3 Eigene Untersuchungen
3.1 Material und Methoden
3.1.2 Methoden
3.1.2.1 Virusisolierung in der Zellkultur
Aufgrund der begrenzten Menge von Gehirnmaterial von Fledermäusen war in den meisten Fällen eine Virusanzucht in der Zellkultur erforderlich. Für die Virusisolierung und -anzucht diente der Rapid Tissue Culture Infection Test (RTCIT) unter Mitführung von Positiv- und Negativkontrollen (WEBSTER und CASEY, 1996). Aus dem Gehirn IFT-positiver Fledermäuse wurde eine 20%ige Suspension unter Verwendung von Minimum Essential Medium (MEM) hergestellt, bei 4 °C für 30 min inkubiert, anschließend bei 600 x g für 10 min zentrifugiert und der Überstand separiert. Murine Neuroblastomazellen (Na42/13) wurden in einer Konzentration von 2x106 Zellen/ml in Dextran-Gebrauchslösung aufgenommen. Jeweils 0,5 ml Zellsuspension wurden mit 0,5 ml des Überstandes der 20%igen Gehirnsuspension gemischt und bei 37 °C und 3-5 % CO2 für30 min im Brutschrank inkubiert und dabei 2-3 Mal durchmischt. Nach Zentrifugation bei 600 x g für 10 min wurde das Zellpellet in 10 ml Dulbeccos’s Minimum Essential Medium (DMEM, Biochrom, Berlin) resuspendiert und anschließend 8ml in eine Gewebekulturflasche (T25) und 2 ml in 6- bzw.
24-Loch-Platten oder Petrischalen (35/10mm) ausgesät. Nach Inkubation der Virus-Zellsuspension bei 37 °C und 3-5 % CO2-Gehalt für weitere 3-4 Tage erfolgte die Kontrolle des Viruswachstums in den zeitgleich infizierten Petrischalen. Nach Absaugen des Zellkulturmediums und 1x Spülung mit TW-Puffer wurden die Zellen mit 80%igem Aceton für 30 min bei 4 oC fixiert und anschließend luftgetrocknet. Die Anfärbung von infizierten Zellen erfolgte mit einem kommerziell erhältlichen, polyklonalen FITC-markiertem Anti-Tollwut-Konjugat (SIFIN, Berlin) für 30 Minuten bei 37 °C in einer feuchten Kammer.
Abschließend wurden die Petrischalen zweimal mit TW-Puffer und Aqua Bidest gespült.
Die Auswertung erfolgte unter einem inversen Fluoreszensmikroskop bei ca. 300-facher Vergrößerung unter Betrachtung des gesamten markierten Bereiches. Der Nachweis tollwutspezifischer Fluoreszenzen in den Zellen galt als Indiz für eine erfolgreiche Virusanzucht. Je nach EBLV-Isolat mussten die infizierten Zellkulturen solange passagiert werden, bis mindestens 60 % der Zellen infiziert waren. Dazu wurde das Zellkulturmedium verworfen, der Zellrasen mit 2 ml Trypsin überschichtet, für 1 min inkubiert und nachfolgend
wurde das Trypsin wieder abgeaugt. Die Zellen, die sich gelöst hatten, wurden in Wachstumsmedium aufgenommen und in einem Verhältnis von 1:2 bis 1:3 erneut in Gewebekulturflaschen bzw. Petrischalen ausgesät. Anschliessend wurde der Zellkulturüberstand abgenommen, portioniert und bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
3.1.2.2 Auswahl der Virusisolate
Zunächst wurde anhand der nationalen Tollwutdatenbank (MÜLLER et al., 1994) sowie des Tierseuchennachrichtensystems (TSN) ein Abgleich der bestätigten Fledermaustollwutfälle in Deutschland im Zeitraum 1954 – 2007 mit den im Virusarchiv vorhandenen EBLV-Isolaten vorgenommen. Nach Auswertung der Daten wurden die für das Veterinärwesen zuständigen Untersuchungsämter der Länder gebeten, weitere bzw. fehlende EBLV-Isolate aus den Bundesländern zur Verfügung zu stellen, um eine möglichst flächendeckende geographische Analyse zu ermöglichen. Für alle verfügbaren EBLV-Isolate wurden Angaben zur geographischen Herkunft (Fundort), zum Funddatum oder dem Jahr der Isolierung und der Spezies aus den Laborbüchern erhoben und gegebenenfalls mit den in den Datenbanken vorhandenen Angaben abgeglichen.
Der Fundort der Tollwutfälle war für den Zeitraum 1954 – 1994 als Gemeinde (territorialer Grundschlüssel) und für den Zeitraum 1994 – 2007 über die Funktionen innerhalb der Tierseuchenmeldung für das TSN als genaue georeferenzierte Angabe oder Gemeinde verfügbar. Mit Hilfe der GIS Software Kartenexplorer (FLI, Wusterhausen, Deutschland), die am Institut für Epidemiologie des Friedrich-Loeffler-Institutes entwickelt wurde, erfolgte zunächst eine kartographische Darstellung der Tollwutfälle und aller vorhandenen EBLV-Isolate aus dem NRL Archiv. Für Fledermaustollwutfälle und EBLV-EBLV-Isolate, für die nur die Gemeinde als Fundort bekannt war, wurde jeweils ein beliebiger Punkt innerhalb der Gemeinde für die kartographische Darstellung und weitere geographische Analysen festgelegt.
Die Auswahl von EBLV-Isolaten für die anschließende Sequenz- und phylogentische Analyse erfolgte unter folgenden Prämissen: die Stichprobe repräsentiert - a) die geographische Herkunft aller verfügbaren EBLV-Isolate sowie - b) die räumliche und zeitliche
Tollwutsituation bei Fledermäusen im Zeitraum 1954-2007 in Deutschland. Dazu wurde mit Hilfe des Kartenexplorers ein 30 km x 30 km großes Raster über die Fläche Deutschlands gelegt und die Anzahl von Rasterzellen ermittelt, denen EBLV-Isolate zugeordnet werden konnten. Aus jeder so ermittelten Rasterzelle wurde mindestens ein EBLV-Isolat ausgewählt.
In Rasterzellen, die mehr als ein EBLV-Isolat enthielten, fand eine Auswahl nach dem Zufallsprinzip (random sampling) statt. Danach erfolgte eine weitere selektive Auswahl, um die zeitliche Komponente (Zeitraum 1954 - 2007) zu berücksichtigen.
3.1.2.3 Isolation von Virus RNA
Zur Extraktion von Virus-RNA wurde der kommerziell erhältliche RNA-Extraktionskit RNeasy© (Qiagen, Hilden, Deutschland) entsprechend den Instruktionen des Herstellers verwendet. Silikat-Gel-Membranen in Säulen bilden dabei eine RNA-bindende Matrix. Je nach Verfügbarkeit wurden entweder 200 µl Zellkulturüberstand oder 30 mg Gehirnsuspension mit 350 µl Lösungspuffer RLT versetzt und gemischt. Nach Fällung der RNA durch Zugabe von 1 Volumen 70%igen Ethanols wurde das Reaktionsgemisch auf eine Säule aufgetragen und für 15 s bei 6608 x g zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Die Säule wurde mit 700 µl Puffer RW1 überschichtet und erneut für 15 s bei 6608 x g zentrifugiert. Anschließend erfolgten zwei Waschschritte mit je 500 µl Ethanolwaschpuffer RPE, wobei nach der ersten Zentrifugation (15 s) und dem Verwerfen des Eluates im zweiten Waschschritt die Säule für 2 min zentrifugiert wurde. Die Säule wurde nachfolgend in einem neuen sterilen und wieder verschließbaren 1,5 ml Auffangbehältnis platziert. Nach Zugabe von 30 µl RNase freiem H2O auf jede Säule erfolgte ein letzter Zentrifugationsschritt bei 6608 x g für 1 min. Die im Eluat gewonnene RNA wurde bei -80 °C gelagert oder bei sofortiger Weiterverwendung in einen Kühlblock gestellt.
3.1.2.4 Diagnostische RT-PCR
Zur Bestätigung von IFT-positiven Proben sowie zur Differenzierung zwischen EBLV-1 und EBLV-2 wurde eine diskriminatorische RT-PCR eingesetzt, die ein Fragment des
Nucleoprotein-Phosphoproteingens amplifiziert (VOS et al., 2004a). Dieses Fragment ist bei der EBLV-1 und EBLV-2 spezifischen RT-PCR 370 nt bzw. 270 nt groß. Die Primer und deren Positionen im Virusgenom sind in Tabelle 3-1 angegeben.
Tabelle 3-1: Darstellung der Primer für die diagnostische RT-PCR für EBLV-1 und EBLV-2 (mod. nach VOS et al., 2004)
Name Sequenz Länge Position bei
EF157976 Fragmentgröße EBLV-1-fwd 5’-AAG AGC TAC AGG ATT ACG AGG-3’ 21 nt 1161–1181
370 nt EBLV-1-rev 5’-GAC AAA GAT CTT GCT CAT GA-3’ 20 nt 1534–1515
EBLV-2-fwd 5’-TCA TGG TCA ATG GGG GAA AG-3’ 20 nt 1226–1245
270 nt EBLV-2-rev 5’-TTG GGA TGG AGC AGG AAG AG-3’ 20 nt 1455–1436
3.1.2.4.1 RT-PCR
Für die RT-PCR kam ein kommerziell erhältliches Kit zum Einsatz (SuperScript™.III Platinum®One-Step Quantitative RT-PCR System, Invitrogen, Carlsbad, USA), bei dem beide Reaktionsschritte hintereinander in einem Ansatz ablaufen. Die Negativstrang-EBLV-RNA wurde zunächst in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben: Random Primer (Hexamere) banden bei ca. 45°C – 60 °C an die RNA und davon ausgehend wurde durch das Enzym M-MLV (Murine Moloney Leukaemia Virus) Reverse Transkriptase die RNA in cDNA umgeschrieben (KOTEWICZ et al., 1985). Bei der anschliessenden PCR fungieren die beiden, den zu amplifizierenden Genabschnitt einschließenden Primer als Startsequenz für die Taq-Polymerase. Die Amplifikation des Genbereichs erfolgt durch die zyklisch ablaufenden Prozesse Denaturierung, Anlagerung und Kettenverlängerung (MULLIS et al., 1986).
Temperaturen von ca. 90 - 95°C führen bei der Denaturierung zur Trennung der beiden DNA-Stränge. Durch eine Reduktion der Temperatur auf 45°C – 55 °C können sich die spezifischen Oligonukleotide and den Matrizenstrang anlagern. Dieser Schritt wird als Annealing bezeichnet. Anschließend wird, ausgehend von den Primern, der Strang durch die DNA-abhängige DNA-Polymerase in Anwesenheit freier Desoxyribonukleotide (dNTP) bei 72 °C verlängert (Elongation). Diese als Zyklus bezeichnete Reaktionsabfolge wird 25 bis 40 Mal wiederholt.
Tabelle 3-2: Mastermix Reaktionsansatz je Probe für die RT-PCR
Reaktionssubstrate Volumen
Rnase freies Bidest 16µl
2x Reaction Mix 25µl
Vorwärts Primer (10 µM) 1µl Rückwärts Primer (10µM) 1µl SuperScript III RT/ Platinum Taq Mix 2µl
EBLV RNA 5µl
Gesamtvolumen 50 µl
Zunächst wurde in einem speziellen, nur dafür vorgesehenen Raum ein Master-Mix für die RT-PCR hergestellt. Neben dem RT-PCR Kit wurden die entsprechenden Primer und RNAse freies Aqua bidest. hinzugegeben, um je Gefäß 45 µl Reaktionsgemisch bereitzustellen. Die EBLV-RNA wurde in einem anderen Raum unter Verwendung einer Sicherheitskabine dem Reaktionsgemisch hinzugefügt. Die einzelnen Reaktionsgefäße wurden sofort danach in einen Thermocycler (Bio-Rad, München) gegeben.
Die PCR zur Detektion von EBLV-Genmaterial besitzt folgende Spezifikation: Der RT-Schritt erfolgte bei 50 °C und einer Inkubationszeit von 30 min, gefolgt von einer initialen Denaturierung der cDNA bei 95 °C für 15 min. Die Amplifikation umfasste 35 Zyklen von 94°C für 30 s, 54 °C für 30 s und 72 °C für 60 s. Für die abschließende Elongation wurde das Reaktionsgemisch bei 72°C für 5 min inkubiert. Sämtliche Reaktionsmaterialen wurden in Kühlblöcken gelagert, um vorzeitige unspezifische Reaktionen zu verhindern. Um Kontaminationen zu vermeiden, wurden Vorsichtsmassnahmen eingehalten (KWOK und HIGUCHI, 1989). Bei allen Reaktionsansätzen wurden positive und negative Kontrollen mitgeführt.
3.1.2.4.2 Agarose-Gelelektrophorese
Bei der Amplifikation von Virus-RNA im Verlauf einer PCR entsteht eine große Anzahl von DNA-Fragmenten gleicher und spezifischer Größe, die durch die Position der Primer
bestimmt wird. Der Nachweis dieser Fragmente wurde durch Gelelektrophorese erbracht.
Dazu wurde zunächst 1g Agarose (Gibco BRL Life Technologies, Paisley, Vereinigtes Königreich) in 100 ml 1xTBE-Puffer aufgekocht, mit 1 μl Etidiumbromid pro 10 ml gemischt und in eine Gelkammer gegossen. Diese wurde nach dem Erstarren in eine mit 0,5xTBE-Puffer gefüllte Elektrophoresekammer überführt. Anschließend wurden 5 µl PCR-Produkt mit 1 µl Auftragepuffer (6x Bromphenolblau) gemischt und in die Kammern des Gels übertragen.
Zusätzlich wurden je nach erwarteter Fragmentgröße ein DNA Größenmarker (100 bp-Marker oder 1 kb-Marker) mitgeführt. Die elektrophoretische Auftrennung der Fragmente erfolgte bei einer Spannung von 120 mV für 1h. Als Indikator diente das Migrationsverhalten des Probenauftragepuffers. Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden mittels eines UV-Transilluminators sichtbar gemacht, wobei sich das im Gel befindliche Ethidiumbromid als interkalierender Farbstoff in die DNA einlagerte, durch UV Licht (518 nm) angeregt wurde und Licht der Wellenlänge 650 nm emitierte. Alle PCR-Ergebnisse wurden mithilfe eines digitalen Bildbearbeitungssystems gespeichert.
3.1.2.5 Sequenzierung von EBLV-1
3.1.2.5.1 Design von Primern für die long-PCR
Basierend auf den vorhandenen Sequenzen eines EBLV-1-Isolates aus Hamburg aus dem Jahr 1968 (Genbank: EF 157976, MARSTON et al., 2007) wurden Oligonukleotide (Primer) für die anschliessend zu sequenzierenden Genabschnitte ausgewählt. Unter Verwendung des Programms PrimerSelect© aus dem Lasergene-Software-Paket (Lasergene 7.0, DNASTAR Inc., Madison, USA) wurden Primer für den Bereich Nucleoprotein-Phosphoprotein und den Glykoprotein-Polymerase-Gen (GL-nicht translatierter Bereich) generiert. Die Synthese der Primer erfolgte durch die Firma MWG Biotech, Ebersbach. Das Primerpaar fwd und NP-rev umspannte einen Genabschnitt von 1600 nt, während die Primer GL-fwd und GL-NP-rev ein 775 nt-großes Fragment einschließen (Tabelle 3-3).
Tabelle 3-3: Verwendete Primer für die long-PCR
Name PCR-Primer Sequenz Länge Tm Position* Fragmentgröße NP-fwd 5'-GTAACACCCCTACAATGG-3' 18 nt 53.7°C 57-74
1574 NP-rev 5'-GGTGGGCTTGACTATCCT-3' 18 nt 56.0°C 1631-1614
GL-fwd 5'-CATGTTGCAAAAGGTTC-3' 17 nt 47.9°C 4749-4765 GL-rev 5'-AATTGCTTCTCAGGTCT-3' 17 nt 47.9°C 5524-5508 775
*bezogen auf Referenzisolat EF157976
Die RT-PCR zur Amplifikation der long-Fragmente erfolgte im Wesentlichen wie in Kapitel RT-PCR (3.1.2.4.1) beschrieben. Die veränderten Temperaturprofile sind in Tabelle 3-4 dargestellt.
Tabelle 3-4: RT-PCR Temperaturprofil für die NP-Fragmente und GL-Fragmente. Die veränderte Extensionszeit für den GL-Bereich ist durch * gekennzeichnet
Reaktionsschritt Temperatur Zeit Zyklen
Reverse Transkription 50°C 30 min 1x
Denaturierung 94°C 2 min 1x
PCR Denaturierung 94°C 15s
}40x Anlagerung 54°C 30s
Extension 68°C 1,5 (1*) min End-Extension 68°C 5 min 1x
3.1.2.5.2 Sequenzierung der PCR-Produkte
Die Sequenzierung der Genabschnitte erfolgte nach der Kettenabbruchmethode (SANGER et al., 1977) mit floureszenz-markierten IRD800-Primern. Entsprechende Sequenzierprimer wurden mit dem Programm PrimerSelect© ausgewählt. Die Primer wurden so ausgewählt, dass jeder Abschnitt des Genombereiches mindestens von je einer vorwärts und einer reversen Sequenz überlesen wurde.
Tabelle 3-5: Verwendete IRD800 markierte Sequenzierprimer
Primer Sequenz Position*
vorwärts 5'-GTAACACCCCTACAATGG-3' 57-74 5'-CCATAATCAGCTGGTCTCGGT-3' 100-120 5'-GGGACCCTACGACACCTGAACA-3' 459-480 5'-GGGTTCATCAAGCAAATC-3' 800-817 5'-AGCAGAAAGCACTAAGGTTGATGT-3' 1183-1206
rückwärts 5'-GGTGGGCTTGACTATCCT-3' 1631-1614 5'-TTTAATCTCCCTCCGTTCATCATA-3' 1320-1297 5'-AGACACCAACCCCGAACA-3' 793-776 5'-TGAGCCTATAAAGACAGAGA-3' 521-502
*bezogen auf Referenzisolat EF157976
Die Menge der PCR-Fragmente wurde entsprechend der Dicke der Banden im Elektrophorese-Gel geschätzt, um sie anschließend im Verhältnis 1:10 bis 1:100 mit Aqua dest. zu verdünnen. Im Regelfall wurden bei einer Verdünnung von 1:50 gute Ergebnisse erzielt. Von dieser Verdünnung wurden 15 µl des DNA-Aliquots mit 5 µl IRD800 -Sequenzierprimer (3 pmol/µl) (Tabelle 3-5) zu einem DNA/Primer-Premix gemischt.
Anschließend wurden je 4 µl dieses Gemisches jeweils zu 1 μl A-, C-, G- bzw.T-Reagenz eines kommerziell erhältlichen Sequenzierkits (DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit, GE Healthcare, NY, USA) hinzugegeben, abzentrifugiert (1000 UpM, 15 s), mit Chill-out Liquid Wax (MJ Research, Cambridge, USA) überschichtet und in einen vorgeheizten Thermocycler verbracht. Die Konditionen für die Sequenzierreaktionen sind in Tabelle 3-6 beschrieben.
Tabelle 3-6: Temperaturprofil für die Sequenzierreaktionen
Reaktionsschritt Temperatur Dauer
Anzahl der Zyklen
Denaturierung 95°C 5 min 1x
Denaturierung 95°C 15 s
}30
Anlagerung 50°C 30 s
Extension 68°C 1 min
End- Extension 68°C 5 min 1x
Nach der Sequenzierung erfolgte ein Abbruch der Reaktion durch Zugabe von 4 µl Formamid-Puffer (im Kit enthalten) und anschließende Denaturierung (70 °C, 1 min). Die elekrophoretische Auftrennung der Proben und die Ermittlung der Sequenz erfolgten in einem automatischen Sequenziergerät „LI-COR DNA Sequencer ReadIR 4200“ (MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland).
Zunächst wurde dazu eine Gelmatrix gegossen. Zwei Glasplatten wurden mit 70%igem Ethanol gründlich gereinigt, mithilfe eines Abstandhalters (0,25 mm) mit Schraubschienen zusammengesetzt und gleichmäßig zusammengedrückt. Anschließend wurden 25 ml Sequagel XR© mit 6,25 ml Sequagel Puffer, 0,33 ml DMSO und 0,25 ml 10 % APS gemischt und das Gel unter Verwendung einer 10 ml-Pipette luftblasenfrei gegossen. Der Einsatz eines Vorformer-Kamms ermöglichte eine glatte Gelkante für den späteren Einsatz des Zahnkamms. Nach der Polymerisation des Gels wurde es in die Gerätekammer des Sequenzierautomaten gehängt, die Pufferbehälter mit 0,5xTBE-Puffer gefüllt und nach vorheriger Reinigung des Haifischzahn-Kammes in das Gel eingebracht. In jede Kammer wurden ca. 1,5 µl Probe gefüllt. Die elektrophoretische Auftrennung der Proben erfolgte unter folgenden Konditionen: Spannung 1500 V, Stromstärke 37,5 A, Leistung 50,0 W, Temperatur 50 °C, Rahmen 25. Die Basenabfolge wurde mithilfe des zum Sequenziergerät LICOR gehörenden Softwarepakets BaseImageIR™ Version 02.31 mit den Komponenten Data Collection und Image Analysis ermittelt.
3.1.2.6 Speziesbestimmung von Fledermäusen
Ein Genabschnitt des Cytochrom B wurde nach dem von HARRIS (2008) beschriebenen Verfahren amplifiziert und anschließend sequenziert.
3.1.2.6.1 DNA-Extraktion
Die Extraktion von genomischer DNA erfolgte unter Verwendung des kommerziellen DNA Extraktionskits NucleoSpin Tissue™ (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland). Von der Fledermaus wurden 35 μg Organprobe (Niere) entnommen. Diese wurde homogenisiert, mit 180 μl Lösungspuffer T1 und 25 μl Proteinase K überschichtet, durchmischt und über Nacht bei 56 °C inkubiert. Anschließend wurden dem Lysat 200 μl Puffer B3 hinzugefügt, gevortext und bei 70 °C für 10 min inkubiert. Nach Zugabe von 210 μl Ethanol (96-100%ig) und nachfolgender Durchmischung (Vortex, wurde das Reaktionsgemisch auf eine Säule aufgetragen, für 1 min bei 11.000 UpM zentrifugiert und der Durchfluss verworfen.
Anschließend erfolgten zwei Waschschritte der Membran mit zunächst 500 µl Waschpuffer BE und anschliessend 500 µl B5. Die Säule wurde jeweils für 1 min bei 11.000 UpM zentrifugiert und das Eluat wurde verworfen. Die Trocknung der Säule erfolgte durch Zentrifugation für 1 min bei 11.000 UpM. Die Säule wurde nachfolgend in einem neuen sterilen wiederverschließbaren 1,5 ml Auffangbehältnis platziert. Nach Zugabe von 100 μl vorgewärmtem (70 °C) Elutionpuffer BE auf die Säule erfolgte ein letzter Zentrifugationsschritt bei 10.000 UpM für 1 min. Die im Eluat gewonnene DNA wurde bei -80 °C gelagert oder bei sofortiger Weiterverwendung in einen Kühlblock gestellt.
3.1.2.6.2 Cytochrom B-PCR
Die PCR zur Amplifikation eines 900 nt großen Fragments des Cytochrom B-Gens erfolgte unter Verwendung eines kommerziellen PCR Kits (Platinum® Taq DNA Polymerase, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland). Ein PCR-Mastermix mit folgenden Bestandteilen je Reaktion wurde vorbereitet: 5 µl PCR Puffer (10x), 1 µl dNTPs (10 mM), 1.5 μl MgCl2 (50 mM), 1 µl Vorwärts-Primer Mix (Barb F1/BWF/WF) (0.2 µM), 1 µl of Rückwärts-Primer (Barb R2/BWR/WR) (0.2 µM), and 2 µl of TaqPolymerase (0.5 U/ml) (HARRIS et al., 2008).
Tabelle 3-7 : Zur Amplifikation verwendete Primer und ihre Position im CytB-Gen. Die Primer BWF und BWR amplifizieren cytB von M. brandtii und M. mystacinus, die Primer WF und WR nur M. mystacinus (nach HARRIS et al., 2008)
Name Sequenz Position
BarbF1 5’ - CCT CAA ATA TTT CAT CAT GAT G – 3’ 71-92 BarbR2 5’ - GTC CTC CAA TTC ATG TTA GG – 3’ 1022-1002 BWF 5’ - GAC CAA CAT TCG AAA ATC – 3’ 3-20 BWR 5’ - GTG ATG CTG CGT TGT TTG – 3’ 930-947 WF 5’ – CCT GCC CCA TCA AAT ATC TC – 3’ 64-83 WR 5’ – GGA ATT GAT CGT AGG ATT GCG – 3’ 834-854
Das Reaktionsgemisch wurde mit Aqua bidest auf 45 µl je Reaktion aufgefüllt, auf Reaktionsgefäße verteilt und 5 µl Fledermaus-DNA beziehungsweise eine Negativkontrolle (H2O) hinzugefügt. Die Bedingungen für den Thermocycler sind Tabelle 3-8 beschrieben. Die Visualisierung der PCR-Fragmente erfolgte mittels Gel-Elektrophorese analog zu der in Kapitel 3.1.2.4.2 beschriebenen Verfahrensweise.
Tabelle 3-8: Temperaturprofil für die cytB-PCR (nach HARRIS et al., 2008)
Reaktionsschritt Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen
Denaturierung 95°C 15min 1x
Denaturierung 95°C 50 s
}37x
Anlagerung 50°C 50 s
Extension 72°C 1 min
End- Extension 72°C 10 min 1x
3.1.2.6.3 Sequenzierung
Das durch die cytB-PCR gewonnene Amplifikat wurde anschließend nach der im Kapitel 3.1.2.5 geschilderten Vorgehensweise sequenziert. Hierzu wurden IRD800-markierte Primer
basierend auf BarbF1 und BarbR2 eingesetzt. Die Bedingungen der Sequenzier-PCR sind in Tabelle 3-6 angegeben.
3.1.2.6.4 Vergleich mit Sequenzen aus GenBank
Die erhaltene Gensequenz wurde im FASTA-Format gespeichert und mit in der Genbank veröffentlichten cytB-Gensequenzen anderer Fledermausspezies verglichen.
3.1.2.7 Analyse der Sequenzdaten der EBLV-1-Isolate
3.1.2.7.1 Aufbereitung der Rohdaten
Die Nukleotidsequenzen lagen nach dem ersten Kontrollschritt im Datenformat Sequence Chromatogram File (SCF) vor. Hierbei handelt es sich um ein Speicherformat für Sequenzdaten, das neben der eigentlichen Basenabfolge auch das Chromatogramm der Fluoreszensmessung beinhaltet. Alle SCF Dateien eines Isolates wurden nach einem Alignment im Programms SeqMan® verglichen. Nicht eindeutige Nukleotidpositionen wurden im Chromatogramm und direkt am Sequenziergerät kontrolliert. Eine erneute Sequenzierreaktion wurde durchgeführt, wenn keine eindeutige Abklärung der Fehler erfolgen konnte. Die Konsensussequenz der zu einem Isolat gehörenden Einzelsequenzen wurde als Datei im Lasergene-Format seqfile abgespeichert.
3.1.2.7.2 Alignment der Sequenzen
Die Trimmung der SEQ-Dateien erfolgte unter Verwendung des Programms. Basierend auf bereits veröffentlichten Sequenzen wurden alle Sequenzen auf die entsprechende Länge der Gensegmente gekürzt:
Nukleoprotein (kodierend): 1353 nt
Nukleoprotein-Phosphoprotein intergenetischer Bereich 90 nt Glykoprotein L-Protein – intergenetischer Bereich 560 nt
Anschließend wurden die Einzelsequenzen der Isolate in Dateien im FASTA-Format exportiert, um sie für weitere Anwendungen nutzbar zu machen. Das Alignment erfolgte mit dem Programm MEGA Version 4.0 (TAMURA et al., 2007), in welchem ein Alignment-Explorer implementiert ist. Das paarweise und multiple Alignment erfolgte unter Verwendung von CLUSTAL W (THOMPSON et al., 1994).
3.1.2.7.3 Analyse der untersuchten Genabschnitte
Die 1353 nt langen Sequenzen für das N-Gen wurden vom Alignment-Explorer als MEGA-Datei exportiert, um sie weiter im Data-Explorer des Programms MEGA© Version 4.0 zu verwenden. Die Programmoberfläche bietet verschiedene Möglichkeiten und Verfahren, die Sequenzdaten zu analysieren. Die Basenabfolgen für die NP- und GL-intergenetischen Bereiche wurden analog erfasst.
Charakterisierung der Genabschnitte
Das Alignment der Sequenzen wurde im Data-Explorer auf das Vorkommen variabler Nukleotidpositionen untersucht. Basierend auf ersten Ergebnissen wurden die Sequenzen in Gruppen eingeteilt. Anschließend wurden die durchschnittliche Distanz aller Sequenzen sowie die innerhalb einzelner Gruppen berechnet. Hierbei wurde die Distanz als p-Distanz (Verhältnis der Anzahl von Nukleotidunterschieden zur Zahl der untersuchten Nukleotide) als Maßstab gewählt (TAMURA et al., 2007).
Distanzberechnungen und Analyse der Aminosäuresequenz
Die Nukleotidsequenzen wurden durch das im Data-Explorer implementierte Programm zur Berechnung der paarweisen Distanzen eingelesen und miteinander verglichen. Die Ausgabe erfolgte in einer Abstandsmatrix, wobei als Kriterium die Anzahl der Nukleotidunterschiede gewertet wurde. Die als Textdatei ausgegebene Matrix wurde in das Tabellenkalkulationsprogramm Office-Excel (Microsoft©, Redmond, USA) exportiert. Die Daten zu den einzelnen Isolaten, wie Jahr der Isolierung, geographischer Ursprung, Labornummer, wurden mit den Daten aus den genetischen Analysen vervollständigt, um weitere Berechnungen durchzuführen.
Die Nukleotidsequenzdaten wurden im Data-Explorer in Aminosäuresequenzen umgeschrieben und auf das Auftreten von Aminosäureaustauschen untersucht.
Phylogenetische Analysen
Die phylogenetischen Analysen erfolgten unter Verwendung des im Programm MEGA© Version 4.0 implementierten Neighbour-Joining-Verfahrens (SAITOU und NEI, 1987) mit dem Substitutionsmodell für Nukleotide nach Jukes-Cantor (JUKES und CANTOR, 1969).
Zur Ermittlung von Konfidenzwerten wurde dieses mit einem Bootstrap-Verfahren gekoppelt, wobei 1000 Wiederholungen durchgeführt wurden. Die Ausgabe der Informationen erfolgte als phylogenetisches Baumdiagramm. Um Cluster zu identifizieren wurde der phylogenetische Baum kondensiert, das heißt, nur Abzweigungen mit Bootstrap-Werten über 50 % wurden als repräsentativ gewertet. Alle Isolate eines Astes wurden einem Cluster zugeordnet. Um Gruppen innerhalb des Data-Explorers zu bilden, wurde die Cluster-Einteilung benutzt.
3.1.2.8 Kartographische Darstellung
Die kartographische Darstellung der Daten zur Fledermaustollwut, zur Auswahl der sequenzierten Virusisolate sowie der entsprechend der phylogenetischen Analyse erhaltenen Cluster von Virusisolaten erfolgte mit Hilfe des Kartenexplorers (Version.1.41).
3.1.2.9 Abstandsberechnungen zwischen den Fundorten
Für jedes EBLV-Isolat wurden mit Hilfe des Kartenexplorers des Tierseuchen Nachrichtensystems (TSN) die Koordinaten für den geographischen Fundort im
Für jedes EBLV-Isolat wurden mit Hilfe des Kartenexplorers des Tierseuchen Nachrichtensystems (TSN) die Koordinaten für den geographischen Fundort im