Meis2 kann in der Augenanlage mit Pax6 interagieren

Meis2 interagiert also in der Anlage des optischen Tektums mit zwei Vertretern aus der Familie der Paired-Box Transkriptionsfaktoren, Pax7 und Pax3. Ein weiterer Vertreter aus dieser Familie ist Pax6. Pax6 wird im anterioren Bereich des sich entwickelnden zentralen Nervensystems stark im gesamten Dienzephalon und im Großteil des Telenzephalons exprimiert. Ein weiterer Bereich starker Pax6-Expression sind die Anlagen der Retinae und der Linsen (siehe Abb. 21A). Im anterioren Bereich des Neuralrohrs gibt es, neben dem Mesenzephalon, eine weitere starke Domäne der Meis2-Expression. Diese ist zunächst in den optischen Vesikeln des Embryos zu erkennen und ein wenig später in der Entwicklung ebenfalls in den Anlagen der Retinae und der Linsen (siehe Abb. 9). In der embryonalen Retina und Linse weisen also Meis2 und Pax6 ein ähnliches Muster auf. Immun-fluoreszenzfärbungen an Hühnchenembryos des Embryonaltags E 1,5 bestätigten zudem eine Ko-Lokalisation der Proteine Meis2 und Pax6 in Zellen der optischen Vesikel (Heine

et al., 2008). Meis2 reguliert die Expression von Pax6 in den Anlagen der neuralen Retina, der Linse und im Pankreas (Zhang et al., 2002; Zhang et al., 2006; Heine et al., 2008). Es ist ebenfalls bekannt, dass Pax6 seine eigene Expression regulieren kann. Analysen des „α-Enhancers“, eines retinaspezifischen regulatorischen Elements des Pax6-Gens, wiesen mehrere Konsensus-Bindestellen für Meis-Proteine auf. Mit Hilfe von Reporteranalysen konnte gezeigt werden, dass Meis1 oder Meis2 die Aktivität des α−Enhancer-Reporter-konstruktes stimulieren können. Die Ko-Expression von Meis1 oder Meis2 zusammen mit Pax6 konnte zudem eine Steigerung der Aktivität des Reporterkonstruktes bewirken (Heine et al., 2008). Daher besteht die Möglichkeit, dass Meis2 in der Augenanlage des Hühnchens ein Ko-Faktor von Pax6 ist.

Um dies zu testen, wurden GST-PD-Experimente mit Zelllysaten von HH 14 – 18 Augen-anlagen unter Verwendung des GST-Volllängenkonstruktes durchgeführt. Meis2-GST führte zu einer starken Präzipitation von Pax6 aus den Zelllysaten. In Kontroll-experimenten mit den Glutathion-Sepharose-Kügelchen alleine oder dem GST-Protein alleine kam es hingegen nicht zu einer Präzipitation von Pax6 (Abb. 36A). Diese Experi-mente zeigen, dass Meis2 in den Augenanlagen von HH 14 – 18 Hühnchen mit Pax6 interagieren kann.

Die Immundetektion von Pax6 zeigte eine Bande bei 48 kDa, was der erwarteten Größe des Vollängen-Pax6 Proteins entspricht. Die Elution der Proteine erfolgte in diesem Fall in mehreren Schritten. Zunächst wurden die gewaschenen Kügelchen nach dem Experiment zweimal mit Glutathion-Elutionspuffer inkubiert (Abb. 36, E1 und E2). Schließlich erfolgte eine Elution mit Hilfe von 1x SDS-Probenpuffer (Abb. 36, E3). Bemerkenswert ist, dass sowohl in den Zelllysaten als auch in den Eluaten der PD-Experimente unter Verwendung dieses Pax6-Antikörpers stets 3 – 4 weitere starke Banden detektiert wurden.

Diese liefen im Tris-Glyzin Gelsystem auf einer Höhe von ungefähr 38 kDa, 35 kDa und 33 kDa. Alle drei Banden waren in den ersten beiden Elutionsschritten des PD-Experimentes dominanter als die Bande bei 48 kDa. Im letzten Elutionsschritt konnte zusätzlich eine vierte Bande bei ca. 42 kDa detektiert werden, die jedoch zuvor, zumindest bei gegebener Belichtungszeit des Films, in den Zelllysaten nicht sichtbar war.

Als zusätzliche Kontrolle wurde der Pax6-Antikörper von der Membran entfernt und es wurde eine Immundetektion zum Nachweis von α-Tubulin, eines ausschließlich zytoplas-matischen Proteins, durchgeführt. Diese Färbung zeigte zwar ein massives Vorhandensein von α-Tubulin in den eingesetzten Zelllysaten. Es kam jedoch nicht zu einer Präzipitation

von α-Tubulin durch das Meis2-GST-Protein, wie in den verschiedenen Eluaten des Experimentes zu sehen ist.

Abbildung 36: Meis2 kann in Augenanlagen des Hühnchens mit Pax6 interagieren. (A) PD-Experimente zeigen eine Interaktion von Pax6 mit dem Meis2-GST Volllängenprotein nicht aber mit GST alleine. Das Protein α-Tubulin wird nicht mit Meis2-GST präzipitert. (B) Pax6 wird stark mit der Deletionsvariante Meis2∆N-GST präzipitiert. (C) PD Experimente mit radioaktiv markiertem in vitro translatiertem Volllängen Pax6 Protein mit Meis2-GST oder GST alleine und in Anwesenheit von DNaseI. SK: Sepharose-Kügelchen alleine nach Inkubation mit dem Lysat; In: eingesetztes Zelllysat; Üb: Überstand nach dem Experiment; WB:

Western Blot; E1-E3: Elutionsschritte 1-3.

Die Untersuchung mit dem Meis2-GST-Deletionskonstrukt Meis2∆N-GST ergab, dass die Interaktion mit Pax6 weiterhin stattfindet, wenn die N-terminale Peptidsequenz 1-190 des Meis2-Proteins fehlt. Die Interaktion schien im gleichen Ausmaß wie mit dem Volllängen-Meis2-GST Konstrukt stattgefunden zu haben (Abb. 36B). Folglich scheint diese Interaktion ausschließlich über die Homeodomäne von Meis2 vermittelt zu werden.

In weiterführenden Experimenten konnte auch eine starke Präzipitation von radioaktiv markiertem, in vitro hergestelltem Pax6-Protein nach Experimenten mit dem Meis2-GST beobachtet werden (Abb. 36C). Es ist davon auszugehen, dass sich in der Lösung mit dem in vitro hergestellten Pax6-Protein keine weiteren Proteine der Augenanlagen befinden, somit ist die Interaktion von Meis2 mit Pax6 vermutlich direkt. Hier kam es ebenfalls nicht zu einer Präzipitation von Pax6 bei Inkubation der Proteine mit den Sepharose-Kügelchen alleine oder dem GST-Protein alleine (Abb. 36C). Das radioaktiv markierte Volllängen

Pax6 präzipitierte auch mit Meis2-GST nach einer Behandlung des Lysats mit DNAseI. Da die Interaktion also auch in Abwesenheit von DNA stattfinden kann, ist davon auszugehen, dass die Interaktion von Meis2 und Pax6 DNA-unabhängig ist (Abb. 36C, rechts).