3.1 In vitro-Experimente 3.1.1 Gewebeasservierung
Längliche Exzidate aus dem medianen Bereich des Ureters und Segmente der A. renalis wurden unter Beachtung der Regulatorien der lokalen Ethik-Kommission der Medizinischen Hochschule Hannover im Rahmen von Tumornephrektomien von insgesamt 15 Patienten im Alter von 30 bis 80 Jahren entnommen, vaskuläres Gewebe der A. coronaria und A. pulmonalis im Rahmen von Transplantationen aus explantierten Organen präpariert. Die Gewebeexzidate wurden so-fort nach der Entnahme in eine eisgekühlte organprotektive Lösung (CUSTODIOL
®
, HTK-Lösung nach Bretschneider zur Kardioplegie und Multiorganprotektion, Dr. Franz Köhler Chemie GmbH, Alsbach) verbracht und zur weiteren Präparation in das Labor transportiert.3.1.2 Funktionelle Organbad-Studien
Nach sorgfältiger Entfernung von Fett- und Bindegewebsanteilen wurden etwa 2 mm - 3 mm starke, zirkuläre Segmente präpariert und unter Standardbedingungen in den Meßkammern eines Organbad-Systems (MAYFLOWER Organbad, Hugo Sachs Elektronik GmbH, March) fixiert.
Die Badkammern (Füllvolumen 10 ml) waren mit einer modifizierten KREBS-RINGER-Lösung gefüllt (NaCl 128 mM, NaHCO3 15 mM, KCl 4.6 mM, CaCl2 2.5 mM, NaH2PO4 1.2 mM, MgCl2 1.2 mM, Glucose 22 mM, 2Na+ (Ca2+) EDTA 0.1 mM, pH 7.2 - 7.4), die auf 37°C temperiert war und kontinuierlich mit einem Gemisch aus 95% O2 und 5% CO2 (Carbogen) begast wurde.
In einer intialen experimentellen Sequenz wurden zunächst die kontraktilen Effekte aufsteigender Konzentrationen von KCl (10 mM - 120 mM) sowie des alpha1-Adrenozeptoragonisten Norepinephrin (NE), Muskarinrezeptor-Agonisten Acetylcholin und Thromboxan A2-Analogons U46619 (0.1 nM - 100 µM) auf die Ringpräparate bei basaler Spannung untersucht. Dem Anlegen einer passiven Vorspannung von 10 mN (1 gr.) folgte eine Äquillibrierungsphase von 60 min. Anschließend wurde die kontraktile Aktivität der Uretermuskulatur durch KCl (80 mM) stimuliert. Nach dem Erreichen einer stabilen tonischen Kontraktion wurden die K+-Kanalöffner Levcromakalim, Rimakalim (HOE 234) und S 0121 in kumulativer Dosierung (0.01 µM - 10 µM) zugegeben. Mechanische Spannungsänderungen der Muskulatur wurden mit Kraftaufnehmern (HSE F30 Force Transducer, Hugo Sachs Elektronik GmbH, March) registriert, mit Verstärkereinheiten amplifiziert (DBA DC Bridge Amplifier Type 66, Hugo Sachs Elektronik GmbH) und mit einem Analogschreiber (Graphtec Linearcorder Mark 8, Graphtec Corp., Tokio, Japan) aufgezeichnet. In den Organbad-Experimenten mit isolierter glatter Muskulatur des Ureters fanden der Adenylatzyklase-Aktivator Forskolin und Nitrovasodilator (NO-Donor) Natriumnitroprussid (NNP) als Referenzsubstanzen Verwendung (0.01 µM - 100 µM). Zirkuläre Präparationen vaskulärer glatter Muskulatur der A. coronaria,
Material & Methoden
A. pulmonalis und A. renalis wurden analog zu den Uretersegmenten in den Badkammern fixiert.
Vor dem Beginn der Äquillibrierung wurde eine Vorspannung von 5 mN (0.5 gr.) angelegt, die Kontraktilität später durch die Zugabe des alpha1-Agonisten Norepinephrin (1 µM) induziert.
Stammlösungen (10 mM) der verwendeten Testsubstanzen wurden mit Polyethylenglykol (Levcromakalim, HOE 234, S 0121), Dimethylsulfoxid (Forskolin) oder 0.9%iger NaCl-Lösung (NNP) hergestellt und mit isotonischer NaCl-Lösung zum weiteren Gebrauch verdünnt. In den Organbad-Experimenten war die Konzentration der nichtwässrigen Lösungsmittel < 1%.
Abb. 4: Detaildarstellung einer Einheit des horizontalen MAYFLOWER Organbad-Systems (Hugo Sachs Elektronik GmbH, March) : Abgebildet ist eine Badkammer mit Oxygenierungsfritte, Komponenten des die Pufferlösung zu-führenden und ableitenden Umlaufsystems sowie ein Kraftaufnehmer des Typs HSE F30 mit Feintrieb (Mikrome-terschraube).
3.1.3 Auswertung der In vitro-Experimente
Die Organbad-Experimente wurden an n = 6 - 8 Uretersegmenten durchgeführt, die von minde-stens zwei (2) verschiedenen Patienten stammten. Alle Daten sind als Mittelwerte (MW) ± des Standardfehlers (SEM) vom Mittelwert angegeben. Dargestellt ist die um Lösungsmittel-Effekte korrigierte Reversion (%) der tonischen Kontraktion nach Substanzzugabe, bezogen auf die maxi-male KCl-induzierte Tension (100%). EC50-Werte (Substanzkonzentration, die zu einer 50%igen Reversion der maximalen, KCl-induzierten Kontraktion führte) wurden graphisch nach nicht-line-arer Regression bestimmt.
3.2 In vivo-Experimente
3.2.1 Effekte von K+-Kanalöffnern auf die peristaltische Aktivität des Kaninchen-Ureters
Die Tierexperimente erfolgten auf der Grundlage der allgemeinen und ethischen Vorschriften des Zentralen Tierlabors der Medizinischen Hochschule Hannover. In den In vivo -Experimente wurden 12 männliche Chinchilla-Kaninchen (Körpergewicht 3 kg bis 5 kg, mittleres Alter 10 Monate) ver-wendet. Nach der intramuskulären Gabe einer Einzeldosis Ketamin (25 - 30 mg/kg KW) wurden die Tiere in Rückenlage auf einem Temperatur-konstanten Kleintier-Operationstisch (Hugo Sachs Elektronik GmbH, March) positioniert und das Körperfell im Bereich des Abdomens mit einem Haarschneider (Moser GmbH, Unterkirnach) entfernt. Über eine Ohrvene erfolgte die kontinuierli-che Infusion physiologiskontinuierli-cher Saline (10 ml/kg KW/Std.), die mit 5% (w/w) Glucose supplementiert war. Einer Trachotomie folgte die Insertion und Fixierung eines trachealen Tubus, der mit einem Anästhesie-Respirator (Modell Tiberius 19, Dräger AG, Lübeck) verbunden war. Eine gleichmäßige und tiefe Anästhesie der Tiere wurde durch die Einleitung von N2O und O2 und der intravenösen Gabe einer Minimaldosis Phenobarbital (2 mg/kg KG, alle 30 min.) gewährleistet (51). Nach medi-aner Laparotomie wurden die Ureteren beidseits des Infundibulums präpariert und eine 22G Kanüle nach distal eingebracht, die Anschluß an einen 3-Wege Stop-Cock hatte. Dieses Ventil war in alle Richtungen durchgängig, um eine synchrone Perfusion der Ureteren und die Messung physikalis-cher Parameter der Ureterfunktion zu ermöglichen. Zur Vermeidung von Druckartefakten wurde die Blase inzidiert und der Inhalt suprapubisch abgeleitet. Frequenz, Tonus und Amplitude der Uretermotorik wurden mit Druckaufnehmern (Statham Transducer P23 XL, Hugo Sachs Elektronik GmbH, March) registriert, die Signale amplifiziert (DBA DC Bridge Amplifier, Type 660, Hugo Sachs Elektronik GmbH, March) und mit einem Analogschreiber (Linearcorder WR 3310, Graphtec Corp., Tokio, Japan) aufgezeichnet. Der systemische Blutdruck der Tiere wurde über einen in die A. femo-ralis eingebrachten Katheter gemessen. Nach einer Stabilisierungsphase von 40 min. erhielten die Tiere zunächst 1 ml physiologischer NaCl-Lösung, die in den Experimenten als Placebo-Kontrolle diente. Nach der Infusion wurden die Blutdruck- und Ureterparameter für 10 min aufgezeichnet.
Im Rahmen der Experimente wurde 3 Tieren Levcromakalim in einer Dosierung von 10 µg/kg KG i.v. gegeben, dieser Applikation folgte nach etwa 30 - 40 min eine weitere Substanzgabe (20 µg/
kg KG). 3 Tiere erhielten zunächst 6 µg/kg KG HOE 234, anschließend, ebenfalls nach 30 - 40 min., 12 µg/kg KG der Verbindung. S 0121 wurde weiteren 4 Kaninchen in Dosierungen von 20 µg/kg KG und 60 µg/kg KG appliziert, zwei der Tiere bekamen nach der Normalisierung der Parameter der Ureterfunktion außerdem eine Einzeldosis des Spasmolytikums Scopolaminbutylbromid (BUSCOPAN®, 0.67 mg/kg KG).
Material & Methoden
Abb. 5: Schemazeichnung des In vivo - Tiermodells zur Erfassung der Effekte der systemischen Applikation von K+-Kanalöffnern auf die Parameter der Ureterdynamik und den Blutdruck. Unter synchroner Perfusion der bei-den Ureteren (Perfusiongeschwindigkeit 3 ml/h) erfolgte die Registrierung der Frequenz, der Amplitude und des intraluminalen Tonus mit Mikrotip-Sensoren, die mit einem Druckaufnehmer (Statham Transducer P23 XL) und einer Verstärkereinheit (DBA DC Bridge Amplifier) verbunden waren. Die Daten wurden mit einem Analogschreiber (Linearcorder WR 3310) aufgezeichnet. Der systemische Blutdruck der Tiere wurde über einen in die A. femoralis eingebrachten Katheter gemessen.
3.5 Auswertung der In vivo-Experimente
Da die pharmakologische Beeinflußung der Ureterdynamik (Peristaltik) zu Veränderungen (hier:
einer Inhibition) der peristaltischen Frequenz, der Amplitude der peristaltischen Welle und des Tonus des Ureters (intraureteraler Druck) führen kann, wurde jeder dieser Parameter in den Ex-perimenten registriert. Die nach der Applikation der K+-Kanalöffner aufgezeichneten ureterdy-namischen und vaskulären Effekte wurden mit denen verglichen, die nach der Gabe von Saline (Placebo) beobachtet worden waren. Alle Meßwerte sind als Mittelwerte (MW) ± Standardfehlers des MW (SEM) dargestellt. Die statistische Analyse erfolgte mit dem Programm StatWorks™
(Cricket Software Inc., Malvern, USA), zur Kalkulation wurde der Student’s t-Test verwendet. Ein p (Probability)-Wert von ≤ 0.05 wurde als statistisch signifikant akzeptiert.
3.6 Chemikalien
Levcromakalim (BRL 38227) war ein Geschenk der GlaxoSmithKline Pharmaceuticals plc (Brent-ford, Middlesex, England). Polyethylenglykol (PEG), HOE 234, S 0121 und der alpha1-Adreno-zeptor-Agonist Norepinephrin (ARTERENOL®) wurden von der Sanofi-Aventis Deutschland GmbH (Frankfurt am Main), Scopolaminbutylbromid (BUSCOPAN
®
) von der Boehringer-Ingelheim Pharma GmbH (Ingelheim am Rhein) und das Thromboxan A2-Analogon U46619 von der Bayer-Schering Pharma AG (Leverkusen/Berlin) überlassen. Forskolin, Natriumnitroprussid (NNP) und Acetylcholin stammten von der Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA). Ketamin (KETANEST®) wur-de von wur-der Pfizer-Parke Davis GmbH (Karlruhe), Phenobarbital (LUMINAL® Injektionslösung, 219 mg Phenobarbital/ml) von Desitin Arzneimittel GmbH (Hamburg), alle anderen verwendeten La-borchemikalien, soweit dies im Text nicht näher bezeichnet ist, entweder von der Merck KGaA (Darmstadt) oder Mallinckrodt-Baker BV (Deventer, Niederlande) bezogen.Ergebnisse