Aufreinigung von DNA aus einem Agarose-Gel

Für den Erhalt des spezifischen DNA Produktes aus der PCR für die Klonierungsreaktion wurde das sichtbare DNA-Fragment aus dem Agarose-Gel mit dem Genomed JETQUICK Gel Extraction Spin Kit® extrahiert und gereinigt. Dazu wurde ein ausgeschnittenes Stück Agarose-Gel in einem Reaktionsgefäß gewogen. Jeweils auf 100 mg Gel wurden 300 μl Puffer L1 hinzugegeben. Durch 15 Min. Inkubation bei 50 °Cwurde das Gel gelöst. Danach wurde die Lösung auf ein JETQUICK Spin Säulchen gegeben. Die Säule wurde 1 Min. bei 12000 x g zentrifugiert. Die aufgefangene Flüssigkeit wurde verworfen und die Säule mit 500 μl Waschpuffer L2 gewaschen. Der folgende Zentrifugationsschritt wurde zweimal wiederholt, um verbleibenden Waschpuffer sicher zu entfernen. Dann wurde die DNA mit 30 μl Elutionspuffer TE in einem frischem 1,5 ml Reaktionsgefäß aufgefangen und für die Ligation in ein Plasmid verwendet oder bei -20 °Cgelagert.

4.4.9 „Vor“-Amplifikation von lasermikrodisseziertem Material

Die reverse Transkription und Vervielfachung der Ausgangs-mRNA-Menge von Probenmaterial nach Lasermikrodissektion wurde durch die Anwendung des Microarray Target Amplification Kit® (Roche, Mannheim) erzielt. Die mRNA wird bei diesem

Verfahren zuerst in Einzelstrang cDNA (sscDNA) dann in Doppelstrang cDNA (dscDNA) umgeschrieben, und diese anschließend in einer PCR vervielfältigt (s. Abb. 3) (KLUR et al.

2004).

PCR

Real Time Real-Time-PCR

Abb. 3: Ablauf der dscDNA-Synthese und „Vor“-Amplifikation.

(Modifiziert nach dem „product overview“ aus dem Handbuch für das Microarray Target Amplification Kit, ROCHE APPLIED SCIENCE 2004)

Die Anleitung des Herstellers wurde befolgt. In einem ersten Schritt bindet ein Oligo (dT)24

Primer mit T7 Promotor Sequenz und Target Amplification Sequence (TAS) an die RNA (Tab. 18). Der TAS/T7 Oligo (dT)24 Primer bindet an den 3’ Poly A Überhang der mRNA und dient als Startsequenz für die reverse Transkription. Der T7 Promotor dient der Synthese von markierten cRNA „targets“, die in der vorliegenden Arbeit nicht zur Anwendung kamen.

Tab. 18:TAS/T7 Oligo dT Primer-Anlagerung an die mRNA

Dieser Ansatz wurde 10 Min. in einem „thermal Cycler“ inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die Reaktion auf Eis gekühlt und die in Tab. 19 aufgeführten Komponenten dazu gegeben.

Tab. 19: Synthese der Erststrang-cDNA

Reagenzien Volumen

RT Puffer 5 x 4 µl

DTT, 100 mmol/L 2 µl

dNTP Mix, 10 mmol/L pro Nukleotid 2 µl

RT Enzym Mix, 17 U/µl 1,5 µl

Endvolumen/ Reaktion 20 µl

Die Reaktion wurde bei 42 °Cfür 60 Min. inkubiert. Es folgte eine Denaturierung des mRNA/cDNA Hybrids durch Inkubation für 5 Min. bei 95°C. Durch Zugabe des TAS-(dN)10

Primers und Klenow Enzym zur Erststrang Reaktion entsteht der zweite cDNA Strang, welcher dadurch am 3’ und am 5’ Ende von der TAS Sequenz flankiert wird (Tab. 20). Dieser Primer besteht aus zwei Teilen. Der 3’ Bereich beinhaltet 10 Nukleotide welche in einer zufälligen Verteilung an die cDNA hybridisieren. Der 5’-Bereich enthält eine definierte Sequenz welche identisch mit der TAS Sequenz ist.

Tab. 20: Synthese der Zweitstrang-cDNA

Reagenzien Volumen

Endvolumen/ Reaktion 50 µl

Reagenzien Volumen

RNA (50 ng – 1 µg) 8,5 µl

TAS-T7 Oligo (dT)24 Primer, 25 µmol/L 2 µl

Nach einer Inkubationzeit von 30 Min. bei 37 °Cwurde die Zweitstrang cDNA vor der Amplifikation mit dem Microarray Target Purification Kit® (Roche) gereinigt, um Komponenten zu beseitigen, welche eventuell die Amplifikationsreaktion behindern könnten.

Das Protokoll wurde mit Modifikationen befolgt. Im Einzelnen wurden zunächst 1,25 µl

„carrier“ RNA und 50 µl DEPC-A. bidest. zur synthetisierten Zweitstrang cDNA gegeben, und mit 400 µl des im Kit enthaltenen „Binding Buffer“, welchem 1 % β-Mercaptoethanol zugefügt wurde, vermischt. Nach Zugabe von 200 µl 100 %igem Ethanol wurde die gesamte Lösung auf eine High Pure Filter Säule gegeben und das Eluat nach Zentrifugation bei 6000 x g für 15 Sek. verworfen. Nach doppeltem Waschgang mit je 500 µl und 300 µl Waschpuffer wurde die Säule auf ein silikonisiertes Mikrozentrifugen Gefäß gesetzt und mit 50 µl Elutions Puffer die dscDNA (Doppelstrang cDNA) von der Säule gelöst und aufgefangen. Diese wurde in einem letzten Schritt durch den TAS Primer und einem Enzym/Puffer-Gemisch in einer

„random“ PCR amplifiziert (s. Tab. 21). Die optimale Anzahl der Amplifikationszyklen musste zuerst bestimmt werden, um die exponentielle Phase der Reaktion zu erhalten (für ein Beispiel s. Abb. 4). Hierzu fand das in Tab. 22 aufgeführte PCR-Programm Anwendung.

Tab. 21: Mastermix für die erste PCR

Reagenzien Menge

gereinigte dscDNA 12,5 µl

TAS Primer, 50 µmol/L 1 µl

Schritt Aktion Inkubationszeit Temperatur

1. Denaturierung 2 Min. 95°C

2. Denaturierung 30 Sek. 95°C

3. Anlagerung 30 Sek. 55°C

4. Elongation 3 Min. 72°C

5. 39 Zyklen von Schritt 2-4

Während der PCR wurde ab dem 21 Zyklus und nach jedem weiteren dritten Zyklus eine Probe entnommen und diese auf einem 1,2 %igem Agarose /EtBr^- Gel analysiert. In der exponentiellen Phase der PCR Reaktion führt jeder Zyklus zu einer Verdoppelung der

amplifizierten cDNA. Die Größe der cDNA sollte zwischen 700 – 2200 bp liegen. Es wurde eine Zyklen-Zahl am Beginn der exponentiellen Phase (gleichmäßig sichtbare Schlieren auf dem Gel) gewählt. Für das in Abb. 4 gezeigte Beispiel befindet sich die PCR bis zu Zyklus 24 in der exponentiellen Phase. In den Zyklen 27 – 30 ist bereits das Plateau der PCR erreicht und es besteht die Gefahr einer negativen Auswirkung auf die Repräsentation der Transkripte.

Zyklenzahl

Abb. 4: Beispiel für die PCR-Optimierung: 10 µl Aliquots wurden nach Zyklus 18/21/24/27/30 auf einem 1,2%igem Agarose/Etbr Gel analysiert. 50 ng Kontroll-RNA ergaben nach 24 Zyklen gleichmäßig sichtbare Schlieren in der Größe zwischen 700-2200 bp. Somit war nach 24 Zyklen die PCR in der exponentiellen Phase. (Abb.: “Figure 1, First PCR” aus dem Handbuch für das Microarray Target AmplificationKit, ROCHE APPLIED SCIENCE 2004).

Diese durch die erste PCR determinierte Zyklenzahl wurde in einer zweiten PCR angewandt um die Gesamtheit der mRNA zu amplifizieren. Der gleiche Reaktionsansatz wie in Tab. 21 wurde mit dem Programm in Tab. 22 amplifiziert. Nach Abschluss der zweiten PCR wurde die Reaktion mit dem Microarray Target Purification Kit® wie beschrieben gereinigt. Die amplifizierte cDNA wurde mit DEPC-A. bidest. verdünnt und für quantitative PCR Versuche verwendet oder bei -20C gelagert.