4.5.1 Kryoschnitte (Gefriergewebeschnitte)
Ein Kryostat (SLEE Technik) diente zur Gewinnung von 5 µm dicken transversalen Hinterfußschnitten für die indirekte Immunfluoreszenz (iIFL). Die Schnitte wurden auf sialinisierte (DAKO, Hamburg) behandelte Objektträger aufgezogen und entweder sofort in Azeton fixiert oder erst am Tag der immunhistologischen Aufarbeitung fixiert. Die Schnitte wurden bei -80 °Cbis zur weiteren Aufarbeitung gelagert.
Für die Lasermikrodissektion musste zunächst die maximal mögliche Schnittdicke bestimmt werden. Dazu wurden in Dicke zunehmende Schnitte vom Hinterfuß und von der Leber bis 30 µm wie oben angefertigt und einerseits auf Objektträger (Superfrost® Plus, Langenbrinck, Emmendingen) und andererseits auf Polyethylennaphtalat (PEN)-beschichtete Objektträger der Firma PALM aufgenommen. Diese wurden entweder direkt gefärbt oder bis zur Verarbeitung bei -80° gelagert.
Für die in situ-Hybridisierung wurden Hinterfüße mit einer Schichtdicke von 8 µm geschnitten, auf Objektträger (Superfrost® Plus) aufgenommen und bis zur Prähybridisierung bei -80 °Cgelagert.
4.5.2 Indirekte Immunfluoreszenz (iIFL)
Die Immunfluoreszenz wird genutzt, um die Lokalisation zellulärer Proteine über fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper die gegen Protein-spezifische Primärantikörper gerichtet sind, sichtbar zu machen. Fluoreszenzfarbstoffe absorbieren Licht einer für den jeweiligen Farbstoff charakteristischen Wellenlänge und emittieren es bei einer anderen, längeren Wellenlänge. Unter dem Fluoreszenzmikroskop wird das Präparat mit Licht im Bereich der jeweiligen absorbierenden Wellenlänge des Fluoreszenzfarbstoffs bestrahlt und dann durch einen Filter betrachtet, welcher nur für Licht der jeweils emittierten Wellenlänge durchlässig ist. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe der iIFL das Chemokin I-TAC in
Gefrierschnitten der Haut des Hinterfußes nachgewiesen. Als Negativkontrolle wurde anstatt des I-TAC Antikörpers Ziegen IgG verwendet. Zuerst wurden die Schnitte bei Rt mit 1
%igem BSA für 30 Min. inkubiert um unspezifische Bindung von IgG zu blockieren. Nach einstündiger Inkubation mit dem Primärantikörper und separat dazu mit dem Ziegen IgG folgte dreimaliges Waschen der Schnittpräparate mit PBS sowie eine 60-minütige Inkubation mit dem spezifischen sekundären, FITC-konjugierten Antikörper. Im Anschluß wurden die Schnitte erneut dreimal mit PBS gewaschen und dann mit einem Mounting Medium (Dako, Hamburg) für Immunfluoreszenz eingebettet. Die Auswertung und Dokumentation erfolgte unmittelbar danach am Fluoreszenzmikroskop (Zeiss) mit Hilfe der Axio Vision Software Version 3.0.6 SP3 (Zeiss).
4.5.3 Färbungen für die Lasermikrodissektion
Die Färbelösungen wurden vor der Verwendung durch einen 0,2 µm Minisart Spritzen Filter (Sartorius, Goettingen) filtriert. Um optimale Konditionen für das Mikroskopieren, den Vorgang der Laser-vermittelten Zellisolation und optimale RNA Qualität zu erhalten, wurden verschiedene Färbeprotokolle getestet.
Im Einzelnen wurden Toluidinblau, Cresylviolet und Hämatoxylin-Eosin (HE) (alle Sigma) als Farbstoffe in wässriger- (DEPC-A. bidest.) und in ethanolhaltiger (70 %iger) Lösung getestet. Die Färbelösungen (Toluidinblau 0,1 %, Cresylviolet 1 %, HE 1 %) wurden 10 Sek.
bis 1 Min. auf den Schnitten belassen, abgegossen und sofort in eiskalten aufsteigenden Alkoholreihen (70 %ig, 80 %ig, 96 %ig) für jeweils 10 Sek. dehydriert oder mit A. bidest gewaschen. Die anschließende Trocknung erfolgte einerseits vor dem Ventilator für bis zu einer Stunde oder im Trockenschrank bei 37 °Cfür 20 Minuten. Ebenso wurde eine „feuchte“
Variante getestet, in der die gefärbten Schnitte bis zum Zeitpunkt der Lasermikrodissektion in 96 %igem Ethanol verblieben.
4.5.4 Laser Microbeam Microdissection (LMM) und Laser Pressure Catapulting (LPC) (LMPC)
Ziel der angewandten Laser Microbeam Microdissection (LMM) und der Laser Pressure Catapulting (LPC) Methode, zusammen auch kurz LMPC oder Lasermikrodissektion genannt,
war es, Keratinozyten aus der Epidermis zu isolieren um die Genexpression von Zyto- und Chemokinen in der Frühphase der experimentellen Leishmaniose durch Real-Time-PCR zu untersuchen.
Die LMPC Technik musste zunächst einmal vollständig für dieses Modell etabliert werden.
Es musste geprüft werden wie viele Zellen nötig sind, um Genexpressionsanalysen mit Hilfe der Real-Time-PCR durchführen zu können. Aus diesem Grund wurde zunächst ein Gewebe gewählt aus dem in kürzester Zeit eine große Anzahl von Zellen isoliert werden konnte.
Hierfür wurden Gefrierschnitte der Leber aus der Maus wie beschrieben angefertigt und nachfolgend Leberzellen selektiert. Die RNA wurde extrahiert und ihre Qualität durch Kapillar Elektrophorese des RNA 6000 Nano Assays in Kombination mit Agilents 2100 Bioanalyzer analysiert. Nachfolgend wurde das Testverfahren auf Gefrierschnitte von Hinterfüßen der Maus angewandt.
Sämtliche Manipulationen am Lasermikrodissektionsgerät wurden durch die PALM Robo Software gesteuert. Der interessierende Bereich wurde im Gewebeschnitt auf der Mikroskopierbühne (Robot Stage) per Mausklick über einen computergesteuerten Hybridstufenmotor lokalisiert. Ein gezieltes Arbeiten im Mikrometerbereich war durch eine Schrittgeschwindigkeit von 1 μm bis zu mehreren Millimetern pro Sekunde möglich. Im Aufhängungsapparat (Robot Manipulator) wurde wenige Millimeter oberhalb des Objektträgers, ein mit Lysispuffer befüllter Deckel eines Reaktionsgefäßes im Fokus des Mikroskops in Position gebracht. Die Einstellung des Laserfokus und der Laserenergie erfolgte über eine externe Steuereinheit. Mit Hilfe verschiedener Objektive unterschiedlicher Vergrößerungsfaktoren (10-fach, 40-fach und 100-fach) konnte der Laserstrahl zu einem Durchmesser von weniger als 1 μm fokussiert werden. Je kleiner der Fokusdurchmesser gewählt wurde, desto höher war die Energiedichte im Fokus. Zum Schneiden wurde mit einem Fokus in Folienebene gearbeitet. Die hohe Energiedichte führte für Bruchteile einer Sekunde zur Entstehung äußerst hoher Temperaturen und ermöglichte die gezielte Zerstörung und damit das Schneiden von Gewebe. Nach Defokussieren des Lasers wurde die herausgelöste Gewebeprobe mit maximaler Laserenergie durch eine Photonen-Wolke in das Reaktionsgefäß katapultiert. Über eine im Gerät installierte Kamera wurde der mikroskopierte Ausschnitt dokumentiert und auf der Bildschirmoberfläche des Computers parallel zu den Arbeiten abgebildet. Eine Darstellung des Systems zeigt die Abb. 5.
Robot Stage
Abb. 5: PALM Robot Microbeam System.
(Modifiziert nach einer Abb. der Firma PALM)
[http://www.palm-microlaser.com/dasat/index.php?cid=100140undconid=0undsid=dasat], 2006 Es wurden verschiedene Möglichkeiten der Gewinnung von epidermalen Zellen getestet. Zum einen wurden Zellverbände von 10–100 Zellen isoliert und zum anderen einzelne Keratinozyten aus der Epidermis geschnitten und anschließend in einen mit Lysis Puffer benetzten Deckel eines Reaktionsgefäßes katapultiert. PEN-beschichtete Objektträger (PALM, Bernried) erleichtern das Katapultieren, indem Gewebe und Folie eine Einheit bilden, die gemeinsam geschnitten und katapultiert wird. Verschiedene LMPC Funktionen wurden angewendet (s. Tab. 29).
Tab. 29: LMPC Funktionen
Schnitte auf PEN beschichteten Objektträgern Beschreibung der Funktion
Schneiden entlang einer vordefinierten Linie; trennt den ausgewählten Bereich vom umliegenden Material. Manuelles setzen eines Katapultpunktes am Rand der Linie
Cut and Catapult
Schneiden und Katapultieren in einem Schritt
RoboLPC
Schnitte auf unbeschichteten Objektträgern Beschreibung der Funktion
AutoLPC Automatisches Katapultieren großer Areale durch Anlegen eines shot grid (shots/µm2).