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3.1.1. Präparate für Messungen am µCT

Für die ersten Messungen, die der Optimierung der Bildqualität und Definition der am besten geeigneten Einstellungen des Mikro-Computertomographen dienten, wurden Präparate von zwei Katzenköpfen verwendet. Sie wurden mit so genannter Karnovsky-Lösung fixiert. Diese setzt sich aus Glutaraldehyd und Paraformaldehyd zusammen und führt nur zu sehr geringen Veränderungen der Zellen, also auch der Weichgewebe insgesamt (ANNIKO u. LUNDQUIST, 1977).

Bei den für die Herstellung der Präparate verwendeten Tieren handelte es sich um Katzen, die in der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo Hannover) aus unterschiedlichen Gründen euthanasiert werden mussten, aber keine Krankheiten im Bereich des Kopfes und insbesondere des Ohres aufwiesen.

Da die Katzen unterschiedlichen Alters und Geschlechts waren, variierten auch die Köpfe in ihrer Größe und Form.

Unmittelbar nach der Euthanasie (Pentobarbital; Narkodorm, Fa. cp pharma) wurden 5 ml Heparin mittels einer 5 ml-Spritze (Fa. Terumo) und einer aufgesetzten Kanüle in die Arteria (A.) carotis externa injiziert. Diese wurde per Hand nach kaudal gestaut.

Das Gelingen des Stauens zeigte ein in den Halsvenen sichtbarer Blutfluss an.

Zweck der Heparininjektion war, eine Thrombosierung in den Gefäßen vor allem des Kopfes zu verhindern und somit die nachfolgende gleichmäßige Durchtränkung des Gewebes mit der Fixationslösung zu gewährleisten.

Im anatomischen Institut der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover wurde zur Injektion der Lösung beidseitig am Hals die A. carotis communis freipräpariert und je eine Braunüle (Fa. Braun) fixiert. Anschließend erfolgte nacheinander die Applikation von je ca. 30 ml Karnovsky-Lösung mit einer 50 ml-Spritze (Fa. Terumo) und

ange-schlossenem Verlängerungsschlauch für Infusionen, wobei ein Reflux aus der Brau-nüle der jeweils anderen Seite beobachtet werden konnte. Die verwendete Menge der Lösung wurde nicht im Vorfeld festgelegt, sondern ergab sich aus Anzeichen ei-ner vollständigen Imbibition des Gewebes wie dem oben beschriebenen Reflux und dem Feuchtwerden der Maulschleimhaut.

Zusätzlich zu dieser Perfusionsfixierung wurde der Meatus acusticus externus jedes Ohres mit Hilfe einer 5 ml-Spritze (Fa. Terumo) mit ca. 5 ml der Fixationslösung ge-spült, um eine Fixierung des Trommelfells sicherzustellen.

Nach einer eintägigen Einwirkzeit wurden die Katzen dekapitiert. Die Köpfe wurden über 6 bzw. 4 Wochen bei 5 bis 8 °C gelagert und während dieser Zeit mehreren mikro-computertomographischen Scans unterzogen.

Für die µCT-Aufnahmen mit den optimierten Einstellungen, den Vergleich mit der klinischen CT und der Histologie wurde noch ein weiteres Katzenkopfpräparat herge-stellt. Auch dieses Tier musste aus Gründen euthanasiert werden, die nicht im Zu-sammenhang mit Krankheiten des Kopfes, insbesondere des Ohres, standen. Hier-bei wurde der Katze nach den Medikamenten für die Narkose (Propofol, Fa. Braun) Heparin injiziert und unmittelbar danach das Mittel zur Euthanasie (Pentobarbital;

Narkodorm, Fa. cp pharma). Die Katze wurde innerhalb von zwei Stunden für die Messungen zur Darstellung der Anatomie des Mittel- und Innenohrs (s. Kap. 3.3.3) und den Scan mit dem klinischen CT-Gerät verwendet. Erst anschließend wurde wie für die anderen Präparate beschrieben verfahren und die histologischen Schnitte des Ohrs hergestellt (s. Kap. 3.1.2).

3.1.2. Herstellung der histologischen Präparate

Für den Vergleich mit den µCT-Bildern wurden von den Ohren der gescannten Katze histologische Schnitte angefertigt. Unmittelbar nach Abschluss der Messung im klini-schen und im µCT erfolgte dafür zunächst eine Perfusionsfixierung (s. Kap. 3.1.1).

Anschließend wurde bei dem Kopf der Unterkiefer exartikuliert und entfernt. Das am Kopf befindliche Weichgewebe wurde so weit wie möglich mit einem Messer abge-löst. Danach wurde der Kopf mit Hilfe einer wassergekühlten Bandsäge (Typ MBS 220/E, Fa. Proxxon) in der Medianen geteilt. Nach Entfernung des Gehirns konnten

unter Orientierung am Felsenbein, der Bulla tympanica und dem Jochbogen weitere Sägeschnitte vorgenommen werden, bis von jeder Seite ein das Mittel- und Innenohr beherbergender Block vorlag. Die beiden Blöcke wurden dann zur Fixierung über 30 Stunden in Karnovsky-Lösung eingelegt. Um die vollständige Fixierung auch der Ge-hörknöchelchen und des Trommelfells zu gewährleisten, wurde mit einer Kanüle (Fa.

Terumo) vorsichtig ein Loch in jede Paukenhöhle präpariert, eine Spritze (Fa. Teru-mo) aufgesetzt und die Paukenhöhlen mit Karnovsky-Lösung gefüllt. Im Anschluss an die Fixierung wurden die Blöcke über Nacht gewässert.

Für den darauf folgenden Entkalkungsprozess der Ohrpräparate wurden diese sepa-rat in Gläsern (20 ml) mit Schraubverschluss in 25%ige Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, Fa. Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, Seelze) eingelegt. Eine Lage-rung im Brutschrank bei 37 °C beschleunigte die Entkalkung, die nach ca. vier Wo-chen abgeschlossen war. Die EDTA-Lösung wurde alle vier bis fünf Tage gewech-selt. Im Verlauf der Entkalkung wurden die Blöcke mehrfach vorsichtig mit einer Skalpellklinge (Fa. Feather) angeschnitten, um den Fortschritt festzustellen. Nach Ablauf der vier Wochen wurde die vollständige Dekalzifizierung durch eine Röntgen-aufnahme jedes Blocks überprüft (kleiner Fokus, 40 kV, 25 mAs). So konnte ausge-schlossen werden, dass noch kleine kalkhaltige Bezirke vorhanden waren.

Im Anschluss wurden die Blöcke erneut gewässert und mit einer Skalpellklinge weiter verkleinert, so dass ausreichend kleine Präparate entstanden, die in die Formen zur Technoviteinbettung hineinpassten.

Beim Bearbeiten der Präparate wurde darauf geachtet, dass keine Strukturen des Mittel- oder Innenohrs zerstört werden.

Es folgte die Dehydrierung mittels einer aufsteigenden Alkoholreihe von 20%iger in zwanziger Schritten bis zu 100%iger Alkoholkonzentration. Schließlich wurden die Ohrpräparate in Technovit (Fa. Heraeus Kulzer, Wehrheim) eingebettet.

In Vorversuchen wurde die Technik ermittelt, die am besten zur Herstellung der histo-logischen Schnitte geeignet ist. Hierfür wurden probeweise Präparate aus den Mittel- und Innenohren der beiden Katzenköpfe angefertigt, die zuvor für die Messungen zur Optimierung der Scanparameter verwendet wurden. Als erstes erfolgte eine Einbet-tung in Paraffin. Es zeigte sich, dass dieses Medium ungeeignet ist, da die Schnitte

vor allem im Bereich des Felsenbeins dazu neigen, einzureißen. Eine Einbettung in Technovit war erfolgreich. Zwar muss darauf geachtet werden, dass der Flächenin-halt der Schnittfläche nicht zu groß ist, da das motorbetriebene Mikrotom sonst beim Schneiden Artefakte verursacht. Aber es kommt nicht zum Zerreißen der Schnitte wie bei Paraffineinbettung. Ein weiterer Vorteil des Technovits ist, dass nur äußerst ge-ringe Schrumpfungsartefakte auftreten (HANSTEDE u. GERRITS, 1983).

Bei der Einbettung der Präparate wurde versucht, ihre Position der Lage während der µCT-Messung anzupassen. So sollte gewährleistet sein, dass die histologischen Präparate einen ähnlichen Schnittverlauf wie die Scanebene auf den µCT-Bildern hatten. Der Ablauf der Technoviteinbettung ist Tabelle 1 zu entnehmen.

Tab. 1: Ablauf der Technoviteinbettung (GERRITS u. SMID, 1983).

Arbeitsschritt Zeitdauer Plastikförm-chen mit Technovit 3040 (im Verhältnis Pulver : Flüssigkeit wie 3:1)

Von jedem Technovitblock wurden nach dem Durchtrocknen und Aufblocken auf die Plastikförmchen mit einem Autocut-Mikrotom (Fa. Jung, Heidelberg) ca. 2 µm dicke Gewebeschnitte angefertigt.

Es wurden jeweils die Schnitte 2, 4, 6, 8 verwendet und Schnitt 9 bis 11 verworfen, 12, 14, 16, 18 verwendet, 19 bis 21 verworfen usw.. Die ausgewählten Schnitte wur-den im warmen Wasserbad gestreckt, zu zweit auf einen Objektträger aufgezogen und auf einer Wärmeplatte bei 90 °C auf den Objektträgern fixiert. Beim Aufziehen wurden die Schnitte entsprechend Tabelle 2 auf die Objektträger verteilt und jeder zweite Objektträger weiter verwendet. Die restlichen Objektträger wurden als Reser-ve, z. B. für Spezialfärbungen, aufbewahrt. Insgesamt entstanden auf diese Art und Weise 2149 Objektträger, von denen 1074 angefärbt wurden.

Tab. 2: Bestückung der Objektträger und ihre Verwendung.

Die histologischen Schnitte wurden schließlich noch nach Standardmethoden mit Toluidinblau angefärbt (Tab. 3).

Tab. 3: Protokoll der Toluidinblau-Färbung (nach BÖCK, 1989) für Technovitschnitte.

Arbeitsschritt Zeitdauer

Toluidinblaulsg. O-gebrauchsfertig¹ 1 min.

Spülen mit Aqua bidestillata 1 (Aq. bidest.) 2 min.

Lufttrocknen lassen ca. 5 min.

Eindecken mit DePeX^® (Fa. Serva, Heidel-berg)

1 Toluidinblau-Gebrauchslösung: 1 g Toluidinblau O, 1 g di-Natriumtetraborat-10-hydrat, 0,2 g Para-formaldehyd (Fa. Serva, Deisenhofen), ad 100 ml Aq. bidest