Können Keratinozyten das spezifische Immunsystem beeinflussen, indem sie

Im Rahmen der experimentellen Leishmaniose ist unklar, wie es zur Induktion von Zyto- und Chemokinen in der Epidermis kommt. Eine direkte Interaktion der subkutan applizierten Erreger und der Keratinozyten erscheint unwahrscheinlich, ist aber möglich. Eine Phagozytose von Leishmanien durch Keratinozyten wurde bisher nie beschrieben. In der Initialphase der Infektion kann eine Interaktion der Leishmanien mit den gewebsständigen Makrophagen, sowie mit den sehr schnell infiltrierenden Granulozyten erfolgen. Zusätzlich kann in begrenztem Maße eine Phagozytose der promastigoten Leishmanien durch DC

erfolgen. Die Phagozytose durch Makrophagen und DC führt dabei rasch zur Expression von Immunmodulatoren in diesen Zellen (CHAUSSABEL et al. 2003). Diese sezernierten Botenstoffe könnten dann wiederum die Keratinozyten beeinflussen und so zur Produktion von weiteren immunologisch wirksamen Molekülen führen. Physiologisch würde solch eine Interaktion sehr sinnvoll sein, da in der Frühphase der Infektion nur wenige Phagozyten am Ort der Infektion vorhanden sind. Die in großer Anzahl vorhandenen Keratinozyten könnten eine Art zellulären Verstärker darstellen, über den die Immunantwort schnell eingeleitet werden könnte.

Eine Beeinflussung des Immunsystems ist auf vielschichtige Art und Weise möglich. Durch Auswirkungen auf die Migration von DC kann ein indirekter Effekt auf die T-Zell-Differenzierung und somit die spezifische Immunantwort erfolgen. Zusätzlich kann die kostimulatotrische Aktivität sowie die Zytokinproduktion der DC beeinflusst werden. Dies wiederum nimmt Einfluss auf die Interaktion der DC mit den Th-Zellen im lokalen Lymphknoten und so die Th-Differenzierung bzw Polarisierung in Richtung Th1 oder Th2.

Eine weitere indirekte Beeinflussung von DC wäre auch über Makrophagen denkbar, welche durch die von den Keratinozyten produzierten Zytokine stimuliert werden könnten. Da die Induktion der epidermalen mRNA-Expression einiger Immunmodulatoren im Rahmen der Infektion sehr stark ist, kann vermutet werden, dass dies auch zur Sekretion großer Mengen der entsprechenden Proteine führt. Die Immunmodulatoren könnten somit neben lokalen Effekten auch direkt auf die T-Zellen im lokalen Lymphknoten wirken und somit die Th-Zell-Differenzierung direkt beeinflussen (JANEWAY et al. 2002).

Dass Keratinozyten grundsätzlich in der Lage sind, die spezifische Immunantwort zu beeinflussen wurde im letzten Jahr durch ZENZ et al. (2005) an einem murinen Psoriasis-Modell gezeigt. Da in Psoriasishautläsionen beim Menschen die Expression der Proteine JunB und c-Jun herunterreguliert wird, wurde ein transgenes Maus-Modell entwickelt, in dem beide Proteine selektiv nicht mehr epidermal exprimiert werden können. Dies führte zu einer deutlichen Störung des epidermalen Zytokin-Metabolismus und zur Entwicklung von psoriasiformen Hautläsionen. Unter anderem kam es zu einer sehr starken, frühen Zunahme der S100A8- und S100A9-Expression in der Epidermis. Interessanterweise entwickelten die transgenen Mäuse auch arthritische Läsionen. Dieser Effekt war T-Zell-abhängig. Somit

wurde gezeigt, dass eine Veränderung des epidermalen Zytokinmetabolismus zur Generierung autoreaktiver T-Zellen führt und somit einen eindeutigen Effekt auf die spezifische Immunantwort hat (ZENZ et al. 2005).

Die im Rahmen dieser Arbeit anhand der experimentellen Leishmaniose erhaltenen Resultate können auch für das bessere Verständnis der Pathogenese nicht-infektiöser entzündlicher Dermatose bedeutsam sein.

Bei vielen entzündlichen Dermatosen unklarer Pathogenese, wie z.B. der atopischen Dermatitis und der Psoriasis liegen gleichzeitig sowohl Defekte der Th-Zell-Differenzierung als auch ein gestörter Metabolismus der Epidermis vor. Generell wird momentan davon ausgegangen, dass der Defekt der spezifischen Immunantwort dabei das primäre pathogenetische Prinzip ist. Die jüngst von ZENZ et al. (2005) publizierten Daten sowie die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse sprechen aber dafür, dass prinzipiell auch primäre Störungen des Keratinozytenmetabolismus die spezifische Immunantwort beeinflussen können. Dies besitzt große Relevanz für die Entwicklung ursächlicher Therapien. Momentan erfolgt bei der atopischen Dermatitis und der Psoriasis primär eine immunsuppressive Therapie, wobei es nach Absetzen der Therapie meist schnell zu einem Rezidiv kommt. Die Entwicklung von Therapiekonzepten, die ihre Wirkung über die Keratinozyten vermitteln, könnte von entscheidenem Nutzen für eine optimierte Behandlung dieser wichtigen Erkrankungen sein. Zunächst jedoch muss überprüft werden, ob die am Mausmodell erhaltenen Ergebnisse auf andere Species (z.B. Hund, Katze, Mensch) und auf nicht-infektiöse Dermatosen übertragen werden können. Insofern konnten durch diese Arbeit vielfältige Ansätze für weitere Untersuchungen zur Pathogenese entzündlicher Dermatosen liefern. So könnten mit Hilfe der Lasermikrodissektion spezifische Zielzellen (Makrophagen, DC, Granulozyten, Endothelzellen etc.) gezielt isoliert und untersucht werden. Außerdem könnte die Rolle der Keratinozyten unter Berücksichtung kinetischer Gesichtspunkte in weiteren entzündlichen Dermatosen untersucht werden, wie bspw. bei Mäusen, in denen eine Kontaktallergie induziert wird oder bei NC/Nga Mäusen (MATSUDA et al. 1997) oder im Psoriasis-SCID-Maus-Modell (NICKOLOFF et al. 2000). Außerdem bietet sich mit dieser Methodik die Untersuchung der Keratinozyten von Bioptaten aus entzündlich veränderter Haut beim Menschen oder Tier an (usw.).

7 ZUSAMMENFASSUNG

Kirsten Roebrock

Die Rolle des Epithels der Haut in der Frühphase der Leishmania-major-Infektion

Entzündliche Dermatosen wie die Psoriasis und die atopische Dermatitis, die mit einem Ungleichgewicht in der T-Helfer-Zell-Differenzierung, insbesondere mit einer über-schießenden Proliferation von Th2-Lymphozyten, einhergehen, haben bei Mensch und Tier aufgrund zunehmender Inzidenz und unbefriedigenden Therapiemöglichkeiten vermehrt an Bedeutung gewonnen. Die allgemeinen Prinzipien der T-Zell-Differenzierung sind gut untersucht worden, jedoch sind die frühen Vorgänge in der Haut vor der endgültigen T-Zell-Differenzierung im Lymphknoten weitestgehend unbekannt. Es gibt Hinweise darauf, dass Keratinozyten in diesem Zusammenhang eine bislang unterbewertete Rolle spielen.

Gerade das frühe Stadium einer Entzündung ist aber offensichtlich richtungweisend dafür, ob es zur Ausbildung einer Th1- oder Th2-Antwort kommt.

Um einen Beitrag zur Aufklärung der Rolle der Keratinozyten in der Frühphase einer Entzündung zu leisten, wurde mit der experimentellen Leishmaniose ein etabliertes Standardmodell für die Erforschung der T-Zell-Differenzierung verwendet. Die Infektion mit L. major induziert bei den meisten Mausstämmen (z.B. C57BL/6) eine Th1-Antwort, die in Form einer auf die Haut und die lokalen Lymphknoten beschränkten, selbst limitierenden Erkrankung verläuft. Bei einigen Mausstämmen (z.B. Balb/c) führt die Infektion zu einer Th2-Antwort und einer letal endenden Ausbreitung der Parasiten.

Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der selektiven Untersuchung der von residenten Zellen der Epidermis (Keratinozyten) produzierten Immunmodulatoren in Balb/c- und C57BL/6-Mäusen in vivo unter Verwendung der „laser microbeam microdissection und laser pressure catapulting“ Technologie. Die Methode musste dazu vollständig für dieses Modell etabliert werden. Mit Hilfe einer auf PCR basierenden Amplifikation wurde die cDNA von ca. 1000 lasermikrodissezierten Keratinozyten zunächst „vor“-amplifiziert, um anschließend umfassende Genexpressionsanalysen durch quantitative Real-Time-PCR durchführen zu können.

Erstmals konnte so gezeigt werden, dass Keratinozyten sehr schnell nach einer Infektion mit einer aktiven Produktion von Immunmodulatoren reagieren. Bereits innerhalb der ersten 16 Stunden der Infektion wurde eine Vielzahl von Immunmodulatoren von den Keratinozyten produziert (Zytokine, Chemokine, S100-Proteine, Interferon-γ und Tumornekrosefaktor-α, etc.). Einige dieser Gene wurden bereits eine Stunde nach der Infektion „angeschaltet“, und auch bald wieder „abgeschaltet“ (Osteopontin, IL-4, I-TAC). Die Expression der meisten Gene war deutlich stärker in den Keratinozyten von resistenten C57BL/6-Mäusen als in den suszeptiblen Balb/c-Mäusen.

Eine Ausnahme bildete in diesem Zusammenhang das ‚Interferon (gamma) induced T-cell alpha chemoattractant“ (I-TAC), das bereits nach 6 Stunden signifikant stärker in suszeptiblen Balb/c-Mäusen im Vergleich zu den resistenten C57BL/6-Mäusen exprimiert wurde. Die Expression von I-TAC wurde hier zum ersten Mal in der experimentellen Leishmaniose dokumentiert. Aufgrund dieser Beobachtungen bezogen sich nachfolgende Untersuchungen auf die Bestätigung der I-TAC-Expression in der Epidermis durch indirekte Immunfluoreszenz und in situ-Hybridisierung sowie auf die Untersuchung der biologischen Relevanz dieser differentiellen Expression von I-TAC. Diese wurde durch einen negativen Einfluß einer I-TAC-Applikation in den ersten 4 Stunden der Entzündung auf den Verlauf der Infektion bestätigt, die in resistenten C57BL/6-Mäusen noch 6 Wochen nach der Infektion zu einer stärkeren Fußschwellung als in den Kontrolltieren führte, welche sich erst 2 Wochen danach normalisierte. Die Tatsache, dass die Resistenzlage von C57BL/6-Mäusen in diesen Experimenten nicht vollständig umgekehrt wurde, liegt zum einen darin begründet, dass wahrscheinlich eine Vielzahl weiterer Immunmodulatoren den negativen I-TAC-Effekt kompensieren können. Zum anderen sind weitere Dosis- und Zeitkinetiken der I-TAC-Applikation erforderlich, um die optimalen Effekte von I-TAC auf die T-Zell-Differenzierung und Resistenzentwicklung in vivo zu ermitteln.

Die hier gezeigte differentielle Expression von Immunmodulatoren in Keratinozyten zwischen suszeptiblen und resistenten Mäusen ist ein Beleg dafür, dass die Induktion der epidermalen Expression solcher Immunmodulatoren einen Einfluss auf die Generierung der spezifischen Immunantwort und somit auf Resistenz und Suszeptibilität in der experimentellen Leishmaniose hat. Die molekularen Mechanismen, die für die Induktion der

Genexpression in den Keratinozyten während der Frühphase der experimentellen Leishmaniose verantwortlich sind, sind derzeit nicht geklärt. Zum einen können die subkutan injizierten Parasiten einen direkten Einfluss auf die Keratinozyten haben. Zum anderen können Interaktionen der Keratinozyten mit gewebsständigen Makrophagen und früh infiltrierenden Granulozyten der Auslöser für die Synthese immunologisch wirksamer Substanzen in der Epidermis sein. In diesem Fall läge die physiologische Bedeutung in einer Verstärkerwirkung oder Modulation der Frühphase der Entzündung durch Keratinozyten, da die Keratinozyten besonders in dieser Initialphase zahlenmäßig den Phagozyten überlegen sind. Die dann folgenden Mechanismen, mit denen die Keratinozyten die spätere T-Zell-Differenzierung beeinflussen können, sind vielfältig. Dabei sind direkte Effekte auf T-Zellen, eine Beeinflussung der Differenzierung und der Migrationsfähigkeit dendritischer Zellen oder indirekte Effekte vermittelt durch Makrophagen auf die dendritischen Zellen oder T-Lymphozyten denkbar.

Die im Rahmen dieser Arbeit anhand der experimentellen Leishmaniose erhaltenen Resultate können auch für das bessere Verständnis der Pathogenese nicht infektiöser, entzündlicher Dermatosen bedeutsam sein. Bei vielen relevanten Erkrankungen wird eine pathologische Th1/Th2-Zell-Differenzierung als das primäre pathogenetische Prinzip angesehen. Meine Daten deuten darauf hin, dass prinzipiell auch primäre Störungen der Keratinozyten-aktivierung diese Differenzierungswege beeinflussen können. Diese Tatsache besitzt möglicherweise große Relevanz für die Entwicklung neuer, causaler Therapien entzündlicher, nicht-infektiöser Dermatosen. Die mehr oder weniger ungezielte immunsuppressive Therapie stellt zurzeit die einzige Behandlungsmöglichkeit dieser Erkrankungen dar. Die Entwicklung von Therapiekonzepten, die gezielt in diese Differenzierungswege eingreifen, möglicherweise über die Modulation von Keratinozyten, könnte von entscheidenem Nutzen für die optimierte Behandlung weit verbreiteter Erkrankungen wie Psoriasis und atopischer Dermatitis sein.

Insofern ergeben sich durch diese Arbeit vielfältige Ansätze, die Pathogenese entzündlicher Dermatosen weiter aufzuklären.

8 SUMMARY

Kirsten Roebrock

The role of the cutaneous epithelium in the early stage of a Leishmania-major-infection Inflammatory skin disorders such as psoriasis and atopic dermatitis are associated with an imbalance of the T-helper-cell-subsets and in particular, a dominance of Th2-cells. These disorders have gained increasing importance in humans and animals due to rising incidences and insufficient treatment. The overall concept of T-cell differentiation is well-investigated, but early events in the skin before final T-cell priming take place in lymphnodes, are largely unknown. There is evidence that keratinocytes play a thus far, underestimated role in the process of T-cell-differentiation. During the events taking place at early stages of inflammation, crucial factors direct the response the immune system will take such as the development of a Th2 or Th1 response.

To further clarify the role keratinocytes play at the initial stage of inflammation, an established standard model for the investigation of T-cell-differentiation, experimental Leishmaniose, was applied. Infection with L. major induces in the majority of inbred mice (e.g. C57BL/6) a Th1 response, resulting in a disease which is limited to the skin and the local lymphnodes and which heals spontaneously. Some mice strains (e.g. Balb/c) develop a Th2 response after infection, a process that is characterized by lethal propagation of the parasite.

The main focus of this work involved the specific investigation of resident cells in the epidermis (keratinocytes) and the subsequent production of immune modulators in Balb/c and C57BL/6 mice in vivo. The techniques employed in this study involved the use of laser microbeam microdissection and laser pressure catapulting and required full establishment for this model. The cDNA of approximately 1000 keratinocytes was preamplified by means of random based PCR amplification, prior to gene expression analysis by Real-Time-PCR.

Analysis of gene expression showed for the first time, that keratinocytes are involved in the production of immune modulators rapidly after infection. As early as 16 hours after infection, a multitude of immune modulators were expressed (cytokines, chemokines, S100-proteins, interferon-γ, tumor necrosis factor-α, etc.). The expression of some of these genes was

evident after as little as one hour after infection and was soon switched off again (Osteopontin, IL-4, I-TAC). The expression level of the majority of genes was clearly higher in keratinocytes and the skin of resistant C57BL/6 mice than in Balb/c mice.

An exception to this was the expression of interferon inducible T-cell chemoattractant (I-TAC), which showed a significant increase in expression levels within 6 hours of infection in Balb/c compared to C57BL/6 mice. This is the first report of the expression of I-TAC in experimental Leishmaniose. These results were substantiated by the confirmation of I-TAC expression in the epidermis by immunofluorescence and in situ hybridization. The biological relevance of this differential expression was confirmed by a negative influence on the course of infection in C57BL/6 mice after I-TAC administration in the first 4 hours of infection. In these animals, six weeks p.i. a stronger footpad swelling which lasted for two weeks was observed when compared to control animals. An explanation as to why resistant mice don’t become completely susceptible by the application of a single protein that seems to be associated with susceptibility may be, that the strong expression of a variety of other factors in these mice are able to compensate for this negative effect. However, further I-TAC dose response experiments will be necessary in order to determine optimal effects on T-cell-differentiation and development of resistance.

The demonstrated differential expression of immune modulators in keratinocytes of susceptible and resistant Leishmania infected mice, indicates that this induction of the epidermal gene expression has an impact on the generation of the specific immune response and hence on resistance and susceptibility in experimental Leishmaniasis. However, the molecular mechanisms that are involved in the induction of gene expression in keratinocytes at the early stage of experimental Leishmaniasis remain unexplained. It is possible that the subcutaneous administration of these parasites could have a direct influence on keratinocytes.

Alternatively, the interactions between keratinocytes and resident macrophages, as well as the fast infiltrating granulocytes, could be a catalyst for the synthesis of immunologically active substances in the epidermis. In this case, the physiological significance is expressed by an amplifying function and/or modulation of the initial inflammatory phase by keratinocytes, especially since they are far more abundant at the early stage of inflammation than phagocytes.

The consecutive mechanisms, by which keratinocytes are able to influence the later T-cell-differentiation, are manifold. Direct effects on T-cells as well as an influence on the differentiation and migration capacity of dendritic cells or indirect effects mediated by macrophages on dendritic cells or T-lymphocytes, are possible.

The results gained in this work from experimental Leishmaniasis, could also contribute to a better understanding of the pathogenesis of non-infectious inflammatory skin diseases. A pathologic Th1/Th2 differentiation is so far considered to be the major pathogenetical principle in many relevant diseases. The presented data suggests that a primary dysfunction of the activation of keratinocytes could, in principle, have an influence on these pathways of differentiation. This fact has potential relevance for the development of new and causal therapies for inflammatory, non-infectious skin disorders. Immunosuppressive therapy, which has significant downfalls, is currently the only possible treatment. The development of new therapeutics by rational drug design, which target these pathways of differentiation and possibly the modulation of keratinocytes, could be of pivotal benefit for an effective treatment of common diseases such as psoriasis and atopic dermatitis. Therefore, from this work presented in this study, many aspects arise on how to further clarify the pathogenesis of inflammatory skin diseases.

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Im Dokument Die Rolle des Epithels der Haut in der Frühphase der Leishmania-major-Infektion (Seite 147-191)