2 LITERATURÜBERSICHT
2.9 Mikroorganismen in Fisch
2.9.8 Listeria monocytogenes
Listeria spp. kommen ubiquitär vor und können sich auch bei Kühlschrank-temperaturen vermehren. Listeria monocytogenes weist die größte humanpathogene Bedeutung auf (EFSA 2010b; RKI 2010a). Zudem ist ein Einsatz als Hygiene-indikator möglich (JEMMI u. STEPHAN 2006).
Wie Abbildung 8 veranschaulicht, verlief die Isolation von L. monocytogenes aus frischem bzw. rohem Fisch und Meeresfrüchten, teilweise aus Aquakultur, oftmals negativ (PULLELA et al. 1998; GONZALEZ et al. 1999; JELODAR u. SAFARI 2006;
LATORRE et al. 2007; KAMDEM et al. 2008; SALLAM 2008; MINAMI et al. 2010;
TOPIC POPOVIC et al. 2010; PANEBIANCO et al. 2011). Andere Untersuchungen bestätigten Listeria spp., jedoch nicht L. monocytogenes (PAPADOPOULOU et al.
2007; HUDECOVA et al. 2010; STONSAOVAPAK u. BOONYARATANAKORNKIT 2010). Dennoch wird in der Literatur von Listerien in Wassertieren häufig berichtet.
Manche Autoren beschrieben in frischem Fisch, teils gemeinsam mit Meeresfrüchten aufgeführt, niedrige Prävalenzen pathogener Listerien bis 3,0 % (ADESIYUN 1993;
IIDA et al. 1998; DAVIES et al. 2001; SOULTOS et al. 2007). Die Planproben-untersuchung 2009 in Deutschland ergab in 6,6 % der Fische, Meerestiere und Erzeugnisse positive Nachweise von L. monocytogenes, die höchsten
Belastungs-raten wiesen kaltgeräucherter/gebeizter Fisch (17,6 %), Fische/Zuschnitte (6,9 %) sowie Schalen-, Krusten- und ähnliche Tiere (6,1 %) auf, die niedrigste wurde mit 3,1 % für heiß geräucherten Fisch erhoben (HARTUNG u. KÄSBOHRER 2010). Wie CHEN et al. (2010) und AUTIO et al. (1999) schlussfolgerten, tritt die Kontamination mit L. monocytogenes vor allem durch die Verarbeitung auf. Das Rohmaterial scheint nicht die wichtigste Ursache zu sein, kann jedoch zu der initialen Belastung der Umgebung führen. So bestimmten GUDBJÖRNSDOTTIR et al. (2004) L. mono-cytogenes in 13,5 % der Rohstoffe für die Fischindustrie, 39 % der fertigen, rohen Produkte waren positiv. Letzteres deckte sich mit CHOU et al. (2006) und CRUZ et al. (2008), die Wachstum in 37,4 % von Filetproben bzw. 41 % von ausgenommenen Aquakulturlachsen – hauptsächlich als gefrorene Filets – feststellten. Dennoch war in Filets von kultivierten Fischen auch eine niedrigere Belastung von 12,5 % zu verzeichnen (PAO et al. 2008). Zudem erwiesen sich in Laborräumen filetierte Fische als L. monocytogenes-negativ (SALLAM 2008). Weitere hohe Prävalenzen ergaben rohe Garnelen mit 28,8 % (CORDANO u. ROCOURT 2001), frischer Fischrogen mit 18 % (MIETTINEN et al. 2003) sowie verschiedene Fische und Meeresfrüchte mit 17,2 % bzw. 12,1 % (Listeria spp.: 72,4% bzw. 44,4 %) (JEYASEKARAN et al. 1996).
In anderen Fischen waren die Belastungsraten etwas niedriger (bis 14,6 %) (HOFFMAN et al. 2003; HERRERA et al. 2006). Mehrere Autoren zeigten ein häufigeres Vorkommen von Listerien in Fischen als in Meeresfrüchten (ADESIYUN 1993; MENA et al. 2004; BUSANI et al. 2005; PARIHAR et al. 2008; HARTUNG 2009). So betrugen die Prävalenzen an L. monocytogenes in rohen bzw. frischen Fisch/Fischprodukten bei PARIHAR et al. (2008) 9,7 % (Listeria spp. in Fisch/Meeresfrüchten: 24 %) bei BUSANI et al. (2005) 6,4 % und bei MENA et al.
(2004) 12 %, während die untersuchten Meeresfrüchte, unter Berücksichtigung teils niedrigerer Probenanzahlen, keine pathogenen Listerien enthielten. Manche Ergebnisse zeigten Unterschiede im Vorkommen von Listerien bezüglich Tierart und/oder Herkunft (DAVIES et al. 2001; HOFFMAN et al. 2003). YÜCEL u. BALCI (2010) isolierten L. monocytogenes nur aus Haut und Kiemen von Süßwasser- und nicht von Seefischen.
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Abbildung 8: Prävalenzen von Listeria monocytogenes in frischem bzw. rohen Fisch und Meeresfrüchten
(1) (gefrorene) Filets; (2) Filets; (3) Fische (17,2 %), Meeresfrüchte (12,1 %);
(4) Rohmaterial (13,5 %), fertiges Produkt (39 %)
Gemäß den Literaturangaben sind auch in Sushi Listerien vorhanden (Abbildung 9).
Mit 11 % lag die Prävalenz an Listeria spp. für dieses zwischen ausgenommenen Fischen (9 %) und Fischfilets (28 %) (SUPPIN 2003). Einen positiven Nachweis von L. monocytogenes ergaben 12,7 % sehr unterschiedlicher Sushi-Proben (MILLARD u. ROCKLIFF 2003). Eine ähnlich hohe Prävalenz (10,2 %) wurde für Sushi ein-schließlich dem Ausgangsmaterial (JARK et al. 1999) sowie für verzehrfertiges Sushi im Verabeitungsbetrieb (7,0 %) nachgewiesen, auf Einzelhandelsebene zeigte es eine Belastungsrate von 2,0 % (EFSA 2010b). Weitere niedrige Kontaminationsraten bestätigten SCHULZ-SCHROEDER et al. (2003) mit 1,9 % in Sushi-Zubereitungen
sowie RESCH u. SCHWANK (2007) mit 3,4 % in Sushi-Proben, die positiven stammten aus einem Betrieb. In ähnlicher Größenordnung befanden sich die Ergeb-nisse einer groß angelegten Studie, in der für im Sommer untersuchte Sushi-Proben eine etwas höhere Prävalenz (3,2 %) an L. monocytogenes ermittelt wurde als im Winter (2,9 %) (NSW FOOD AUTHORITY 2008). Des Weiteren erfolgte die Bestäti-gung von drei Listeria-positiven Proben Tiefkühlsushi (2,4 %), während in frisch zubereitetem Sushi diese Bakterien in vier Proben (3,2 %) nachzuweisen waren, wovon drei Isolate als L. monocytogenes identifiziert wurden (ATANASSOVA et al.
2008). Demgegenüber erwiesen sich von 906 Sashimi- und 1020 Sushi-Proben lediglich 0,22 % des Sashimis als positiv (FEHD 2000). Auch weitere Nachweise von L. monocytogenes in Sushi ergaben ein negatives Resultat (TRIGO et al. 2007;
CHUNG et al. 2010; MIYA et al. 2010), während in anderen verzehrfertigen Produk-ten mit Thunfisch und Fischrogen Prävalenzen bis 12,1 % bestimmt werden konnProduk-ten (MIYA et al. 2010).
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MILLARD u. ROCKLIFF 2003 JARK et al. 1999
EFSA 2010a (1)
RESCH u. SCHWANK 2007 NSW FOOD AUTHORITY 2008
SCHULZ-SCHROEDER et al. 2003 FEHD 2000
TRIGO et al. 2007 CHUNG et al. 2010
MIYA et al. 2010
Abbildung 9: Prävalenzen von Listeria monocytogenes in Sushi (1) Verarbeitungsbetrieb (7,0 %), Einzelhandel (2,0 %)
2.9.9 Salmonella spp.
Salmonellen können unter vielerlei Umweltbedingungen, einschließlich in ausge-trocknetem Zustand, auch außerhalb lebender Wirte vorhanden sein (NORHANA et al. 2010). Das Genus umfasst zwei Spezies, Salmonella enterica mit sechs Subspezies und Salmonella bongori (GRIMONT u. WEILL 2007; RKI 2009). In der EU stehen hauptsächlich Salmonella Enteritidis und Salmonella Typhimurium mit menschlichen Erkrankungsfällen in Verbindung (EFSA 2010b).
Wie in Abbildung 10 graphisch dargestellt, verlief der Nachweis von Salmonella spp.
in zahlreichen Untersuchungen von frischem bzw. rohen Fisch und Fischfilets, auch aus Aquakultur, negativ (ADESIYUN 1993; BEN-GIGIREY et al. 1998; HERRERA et al. 2006; PAPADOPOULOU et al. 2007; BOARI et al. 2008; ERSOY et al. 2008;
JALALI et al. 2008; PAO et al. 2008; MIRANDA et al. 2009; ÖZOGUL et al. 2009; DA SILVA et al. 2010; HUDECOVA et al. 2010; TOPIC POPOVIC et al. 2010). Gleiches gilt für die untersuchten Meeresfrüchte (PEREIRA et al. 2006; PAPADOPOULOU et al. 2007; DI BELLA et al. 2010; TOPIC POPOVIC et al. 2010; PANEBIANCO et al.
2011). Salmonella-positive Proben wurden in Meeresfrüchten häufiger beschrieben als in Fisch. JEYASEKARAN u. AYYAPPAN (2002) bestätigten ein Vorhandensein in der Muskulatur von kultivierten Süßwassergarnelen. Weiteren Autoren gelangen vereinzelte Nachweise mit Prävalenzen bis 4,3 % in rohen Garnelen, manche stammten aus Aquakultur (MOHAMED HATHA et al. 2003; KOONSE et al. 2005;
ASAI et al. 2008). Höhere Belastungsraten mit Salmonellen bestimmten MITZSCHERLING u. KÜHNE (2008) mit 7,2 %, darunter Salmonella Weltevreden und S. Typhimurium, in tiefgekühlten, rohen oder blanchierten Aquakulturgarnelen, sowie UBEYRATNE et al. (2008), die zwischen den Prävalenzen von gefangenen und kultivierten rohen Garnelen (14,4 % bzw. 11,1 %) keinen statistisch signifikanten Unterschied ermittelten. Die meisten Isolate (50 %) wurden als Salmonella Newport und S. Weltevreden (8,7 %) identifiziert. Des Weiteren wiesen Muscheln in 10 % der Proben positive Befunde auf (SETTI et al. 2009). In Deutschland wurden Salmo-nellen in Fisch, Meerestieren und Erzeugnissen daraus im Rahmen der Planproben-untersuchungen mit einer Prävalenz von 0,08 % nur selten ermittelt. S. Enteritidis und S. Typhimurium wurden dabei nicht isoliert (HARTUNG u. KÄSBOHRER 2010).
Eine groß angelegte Untersuchung in Italien zum Vorkommen von S. enterica in Fisch und Meeresfrüchten ergab gleichfalls eine niedrige Belastung (0,5 %). Unter 55 identifizierten Serotypen waren 7x Salmonella Infantis, 6x S. Typhimurium und 3x S.
Enteritidis (BUSANI et al. 2005). HEINITZ et al. (2000) isolierten aus 6,9 % unter-suchter Fische und Meeresfrüchte Salmonellen, die einzelnen Prävalenzen betrugen in rohem Fisch 11,8 %, in rohen Krustentieren 8,3 %, in Krabben 3,7 % sowie in Schalentieren 3,2 %, wobei die Höhe nach Herkunft (USA oder Import in diese) variierte. S. Weltevreden und S. Senftenberg waren die häufigsten Serotypen in den importierten Fisch/Meeresfrüchte-Proben, während sich S. Enteritidis und S. Typhimurium auf Rang 5 und 12 befanden. Weitere hohe Belastungsraten mit Salmonella spp. von 33 % und 19 % zeigten vom Markt oder direkt aus dem Anlandungszentrum bezogene Fisch- und Garnelenproben aus tropischen Gewässern (SHABARINATH et al. 2007) sowie rohe Schalentiere mit 18 % (VAN et al. 2007). Ferner waren 42 % von 60 tiefgekühlten Fischfilets (PAL u. MARSHALL 2009) und 17 % bzw. 54 % von Sardinen- und sonstigen Fischproben aus Anlandungszentren mit Salmonellen kontaminiert (CHRISOLITE et al. 2006).
Des Weiteren ergaben Untersuchungen zum Vorkommen von Salmonella spp. in Sushi größtenteils negative Resultate (FEHD 2000; MILLARD u. ROCKLIFF 2003;
SCHULZ-SCHROEDER et al. 2003; SUPPIN 2003; RESCH u. SCHWANK 2007;
TRIGO et al. 2007; NSW FOOD AUTHORITY 2008; CHUNG et al. 2010). Ein weiteres verzehrfertiges Produkt aus Sushi-Zutaten (gefüllte Miesmuscheln) war frei von diesen Bakterien (BINGOL et al. 2008). Im Gegensatz dazu wurden Salmonella spp. in tiefgekühltem und frischem Sushi mit Prävalenzen von 2,4 % sowie 0,8 % bestätigt (ATANASSOVA et al. 2008). Aus Sashimi konnten KIM et al. (2008) keine Salmonellen isolieren, während sich in Hongkong eine einzige von 906 Sashimi-Proben als positiv erwies (FEHD 2000).
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Abbildung 10: Prävalenzen von Salmonella spp. in frischem bzw. rohen Fisch und Meeresfrüchten
(1) Prävalenzen für Fisch: 54 % und 17 %; (2) Filets; (3) Fisch (33 %), Garnelen (19 %);
(4) Garnelen: 14,4 % (gefischt), 11,1 % (kultiviert); (5) tiefgekühlte Garnelen (roh oder blanchiert); (6) nur S. enterica
3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN
3.1 Material und Methoden
3.1.1 Probenmaterial
Zur Bestimmung des Hygienestatus von frischem, verzehrfertigen Sushi wurden insgesamt 203 Sushi-Proben mikrobiologisch untersucht und ihre sensorische Qualität erfasst. Zusätzlich erfolgte von 29 Proben eine sensorische Untersuchung als einfach beschreibende Prüfung sowie in Anlehnung an die Prüfschemata der Deutschen Landwirtschafts-Gesellschaft (DLG).
Die Probennahme erfolgte im Sommer 2009 im norddeutschen Raum in drei Sushi-Bars in Hannover und Bremen. Gegenstand der Untersuchung war in den Restaurants frisch zubereitetes Sushi. Es wurden Sushi-Sets zum Mitnehmen („Take off“) gewählt, die ein Sortiment verschiedener Sushi-Arten sowie die traditio-nellen Gewürze enthielten. Somit repräsentieren die untersuchten Proben das Angebot in Sushi-Restaurants. Der Untersuchungsschwerpunkt lag auf traditionellem Nigiri-Sushi. Dieses war mit verschiedenen Spezies Fisch, Garnelen und Cephalo-poden sowie einer Muschel- und Kaviarart und Omelette belegt. Maki-Sushi wurde selten beprobt. Es war mit Gurken und Rettich gefüllt. Weiterhin enthielten die Sushi-Sets die Gewürze Sojasoße, japanischer Meerrettich (Wasabi) und Ingwer.
Der Nigiri-Belag und der Nigiri-Reis wurden separat untersucht. Während der Belag der verschiedenen Nigiri-Portionen einzelne Proben ergab, wurden die übrigen Bestandteile Reis sowie vorhandene Nori-Algen jeweils als Sammelproben für die einzelnen Sushi-Sets zusammengefasst. Des Weiteren erfolgte die mikrobiologische Untersuchung der zu den Mitnehm-Menüs gehörenden Gewürze.
Zur Untersuchung kamen insgesamt 127 Nigiri-Sushis, von denen 70 mit Fisch, 47 mit Meeresfrüchten und 10 mit japanischem Omelette belegt waren. Außerdem wurden 16 Reis-Sammelproben sowie 12 Algen-Sammelproben aus dem Nigiri-Sushi gebildet. Weiterhin wurden 4 Maki-Sushis und 44 Proben Gewürze untersucht.
Tabelle 7 gibt eine Übersicht über Probenart und -anzahl der mikrobiologisch unter-suchten Proben. Ein Sushi-Mitnehm-Menü ist in Abbildung 11 dargestellt.
Tabelle 7: Übersicht der mikrobiologisch untersuchten Sushi-Proben
Das zur Vermarktung frisch hergestellte Sushi wurde in den Sushi-Bars gekauft. Die Sushi-Bars B und C waren typische Gastronomiebetriebe: Während Sushi-Bar B ein im japanischen Stil gehaltenes Restaurant war, wurde Sushi-Bar C als typisches Kaiten-Sushi-Restaurant betrieben. Dabei wird das Sushi den Gästen auf einem Fließband angeboten. Hingegen befand sich Sushi-Bar A als offener Imbissbetrieb in einem Lebensmittelmarkt. Das frische Sushi war als Take-off-Menü verpackt und wurde in einer mit Kühlakkus ausgestatteten Kühlbox umgehend zum Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit der Tierärztlichen Hochschule Hannover transportiert und bis zur Untersuchung bei +2 °C gehalten. Die Proben wurden so schnell wie möglich bearbeitet.
Eine sensorische Untersuchung erfolgte für 29 Sushi-Proben. Wiederum wurden Nigiri-Belag und Reis getrennt beurteilt. Untersucht wurden je zwei Lachs- und Thun-fischproben aus den Restaurants A und B, drei Sammelproben Nigiri-Reis (2x A, 1x B) sowie je eine Garnelen-, Tintenfisch-, Algen-, Wasabi- und Ingwerprobe aus Betrieb A und B. Außerdem stammte aus Restaurant B je eine Probe Red Snapper, Süßgarnele, Muschel und Octopus, während aus Restaurant A zusätzlich je ein Flussaal- und Weißfischfilet, ein Omelette und eine Sojasoße untersucht wurden.
Von dem Lachs- und Thunfisch-Nigiri aus Sushi-Bar A wurde an zwei Tagen eine sensorische Untersuchung durchgeführt.
Abbildung 11: Beispiele für Nigiri-Sushi und Gewürze
1: Nigiri Garnele 2: Nigiri Tintenfisch 3: Nigiri Thunfisch 4: Nigiri Lachs 5: Nigiri Weißfisch 6: Ingwer 7: Wasabi 8: Sojasoße 9: Nigiri Omelette 10: Nigiri Flussaal 11: Nori-Alge
11
3.1.2 Probenvorbereitung
Die Probenvorbereitung wurde in Anlehnung an die amtliche Sammlung von Unter-suchungsverfahren nach § 64 LFGB durchgeführt. Herangezogen wurden die Methoden L 10.00-10 mit spezifischen Regeln für die Vorbereitung von Fisch und Fischerzeugnissen sowie – falls zutreffend (z.B. Maki-Sushi) – L 00.00-89 mit spezi-fischen Regeln für die Vorbereitung von anderen Erzeugnissen als Milch, Fleisch, Fisch und Erzeugnissen daraus. Diese Vorschriften regeln die Untersuchung von Lebensmitteln im Hinblick auf die Vorbereitung der Untersuchungsproben und die Herstellung von Verdünnungen für die mikrobiologische Untersuchung.
Nach der Messung des pH-Wertes und stichprobenartig der Temperatur wurden für die quantitative Bestimmung der mesophilen aeroben Gesamtkeimzahl sowie der Gehalte an Enterobacteriaceae, E. coli, Staphylokokken, Milchsäurebakterien und Pseudomonas spp. 10 g Probenmaterial zerkleinert in einen sterilen und mit der Labornummer beschrifteten Stomacherbeutel eingewogen und das Neunfache der Masse an Verdünnungsflüssigkeit (0,85 % NaCl + 0,1 % Pepton) zugegeben. Die Einwaage des Nigiri-Reises erfolgte als Sammelprobe für alle Nigiri-Stücke eines Mitnehm-Menüs. Gleiches galt für die mit dem Nigiri-Sushi kombinierten Algen. Beim Maki-Sushi wurde im Verhältnis ihrer Anteile aus allen Zutaten des Stückes die Erstverdünnung 1:10 hergestellt. Anschließend wurden die Proben im Stomacher für 120 Sekunden homogenisiert.
Rund 50 % der Proben wogen unter 10 g, weshalb bei diesen das gesamte Material in kleine Stücke zerschnitten und im Verhältnis 1:10 mit der Verdünnungsflüssigkeit eingewogen wurde. Folglich war die erneute Einwaage von Probenmaterial mit den Anreicherungsmedien für die qualitative Untersuchung auf die pathogenen Bakterien Salmonella spp. und Listeria monocytogenes nur für die Reis-Sammelproben möglich. Bei den übrigen Proben wurden 10 ml der Erstverdünnung in Stomacher-beutel für die qualitative Untersuchung überführt und mit den Nährmedien im Verhält-nis 1:10 vermischt. Lediglich bei den Nori-Algen-Sammelproben war es notwendig zuvor eine erneute Verdünnung mit dem Ausgangsmaterial und dem Pepton-salzwasser herzustellen. Die verwendeten Hilfsmittel für die destruktive Proben-aufbereitung und den Probentransport sind dem Anhang (Kap. 12.2) zu entnehmen.
3.1.3 Bakteriologische Untersuchung
Die bakteriologische Untersuchung basierte auf den Methoden der amtlichen Samm-lung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB bzw. auf international festge-legten ISO-Standards. Die gemäß 3.1.2 homogenisierte Probe diente als Erstver-dünnung und zur Erstellung einer dekadischen VerErstver-dünnungsreihe für die quantitative Bestimmung der aeroben mesophilen Gesamtkeimzahl sowie der Gehalte an Enterobacteriaceae, Milchsäurebakterien, Pseudomonas spp., Staphylococcus spp., koagulase-positiven Staphylokokken und E. coli.
Bei der qualitativen Untersuchung auf die pathogenen Bakterien Listeria monocy-togenes und Salmonella spp. fungierte das Homogenisat als Voranreicherungs-suspension. Die verwendeten Nährmedien und Nährböden sind im Anhang (Kap.
12.3) dargelegt.
3.1.3.1 Aerobe mesophile Gesamtkeimzahl
Die Bestimmung der aeroben mesophilen Gesamtkeimzahl erfolgte in Anlehnung an die Norm DIN EN ISO 4833:2003. Diese Norm beschreibt das Koloniezählverfahren bei 30 °C als ein horizontales Verfahren für die Zählung von Mikroorganismen in Lebensmitteln.
Zum Einsatz kam das Plattengussverfahren. Je 1 ml Homogenisat der Erstver-dünnung sowie jeder erstellten VerErstver-dünnungsstufe wurden im Doppelansatz in leere, sterile Petrischalen pipettiert und anschließend mit dem nicht selektiven, verflüssigten Nährboden Standard-I-Agar überschichtet und durchmischt. Die aerobe Bebrütung der beimpften Platten erfolgte für 72 h ± 3 h bei +30 °C ± 1 °C. Im Anschluss wurden die gewachsenen Kolonien gezählt und die Anzahl der kolonie-bildenden Einheiten je g Probe als gewichtetes arithmetisches Mittel mit der Formel nach FARMILOE berechnet:
n d n
c c ×
× +
= ×
∑
1 , 0
1 2
1
c= gewichteter arithmetischer Mittelwert, Anzahl der KbE/g
∑
c= Summe der KbE aller Platten, die zur Berechnung herangezogen werden (niedrigste und nächsthöhere auswertbare Verdünnungsstufe)1=
n Anzahl der Platten der niedrigsten auswertbaren Verdünnungsstufe, die zur Berechnung herangezogen werden
2=
n Anzahl der Platten der nächsthöheren Verdünnungsstufe d= Faktor der niedrigsten auswertbaren Verdünnungsstufe (n1)
Zum Zweck einer anschaulicheren Darstellung der Ergebnisse erfolgte die Logarith-mierung zur Basis 10 (Log10) der ermittelten Keimzahlen (KbE/g).
3.1.3.2 Enterobacteriaceae
Die Untersuchung basierte auf dem modifizierten Verfahren zum Nachweis und zur Zählung von Enterobacteriaceae in Lebensmitteln nach ISO 21528-2:2004. Aller-dings wurde anstatt des beschriebenen Plattengussverfahrens das Spatelverfahren als Referenzmethode zur Bestimmung der Anzahl vermehrungsfähiger Enterobacte-riaceae in Fleisch und Fleischerzeugnissen in Anlehnung an § 64 LFGB, L06.00-24 verwendet. Die Beimpfung des Selektivnährbodens Kristallviolett-Neutralrot-Galle-Glucose-Agar erfolgte im Doppelansatz mit je 0,1 ml der Erstverdünnung und der weiteren Verdünnungsstufen. Die ausgespatelten Agarplatten wurden anschließend für 48 h ± 2 h anaerob bei +30 °C ± 0,5 °C inkubiert. Aus der Anzahl der gewach-senen Kolonien konnte der Gehalt an Enterobacteriaceae je g als gewichtetes arithmetisches Mittel gemäß der Formel nach FARMILOE berechnet werden. Zu zählen sind rote Kolonien mit Präzipitationshöfen sowie gelegentlich vorkommende rosa Kolonien mit oder ohne Hof.
3.1.3.3 Aerob wachsende Milchsäurebakterien
Die ISO-Norm 15214:1998 (Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the enumeration of mesophilic lactid acid bacteria – Colony-count technique at 30 °C) fand modifiziert Anwendung. Der feste Selektivnährboden nach DE MAN, ROGOSA und SHARPE mit einem pH-Wert von 5,7 (MRS-Medium) wurde im Spatelverfahren beimpft. Dieser enthält neben einer reichhaltigen Nähr-grundlage weitere speziell von Laktobazillen als Wachstumsfaktoren benötigte Substanzen wie Polysorbat, Acetat, Magnesium und Mangan. Teilmengen von 0,1 ml der Erstverdünnung und der weiteren Verdünnungsstufen wurden im Doppelansatz auf die Agarplatten überführt, mit einem Spatel gleichmäßig verteilt und bei +30 °C ± 0,5 °C für 72 h ± 3 h aerob inkubiert. Anschließend wurden alle gut gewachsenen weißen oder grauweißen, flachen oder erhabenen, glatten oder rauen Kolonien als Milchsäurebakterien gezählt und aus dieser Zahl der Keimgehalt je g gemäß genannter Formel berechnet. Falls erforderlich konnten die Milchsäurebakterien aufgrund ihres biochemischen Verhaltens (Gramfärbung, Nativpräparat, Katalase-reaktion) gegen andere auf MRS-Agar wachsende Mikroorganismen abgegrenzt werden.
3.1.3.4 Pseudomonas spp.
Zur Bestimmung des Keimgehalts wurde das in der amtlichen Sammlung von Unter-suchungsverfahren nach § 64 LFGB, L06.00-43 für die Zählung von Pseudomonas spp. in Fleisch und Fleischerzeugnissen genannte Verfahren modifiziert angewendet.
Spezielle Normen für Fisch sind nicht verfügbar. Das verwendete Selektivmedium war ein Glutamat-Stärke-Phenolrot-Agar (GSP-Agar oder Pseudomonaden-Aeromo-naden-Selektivagar nach Kielwein), welcher dem Nachweis von Pseudomonas in allen Lebensmitteln dient. Die im Agar vorhandene Nährgrundlage aus Glutamat und Stärke kann von zahlreichen Bakterien der Begleitflora nicht verwertet werden;
zudem wird die Selektivität durch Zusatz von Penicillin verbessert. Pseudomonas spp. bauen Stärke nicht unter Säurebildung ab, während dieses Verhalten bei den Aeromonaden einen Farbumschlag des Phenolrots nach Gelb hervorruft. Als
Pseudomonaden sind die Kolonien anzusehen, die eine positive Oxidasereaktion und bei Beimpfung des Kligler-Agars nur auf der Oberfläche eine Entwicklung zeigen (aerobes Wachstum). Für jede Verdünnungsstufe wurden 0,1 ml der homogeni-sierten Probe im Doppelansatz auf die Platten aufgetragen, ausgespatelt und anschließend bei +25 °C ± 0,5 °C für 72 h aerob inkubiert. Anschließend wurden die gewachsenen blauvioletten Kolonien mit rotvioletter Umgebung gezählt. Zudem wurde stichprobenartig eine Oxidasereaktion oder eine Subkultivierung auf Standard-I-Agar durchgeführt und nach einer weiteren 24stündigen Inkubation das biochemische Verhalten (Oxidase, Katalase, Gramfärbung und teilweise Nativpräparat) untersucht.
Zusätzlich erfolgte die Bestimmung ausgewählter Kolonien mit dem standardisierten System api® 20 NE der Firma bioMérieux® „zur Identifizierung nicht anspruchsvoller, gramnegativer Stäbchen“ außer Enterobacteriaceae. Ein API-Kunststoff-Streifen enthielt 20 Mikroröhrchen, die mit dehydrierten Substraten versehen waren. Die acht konventionellen Tests wurden mit einer Keimsuspension rehydriert. Während der Inkubation gebildete Stoffwechselprodukte bewirkten das Auftreten von Farbum-schlägen (direkt oder durch Zugabe von Reagenzien). Hingegen wurden die 12 Assimilationsreaktionen mit einem Minimalmedium beimpft, wodurch Wachstum nur für Bakterien mit der Befähigung zur Substratverwertung möglich war. Die Inkubation erfolgte aerob für 24 h ± 2 h bei 30°C ± 0,5 °C. Anschließend erfolgte die Auswertung anhand eines mit einer Ablesetabelle gebildeten 7-stelligen numerischen Profils und einer Identifizierungssoftware.
Aus der Anzahl der als Pseudomonas spp. angesprochenen Bakterien war der Gehalt je g als gewichteter Mittelwert nach der FARMILOE’schen Formel zu berechnen.
3.1.3.5 Koagulase-positive Staphylokokken und Staphylococcus spp.
Die Untersuchung basierte auf den Grundlagen der amtlichen Sammlung von Unter-suchungsverfahren nach § 64 LFGB, L00.00-55 bezüglich der Zählung von koagulase-positiven Staphylokokken in Lebensmitteln und Futtermitteln. Diese sind als Mikroorganismen definiert, die auf der Oberfläche eines selektiven Nährmediums
typische und/oder atypische Kolonien bilden und eine positive Koagulase-Reaktion zeigen. Zur Anwendung kam der Staphylokokken-Selektivagar nach BAIRD-PARKER. Dieser Nährboden enthält zur Hemmung der Begleitflora Lithiumchlorid und Tellurit, während das vorhandene Pyruvat und Glycin selektiv wachstums-fördernd auf Staphylokokken wirkt. Die Reduktion des Tellurits zu Tellur bewirkt eine charakteristische Schwarzfärbung der Kolonien, während infolge einer Lipolyse und Proteolyse des in dem Nährboden vorhandenen Eigelbs eine Hof- und Ringbildung erscheint.
Im Doppelansatz erfolgte die Beimpfung der Agarplatten mit 0,1 ml der Ausgangs-verdünnung und jeder Verdünnungsstufe. Nach der gleichmäßigen Verteilung der aufgetragenen Teilmengen wurden die Platten für 48 h aerob bei +37 °C ± 0,5 °C inkubiert und nach 24 h ± 2 h und 48 h ± 2 h auf verdächtige Kolonien überprüft.
Nach der Inkubationszeit erfolgte die Zählung der gewachsenen Kolonien. Von jeder morphologisch identischen Gruppe wurde eine Kolonie auf Standard-I-Agar subkul-tiviert und für weitere 24 h ± 2 h bei +37 °C ± 0,5 °C aerob bebrütet. Anschließend erfolgte eine Überprüfung des biochemischen Verhaltens (Gramfärbung, Oxidase- und Katalasereaktion) sowie der DNAse-Aktivität der auf Standard-I-Agar
Nach der Inkubationszeit erfolgte die Zählung der gewachsenen Kolonien. Von jeder morphologisch identischen Gruppe wurde eine Kolonie auf Standard-I-Agar subkul-tiviert und für weitere 24 h ± 2 h bei +37 °C ± 0,5 °C aerob bebrütet. Anschließend erfolgte eine Überprüfung des biochemischen Verhaltens (Gramfärbung, Oxidase- und Katalasereaktion) sowie der DNAse-Aktivität der auf Standard-I-Agar