al. 1996, BELKAID et al. 2000,) infragegestellt worden und die Beteiligung weiterer Mediatoren als einflussreiche Faktoren wird vermutet (SCOTT et al. 1998, SACKS et al 2004). Es besteht die Vermutung, dass die erhöhte IL-4-Sensivität infizierter LC von Balb/c-Mäusen auf eine erhöhte IL-4-Rezeptor-Expression zurückzuführen ist (MOLL et al.
2002). Trotz weiter Akzeptanz des Modells der IL-4-vermittelten Th2-Antwort und IL-12-vermittelten, IFN-γ dominierenden Th1-Antwort, stellt sich heute die Frage ob dieses Konzept nicht eine Simplifizierung der weit mehr komplex ablaufenden Mechanismen darstellt (KELSO 1995, KELSO et al. 1995, SACKS u. NOBEN-TRAUTH 2002). Der kritische Unterschied zwischen resistenten und suszeptiblen Mäusen scheint darin zu liegen, ob sie dazu fähig sind, die frühe IL-4-Expression zu einer Th1-Zell-Differenzierung umleiten zu können. Als gesichert gilt, dass eine schützende Immunantwort durch Ausbildung einer Typ1-Immunität und somit der Differenzierung von CD4+ Lymphozyten zu T-Helfer-Zellen
vom Typ1 entsteht, die entzündlich und cytotoxisch wirkende Mechanismen für die Abtötungder intrazellulären Pathogene vermitteln (SACKS et al. 2002, GUMY et al. 2004, ALEXANDER et al. 2005).
2.3.7 Die Rolle von IL-12 in der T-Zell-Differenzierung
Allgemeiner Konsens ist, dass IL-12, produziert von Antigen-präsentierenden Zellen (APC), darunter DC, in der Expression verstärkt durch Zytokine wie bspw. IL-1α (VON STEBUT et al. 2003), IL-18 (DINARELLO 2002, HOLSCHER 2004), IL-23 (MATTNER et al. 1996, ROBINSON u. O´GARRA 2002, LANGRISH et al. 2004) und IL-27 (ARTIS et al. 2004) die Differenzierung und Proliferation der T-Helfer-Zellen antreibt. Makrophagen hingegen sind in der Frühphase einer Infektion mit Leishmanien nicht dazu in der Lage, IL-12 zu produzieren (CARRERA et al. 1996, GORAK et al. 1998, WEINHEBER et al. 1998). Die zentralen Elemente der Th1-Zell-Differenzierung beinhalten die Stimulation naiver T-Zellen über den TCR und den interferon-γ-receptor (IFN-γR), Aktivierung des Transkriptionsfaktors T-bet über den signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) wodurch die Synthese von Th1-Zytokinen sowie dem IL-12 Rezeptor (IL-12Rβ2) ausgelöst wird (SZABO et al.2003). IL-12 aktiviert wiederum T-Zellen, NK-Zellen und andere zur (STAT4)- abhängigen Synthese hoher IFN-γ Spiegel, die für eine starke Th1-Polarisierung nötig sind (SACKS u. ANDERSON 2004). So ist es nicht überraschend, dass eine Defizienz von T-bet (SZABO et al. 2002), oder CD40-CD40L-Interaktionen (CAMPBELL et al. 1996, KAMANAKA et al. 1996) zu einer defekten IL-12-Produktion und somit zu einem Th2-Typ führt. Eine gleichzeitige Applikation von IL-12 und L. major induziert eine Th1-Antwort in Balb/c-Mäusen (HEINZEL et al. 1993, SYPEK et al. 1993) während IL-12-knockout-Mäuse eines normalerweise resistenten Stammes eine starke Th2-Antwort entwickeln (MATTNER et al. 1996). Die defiziente IL-12-Antwort in Balb/c-Mäusen wird zurückgeführt auf eine Herunterregulation der IL-12Rβ2-Kette (HONDOWICZ et al. 2000), jedoch lieferten Untersuchungen an Balb/c-Mäusen mit einer stabilen Expression des Rezeptors sowie STAT4 Aktivierung, trotzdem einen suszeptiblen Phänotyp (NISHIKOMORI et al. 2001).
In Langerhans-ähnlichen fetal skin-derived DC (FCDDC) von Balb/c- und C57BL/6-Mäusen konnte kein Unterschied in der in vitro-Expression von IL-12 festgestellt werden. Deshalb
wird vermutet, dass andere Faktoren als DC für die differentielle Anfälligkeit dieser Mausstämme verantwortlich sind (VON STEBUT et al. 2000). Die Kinetik der IL-12-Produktion scheint hierbei ein entscheidender Faktor zu sein, da Balb/c-Mäuse ebenso in der Lage sind, IL-12 zu bilden. Hier wurde eine verspätete Produktion beobachtet, so dass die bereits differenzierte Th2-Antwort möglicherweise nicht mehr umgekehrt werden kann (ETGES u. MÜLLER 1998).
2.3.8 Osteopontin (early T-lymphocyte activation 1)
Das ursprünglich als Bestandteil der Knochenmatrix beschriebene Osteopontin (Eta-1/ early T-Lymphocyte activation-1, SPP-1/ secreted phosphoprotein-1) ist in der Lage als frühes Th1- induzierendes Zytokin zu wirken, indem es die Sekretion von IL-12 stimuliert während es gleichzeitig die Sekretion des immunsuppremierenden IL-10 hemmt (ASHKAR et al. 2000, O´REGAN 2000). Mit Hilfe der Northern-Blot-Analyse gelang es, eine Expression des Osteopontins in der Haut von Balb/c- und C57BL/6-Mäusen nachzuweisen. Es zeigte sich bereits 8 Std. nach der Infektion eine drastische (größer als 10-fache) Induktion der Osteopontin-mRNA. Die Osteopontin-Transkriptspiegel erreichten nach ca. 24 Std. ein Maximum und gingen im Verlauf von 48 Std. auf die Werte der nicht infizierten Kontrolle zurück. Es zeigte sich ein signifikanter Stammesunterschied mit einer höheren Osteopontin- Expression (ca. 3-fach höher) in den resistenten C57BL/6-Mäusen. Immunhistochemische Untersuchungen ergaben, dass Osteopontin hauptsächlich von den basalen Keratinozyten gebildet wird. Durch Präparation der Epidermis von infizierter sowie Kontrollhaut und anschließender Northern-Blot-Analyse konnte bestätigt werden, dass L. major in vivo die Expression in Keratinozyten stimuliert. Zusätzlich konnte über Immunpräzipitation nachgewiesen werden, dass es im kutanen Exsudat zu einer stärkeren Zunahme der Osteopontin-Protein-Sekretion in den C57BL/6-Mäusen gegenüber den Balb/c-Mäusen kommt. Diese Ergebnisse waren die ersten, die die differentielle Expression eines Zytokins mit potenziellem Einfluss auf die Th1/Th2-Zell-Differenzierung in der Frühphase der murinen L.-major-Infektion in Keratinozyten zeigten (EHRCHEN et al. 2002).
2.3.9 Bedeutung der Zusammensetzung und der Kinetik lokal produzierter Immunmodulatoren auf die T-Zell-Differenzierung
Während die entscheidende Bedeutung der adäquaten T-Helfer-Zell-Differenzierung im Lymphknoten für den unterschiedlichen Infektionsverlauf in resistenten und suszeptiblen Mäusen gut dokumentiert ist, existieren nur wenige Arbeiten, die sich mit dem Einfluss des Primärortes der Infektion, der Haut, auf diese Differenzierung und dadurch den Verlauf der Erkrankung befassen. Die entscheidende Bedeutung des Infektionsortes auf die Th-Zell-Differenzierung und den Verlauf der Erkrankung wird durch Arbeiten belegt, die zeigten dass eine intravenöse oder intranasale Infektion der normalerweise resistenten C57BL/6-Mäuse zu einem suszeptiblen Phänotyp führte (NABORS et al. 1995). Ebenso ist der Infektionsverlauf in SWR/J-Mäusen abhängig vom Infektionsort. Eine kutane Infektion im Bereich der Schwanzbasis führte zur Erkrankung während die Mäuse nach einer kutanen Infektion der Fußsohle in der Lage waren, den Erreger zu eliminieren (NABORS u.
FARRELL 1994).
Zusammenfassend legen existierende Arbeiten die Vermutung nahe, dass immun- modulierende Substanzen, die von Zellen am Primärort der Infektion produziert werden, einen entscheidenden Einfluss auf die T-Zell-Differenzierung haben können. Dazu gehören nicht nur die bereits vereinzelt beschriebene Aktivität der Makrophagen, DC und NK, (VON STEBUT et al. 1998, VESTER et al. 1999, TACCHINI-COTTIER et al. 2000, MBOW et al.
2001, MÜLLER et al. 2001, MATTE et al. 2002) sondern auch die bisher nicht spezifisch untersuchte Produktion von Zyto-/Chemokinen durch Keratinozyten. Die meisten Arbeiten, die sich mit der Expression von Zytokinen und Chemokinen in der infizierten murinen- oder humanen Haut befassen, wurden zudem zu Zeitpunkten der Infektion durchgeführt, zu denen die Th-Zell-Differenzierung bereits erfolgt ist (CACARES-DITTMAR et al. 1993, MELBY et al. 1994, STENGER et al. 1994, LI et al. 1996, RITTER et al. 1996, MOLL et al. 1997, RITTER u. KÖRNER 2002). Demzufolge ist nicht auszuschließen, dass die lokale Produktion von Zyto- und Chemokinen durch die dann vorhandenen differenzierten Th1/ Th2-Zellen beinflußt wird, oder durch sie selbst bedingt ist. Letzteres ist für die typischen von Th1- und Th2-Zellen produzierten Zytokine (z.B. IFN-γ, IL-4, IL-12) zu vermuten.
Die Expression des Th2-assoziierten Zytokins TGF-β wurde zu einem recht frühen Zeitpunkt (8. Tag) der murinen L.-major-Infektion analysiert. Durch immunhistochemische Färbung konnte nachgewiesen werden, dass in den suszeptiblen Mäusen mehr TGF-β produzierende Zellen im Infiltrat vorhanden sind (STENGER et al. 1994). Dieser Befund korreliert mit der einer erniedrigten Gewebeexpression der induzierbaren Stickoxid-Synthase, welche unter anderem von Makrophagen und Keratinozyten gebildet wird (NATHAN 1992, STUEHR et al. 1992) und der damit verbundenen Hemmung der Produktion reaktiver Stickstoff- Verbindungen (RNIs) durch IFN-γ aktivierte Makrophagen (BOGDAN et al. 2000).
Die kutane Expression von Chemokinen wurde auch im humanen System untersucht.
Bemerkenswert ist, dass sich Unterschiede in der Chemokin Expression zwischen der spontan-heilenden lokalisierten und der progressiven, diffusen Form der kutanen Leishmaniose finden (RITTER et al. 1996). Dabei ist die lokalisierte Form durch eine hohe Expression der Th1-assozierten Chemokine MCP-1, MIG und IP-10 gekennzeichnet, während sich in der diffusen Form eine starke Expression des Th2-assozierten Chemokins MIP-1α findet. MCP-1 ist in der Lage, die Abtötung von intrazellulären Leishmanien in humanen Monozyten zu stimulieren, wobei dieser Effekt durch IFN-γ verstärkt und durch IL-4 gehemmt wird (RITTER u. MOLL 2000). Lokal produzierte Zytokine und Chemokine können weiterhin die Migration von LC in den lokalen Lymphknoten beeinflussen (ARNOLDI u. MOLL 1998).
Eine experimentelle Behandlung von Balb/c-Mäusen zum Zeitpunkt der Infektion mit TNF-α führte zu einer vermehrten Migration der LC innerhalb der ersten beiden Tage nach der Infektion, während IL-1β und MIP-1α einen umgekehrten Effekt hatten. Dieser Befund korrelierte mit den im Lymphknoten nachweisbaren Parasitenzahlen. Von TNF-α ist bekannt, dass es von entscheidender Bedeutung für die Abtötung des Parasiten ist, wobei hauptsächlich die Effektorfunktionen der Makrophagen beeinflusst werden (BOGDAN et al. 1990, GREEN et al. 1990). Transgene Mäuse die kein funktionelles TNF-α exprimieren, sind im Gegensatz zu Wildtyp-Tieren nicht in der Lage, die Infektion zu kontrollieren (WILHELM et al. 2001).
Eine experimentelle Behandlung verschiedener Mausstämme mit TNF-α führte zu einem deutlich abgemilderten Infektionsverlauf (LIEW et al.1990). Das die in vivo-Depletion von
IL1-β und TNF-α entsprechend zu einer Zu- bzw. Abnahme der L.-major-induzierten LC-Migration führte und die Effekte der Proteine auch in Hautexplanatskulturen nachweisbar waren, spricht für einen Effekt von lokal in der Haut produziertem IL1-β und TNF-α. MCP-1 hat keinen Effekt auf die LC-Migration, obwohl gezeigt wurde, dass die Migrationfähigkeit auch von der Ausbildung des von MCP-1 verwendeten CC-Rezeptor 2 (CCR2) abhängig ist (SATO et al. 2000). Allerdings wird dieser Rezeptor auch von MCP-2, -4 und -5 verwendet, die möglicherweise den MCP-1 Verlust kompensieren.
Ob die Fähigkeit der LC zur Migration und Phagozytose der Erreger mit ihrer Fähigkeit die Th-Differenzierung zu beeinflussen korreliert, ist unklar. Das der Zeitpunkt der Zyto-/Chemokin-Expression maßgeblich an der T-Zell-Differenzierung beteiligt ist, wird durch eine IL-1α-Studie mit Balb/c-Mäusen demonstriert. Während die Applikation in den ersten 3 Tagen nach Infektion zu einer Förderung der Th1-Zell-Differenzierung und einem drastisch abgemildertem Infektionsverlauf führt (FILIPPI et al. 2003, VON STEBUT et al.
2003), kommt es nach längerer Applikation von bis zu 3 Wochen zur Th2-Entwicklung und einer Verschlimmerung der Symptomatik. Diese Wirkung scheint IL-1RI-abhängig zu sein, da der Rezeptor nur auf naiven T-Zellen und Th2-Zellen exprimiert wird (KOSTKA et al.
2006). Zudem zeigen IL-1-Rezeptor-defiziente-Mäuse eine verstärkte Th2-Antwort (SATOSKAR et al.1998). Ob die Unterschiede in der kutanen Expression der Zyto- und Chemokine Konsequenz oder Ursache der Th-Differenzierung sind, kann jedoch nicht entschieden werden. Um diese Frage zu beantworten, muß der Zeitpunkt unmittelbar nach Beginn der Infektion untersucht werden, dies ist verständlicherweise nur in der experimentellen murinen Leishmaniose möglich.
2.4 Lasermikrodissektion
Die Lasermikrodissektion ist ein Verfahren, welches es erlaubt, Untersuchungen an gezielt isolierten Zellen aus histologischen Präparaten durchzuführen. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens liegt neben der Isolierung einzelner Zellen oder Zellverbände in der hohen Präzision bei geringer Kontaminationsgefahr. Anfangs fand die laserunterstützte Mikrodissektion lediglich eine Anwendung in der routinemäßigen DNA-Analytik bei Tumorleiden, Infektionen und genetischen Erkrankungen (BECKER et al. 1997). KUMMER
et al. (1998) konnten erstmals zeigen, dass diese Methode, ergänzt durch eine RT-PCR, auch der mRNA Analyse dienen kann. In den folgenden Jahren bekräftigte eine ganze Reihe von Untersuchungen diese Beobachtung (FINK et al. 1998, 2000, 2002). So ist es mit Hilfe der Lasermikrodissektion möglich, eine qualitative Aussage darüber zu tätigen, ob eine mRNA-Expression in dem zu untersuchenden Gewebe existiert oder nicht. Weitergehende Untersuchungen von Fink et al. (1998) zeigten darüber hinaus, dass neben der qualitativen auch die quantitative Untersuchung von mRNA-Expressionen möglich ist. So erlaubt die Kombination aus Lasermikrodissektion und quantitativer Real-Time-PCR, erstmals eine Zelltyp-spezifische relative RNA-Quantifizierung aus komplexem Gewebe. Allerdings ist die laserunterstützte Mikrodissektion auch mit einigen Schwierigkeiten verbunden. Dazu gehört erstens die geringe RNA Menge, die aus mikrodissezierten Zellen gewonnen werden kann.
Sind größere RNA Mengen für nachfolgende Untersuchungen nötig, muss entweder die Zellzahl stark erhöht werden, was wiederum eine Unpraktikabilität mit sich bringt oder es muss ein Amplifikationsschritt zwischen geschaltet werden. Eine lineare Amplifikation, wie sie auch in dieser Arbeit angewandt wurde, ist jedoch nicht immer erfolgreich. Zudem besteht zu jedem Zeitpunkt von der Ernte des Probenmaterials bis zur Gewinnung der RNA die Gefahr, dass die RNA degradiert und somit unbrauchbar wird.
Bis zur Einführung der Lasermikrodissektion waren mRNA-Untersuchungen nur an Gewebehomogenaten oder Gewebefragmenten möglich. Diese hatten zum Nachteil, dass die Gewebegewinnung meist relativ unspezifisch erfolgte, wodurch Mischexpressionen verschiedener Zelltypen unvermeidlich waren. Zudem bestand bei einer solchen Form der Gewebegewinnung eine hohe Gefahr der Kontamination der Proben.
Als Ausgangsgewebe können neben formalinfixierten auch schockgefrorene Präparate verwendet werden (KUMMER et al. 1998, SCHÜTZE und LAHR 1998). Bei sachgerechter Lagerung kann das Gewebe über einen längeren Zeitraum gelagert werden. Ein Verdau mit DNAse (ein Prozess bei dem Desoxyribonukleinsäure-Molekülketten (DNA) in kürzere Molekülketten oder die Einzelbausteine zerlegt werden) kann durch die Verwendung Intron- überspannender Primer umgangen werden. Bisher wurde die Lasermikrodissektion vor allem zur Isolierung relativ großer und damit leicht zu isolierender Zellen angewendet. So lassen
sich z.B. Neurone aus dem Herzen der Ratte oder aber Alveolarmakrophagen aus der Lunge sehr gut einzeln isolieren (FINK et al. 1998, KUMMER et al 1998).
3 ZIELSETZUNG
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Bedeutung residenter Zellen in der Epidermis der Haut für den Verlauf der experimentellen Infektion mit L. major zu untersuchen. Hierbei sollte der Schwerpunkt auf den von Keratinozyten produzierten Zyto- und Chemokinen liegen, da sie einen maßgeblichen Einfluss auf die Rekrutierung von Leukozyten und dendritischen Zellen haben und somit ursächlich an der Entwicklung einer spezifischen T- Helfer-Zell Antwort beteiligt sind.
Das hier geplante Verfahren der Einzelzellselektion durch die laserunterstützte Mikrodissektion sollte zunächst vollständig für dieses Modell etabliert werden.
Die geplanten Studien sollen einen Beitrag zur Aufklärung der Mechanismen leisten, über die Zellen am Primärort in der Frühphase der Leishmaniose die Th-Zell-Differenzierung und somit das spezifische Immunsystem beeinflussen. Die Untersuchung dieser Mechanismen hat grundlegende Relevanz für das Verständnis der adäquaten Immunantwort auf eine lokale Infektion und könnte außerdem zum besseren Verständnis nicht infektiöser entzündlicher Dermatosen beitragen, die mit einem Ungleichgewicht im Th1/2-System einhergehen, wie der Psoriasis oder der atopischen Dermatitis.
Möglicherweise können die hier gewonnenen Erkenntnisse zur Identifikation spezifischer Immunmodulatoren zu Beginn einer Erkrankung beitragen die nicht zuletzt auch von pharmakologischer und therapeutischer Bedeutung sein könnten.
